專利名稱：一種標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽及其真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記，特別涉及一種標(biāo)記細(xì)胞骨 架蛋白的多肽及真核表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
運(yùn)動(dòng)是生命體最顯著的特征之一。作為生命體組成單位的細(xì)胞，其多種多樣的生 理活動(dòng)都與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，比如細(xì)胞形態(tài)的改變與維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分 裂、胞吞與胞吐等。而存在于細(xì)胞(特別是真核細(xì)胞)中的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，不僅是支撐活細(xì) 胞的結(jié)構(gòu)，決定細(xì)胞的形狀，賦予其強(qiáng)度，而且是細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器空間排列的物質(zhì)基礎(chǔ)。 細(xì)胞骨架包括三種類型的蛋白質(zhì)纖維，即微絲(microfilament)、微管(Microtubule)和中 間纖維(intermediate filaments, IF)。微絲是由肌動(dòng)蛋白(actin)組成的直徑約為7nm的纖維結(jié)構(gòu)。肌動(dòng)蛋白又被稱 為G-Actin，全稱為球狀肌動(dòng)蛋白(Globular Actin)，簡(jiǎn)稱G肌動(dòng)蛋白。肌動(dòng)蛋白單體為球 形，其表面上有一 ATP結(jié)合位點(diǎn)。肌動(dòng)蛋白單體一個(gè)接一個(gè)連成一串肌動(dòng)蛋白鏈，兩串這 樣的肌動(dòng)蛋白鏈互相纏繞扭曲成一股微絲；這種肌動(dòng)蛋白多聚體又被稱為纖維形肌動(dòng)蛋白 (F-Actin, Fibrous Actin)。微絲能被組裝和去組裝當(dāng)單體上結(jié)合的是ATP時(shí)，就會(huì)有較 高的相互親和力，單體趨向于聚合成多聚體，就是組裝；而當(dāng)ATP水解成ADP后，單體親和力 就會(huì)下降，多聚體趨向解聚，于是去組裝。細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的這種組裝_去組裝動(dòng)態(tài)變化參與了細(xì)胞許多重要的生理過程， 比如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)偽足的生成、發(fā)育時(shí)期干細(xì)胞的遷移、神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)、細(xì)胞與細(xì) 胞外基質(zhì)的相互作用以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)中得到的有 毒的環(huán)狀七肽，它同細(xì)胞松弛素B的作用相反，只與聚合的微絲(F-Actin)結(jié)合，而不與肌 動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后，抑制了微絲的解體，因而破壞了微絲的聚合 和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽可以與聚合的微絲結(jié)合的特殊性質(zhì)使得它具有一個(gè)重要的用途通過讓 這種毒素與熒光物質(zhì)結(jié)合，然后FITC和Rhodamin等熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽再特異的與 真核細(xì)胞的F-actin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布，研究細(xì)胞內(nèi)部的工作機(jī)制。 生產(chǎn)這種熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的公司包括Invitrogen和Sigma公司，但是售價(jià)不菲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種相對(duì)廉價(jià)的、實(shí)時(shí)的標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白F-actin 的多肽及真核表達(dá)載體，該多肽轉(zhuǎn)入細(xì)胞或者通過真核表達(dá)載體在細(xì)胞得到表達(dá)后可以與 微絲結(jié)合，結(jié)合熒光標(biāo)記的多肽能夠用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽，該多肽為JN27，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所不。所述的多肽是在JN27的C端增加3個(gè)氨基酸殘基得到的多肽JN30，其氨基酸序列 如 SEQ. ID. NO. 2 所示。所述的多肽是在JN27的N端增加11個(gè)氨基酸殘基的穿膜肽得到的多肽TatJN27， 其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。一種用于細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體，該載體包含標(biāo)記基因EGFP和細(xì)胞 骨架蛋白靶向基因的融合基因，所述的細(xì)胞骨架蛋白靶向基因?yàn)榛騄N27或JN30;基因 JN27的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示，基因JN30的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示。所述的真核表達(dá)載體是pEGFP-C2-JN27，通過HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)將基因 JN27克隆到pEGFP-C2載體上。所述的真核表達(dá)載體是pEGFP-C2-JN30，通過HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)將基因 JN30克隆到pEGFP-C2載體上。多肽JN27、JN30或TatJN27應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。所述的應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記是將多肽JN27或JN30用熒光物質(zhì)標(biāo)記后，再 將熒光標(biāo)記的JN27或JN30加入到抗體封閉液中，與經(jīng)過固定、Triton處理的待標(biāo)記細(xì)胞 孵育2h，然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié)果；或者將多肽TatJN27用熒光物質(zhì)標(biāo)記后，再將熒光標(biāo)記的TatJN27直接加入待標(biāo) 記細(xì)胞的培養(yǎng)液中，37°C孵育12h ；然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié)果。真核表達(dá)載體PEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。所述的應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記是將真核表達(dá)載體pEGFP-C2-JN27或 PEGFP-C2-JN30轉(zhuǎn)染到待標(biāo)記的細(xì)胞中，使其得到表達(dá)后，然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié)合ο與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供能夠與微絲(F-actin)結(jié)合的多肽，該多肽能夠應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋 白的標(biāo)記，以代替價(jià)格昂貴的鬼筆環(huán)肽；所述的多肽包括JN27、JN30和TatJN27 ；對(duì)于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記包括人工合成的帶有熒光標(biāo)記的JN27或JN30多肽導(dǎo)入 固定的待標(biāo)記細(xì)胞的靜態(tài)指示，和將人工合成的帶有熒光標(biāo)記的TatJN27加入待標(biāo)記的細(xì) 胞培養(yǎng)液中的動(dòng)態(tài)指示。2、本發(fā)明提供的細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的多肽，其中多肽JN27和JN30是大鼠 Juxtanodin基因表達(dá)的JN分子C末端的27肽和30肽，這是在JN全長(zhǎng)分子與微絲結(jié)合的 基礎(chǔ)上，通過對(duì)JN及其同源分子的序列分析，確定結(jié)合微絲的關(guān)鍵位點(diǎn)；多肽TatJN27是在JN27的基礎(chǔ)上的進(jìn)行修飾在JN27的N端連接Tat序列中的 11個(gè)氨基酸殘基，使得修飾后的多肽能夠在穿膜肽的引導(dǎo)下進(jìn)入待標(biāo)記的細(xì)胞中；本發(fā)明以鬼筆環(huán)肽作為對(duì)照，證實(shí)了上述三個(gè)多肽能夠與微絲結(jié)合，熒光結(jié)果顯 示其所標(biāo)記的細(xì)胞骨架蛋白與鬼筆環(huán)肽共定位。3、為了實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的熒光標(biāo)記，需要在與微絲結(jié)合的靶向分子上結(jié)合熒 光物質(zhì)，以便在熒光顯微鏡下顯示；現(xiàn)有的熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽是通過化學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)熒光物質(zhì)與鬼筆環(huán)肽的標(biāo)記；而本發(fā)明提供的JN27、JN30和TatJN27多肽，可以通過在體外采用固相合成法合成純 度大于95%的多肽，然后用化學(xué)法對(duì)合成的多肽進(jìn)行熒光物質(zhì)的標(biāo)記，起到對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微 絲具有靶向熒光指示作用；所述的熒光物質(zhì)為熒光素花青素3 (Cy3)或者異硫氰酸熒光素 (FITC)；與鬼筆環(huán)肽從毒蕈類鬼筆鵝膏提取相比，本發(fā)明采用固相合成法合成靶向的多 肽，成本明顯降低。4、與鬼筆環(huán)肽標(biāo)記固定細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白相比，本發(fā)明提供的具有穿膜功能的 TatJN27多肽，直接加入到待標(biāo)記細(xì)胞的培養(yǎng)液中就可以對(duì)細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)活 細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記；進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活動(dòng)中的細(xì)胞骨架進(jìn)行連續(xù)的觀察。5、在提出具有微絲的靶向多肽的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供更進(jìn)一步的細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài) 標(biāo)記方案構(gòu)建綠色熒光蛋白與JN27多肽或JN30多肽的融合表達(dá)載體真核表達(dá)載體 PEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30，這樣實(shí)際相當(dāng)于將靶向多肽與綠色熒光蛋白進(jìn)行了融 合表達(dá)；將真核表達(dá)載體pEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30轉(zhuǎn)染待標(biāo)記的細(xì)胞，并使其得 到表達(dá)，該真核表達(dá)載體表達(dá)后得到的融合蛋白本身就是熒光標(biāo)記的靶向多肽；其靶向是 指向微絲的，這樣在熒光顯微鏡下就可以清楚的顯示綠色熒光蛋白標(biāo)記出的細(xì)胞骨架蛋 白；與熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白相比，真核表達(dá)載體的標(biāo)記方案其 操作步驟更加清晰，反應(yīng)條件更加溫和，能夠大大的降低細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的成本；而且載 體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達(dá)的整個(gè)過程工藝操作更加成熟，更有利于標(biāo)記的實(shí)現(xiàn)。6、與熒光標(biāo)記細(xì)胞骨架靶向分子相比，構(gòu)建的pEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30 真核表達(dá)載體是持續(xù)性的表達(dá)，只需要轉(zhuǎn)染一次就能夠用于觀察微絲的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)于細(xì) 胞內(nèi)的微絲具有動(dòng)態(tài)的指示作用；采用融合蛋白標(biāo)記由于是在真核表達(dá)載體水平的操作，以該表達(dá)載體為基礎(chǔ)上進(jìn) 行其他目的基因的進(jìn)一步表達(dá)或者標(biāo)記更加的方便、多樣；因此，利用真核表達(dá)載體進(jìn)行標(biāo)記具有更多的可操作性和開放性。


圖1是真核表達(dá)載體pEGFP-C2的多克隆位點(diǎn)分布示意圖；圖2是對(duì)陽(yáng)性的克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果圖；圖3A是對(duì)pEGFP-C2-JN27真核表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定的凝膠電泳結(jié)果圖；圖3B 是對(duì)pEGFP-C2-JN30真核表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定的凝膠電泳結(jié)果圖。 圖4是以鬼筆環(huán)肽作為對(duì)照，Cy3標(biāo)記的JN27、JN30多肽分別導(dǎo)入到細(xì)胞， pEGFP-C2-JN27、pEGFP-C2-JN30真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架標(biāo) 記的結(jié)果；圖5是FITC標(biāo)記的TatJN27多肽進(jìn)入細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架標(biāo)記的結(jié) 果圖。圖6是FITC標(biāo)記的TatJN27多肽進(jìn)入細(xì)胞后，在同一視野下，利用熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)記錄24h內(nèi)細(xì)胞骨架標(biāo)記的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供能夠與微絲(F-actin)結(jié)合，并應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記的多肽， 所述的多肽包括JN27、JN30和TatJN27 ；在多肽JN27或JN30上結(jié)合熒光物質(zhì)后對(duì)細(xì)胞內(nèi) 的微絲具有靜態(tài)指示作用；在多肽TatJN27結(jié)合熒光物質(zhì)后對(duì)活細(xì)胞的微絲具有靶向指示 作用，能夠觀察微絲的動(dòng)態(tài)變化；更進(jìn)一步，本發(fā)明構(gòu)建JN27、JN30多肽和綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體；將其轉(zhuǎn) 染到細(xì)胞中，能夠觀察微絲的動(dòng)態(tài)變化。下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、與F-actin結(jié)合多肽的篩選JN分子是大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)髓鞘形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的分子， 表達(dá)在成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和突起中。該分子的編碼基因是大鼠的Juxtanodin基 因，定位于3q21，全長(zhǎng)1805bp，編碼區(qū)位于153_998bp，編碼282個(gè)氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)過表 達(dá)可引起細(xì)胞形態(tài)改變。體外免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，JN分子可以和actin結(jié)合(Zhang B， Cao Q, Guo A, Chu H, Chan YG, Buschdorf JP, Low BC, Ling EA, Liang F. Juxtanodin An οligodendroglialprotein that promotes cellular arborization and 2 ', 3 ' -cyclic nucleotide-3 ' -phosphodiesterase trafficking. Proc Natl Acad Sci USA 102:11527-11532.)，免疫熒光結(jié)果顯示JN的同源分子與F-actin在細(xì)胞 內(nèi)存在共定位(Brockschnieder, H. Sabanay, D. Riethmacher, and Ε. Peles. Ermin, A Myelinating Oligodendrocyte-Specific Protein That Regulates Cell Morphology J. Neurosci. 200626 :757_762)。在研究JN的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，JN的C端含有一段保守序列，屬于ERM蛋白家族的保守 結(jié)構(gòu)基序；申請(qǐng)人對(duì)大鼠、小鼠與人類JN基因編碼區(qū)C端進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，大鼠、小 鼠與人類JN分子C端的序列分別如下所示大鼠:TPDEQLVLGKK⑶IARNSYSRYNTISYRKIRKGNTKQRIDEFESMMHL
小鼠TPDEQPVFGKKGDIARNS+^PJin^LRli
人類TPDEQPTLGKKSDISRNAY邵Υ1Π迓駔 巡明玨QPJ邸理發(fā)現(xiàn)在C末端自第253位起存在長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸殘基的高度保守的序列，結(jié)合 缺失了 C端序列后的JN突變體對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響變小，推測(cè)這一區(qū)域的保守肽序列是與 F-actin的關(guān)鍵位點(diǎn)。所以，本發(fā)明以第253位到279位的27個(gè)氨基酸殘基的多肽為結(jié)合微絲的靶向肽 JN27，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；并且，在JN27的N端增加Tat序列中的11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)建微絲靶向肽Tat JN27，增加的Tat序列為YGRKKRRQRRR ；在N端增加具有穿膜信號(hào)的Tat序列之后，直接將 熒光標(biāo)記的TatJN27加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，利用穿膜肽的可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞這一特 性，多肽TatJN27能夠被導(dǎo)入細(xì)胞中，實(shí)時(shí)反映細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化；Tat JN27的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；以第253位到282位的30個(gè)氨基酸殘基的多肽為結(jié)合微絲的靶向肽JN30，其氨基 酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。2、微絲靶向肽與熒光物質(zhì)的結(jié)合采用固相合成法人工合成JN27、JN30和TatJN27多肽，合成純度要求大于95%， 可以由商業(yè)的生物公司來合成，比如上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；并可由商業(yè)的公司(比如上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)采用化學(xué)法對(duì)合成的 多肽進(jìn)行熒光物質(zhì)標(biāo)記，熒光物質(zhì)具體為熒光素Cy3或FITC。3、JN27和JN30多肽與綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體的構(gòu)建3. 1編碼JN27和JN30多肽的核苷酸序列的克隆以JN全長(zhǎng)cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因JN27和JN30的目的片段，擴(kuò)增 JN27基因目的片段的引物對(duì)設(shè)計(jì)為P1、P2，擴(kuò)增JN30基因目的片段的引物對(duì)設(shè)計(jì)為P3、P4; 具體為Sense Pl :cccaagcttt attccagata caacacgat 29 ；Antisense P2 :cgggatcctc acattgactc aaactcat 28 ；Sense P3 :cccaagcttt attccagata caacacgat 29 ；Antisense P4 :cgggatccta agtgcatcat tgactcaa 28 ；其中，在上游引物Pl、P3引入HindIII酶切位點(diǎn)，在下游引物P2、P4引入BamHI酶 切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s、60°C退火30s、72°C延伸35s，共25 個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，然后切膠回收，純化PCR產(chǎn)物；對(duì)純化 的PCR產(chǎn)物用HindIII及BamHI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收帶有黏性末端的微 絲靶向多肽JN27和JN30的基因片段。3. 2JN27和JN30多肽與綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明具體以PEGFP-C2質(zhì)粒作為提供綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨架載體，其質(zhì)粒圖 譜如圖1所示；將pEGFP-C2質(zhì)粒同樣用HindIII及BamHI雙酶切后的線性載體，與收集的帶有 黏性末端的微絲靶向多肽的基因片段JN27和JN30進(jìn)行連接連接反應(yīng)體系共15μ 1，其 中多肽的基因片段11 μ L，用HindIII及BamHI雙酶切后的線性載體pEGFP_C2為2yL， 10XT4DNA ligase buffer 1. 5μ L, T4 DNA Iigase 為 0· 5 μ L，15°C過夜。將連接后的重組pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆 進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，以Ρ1+Ρ2引物為JN27驗(yàn)證的引物，以Ρ3+Ρ4引物為JN30驗(yàn)證的引 物；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖2所示Μ為DL2000分子量marker，泳道1為對(duì) PEGFP-C2-JN27重組體進(jìn)行菌落PCR的結(jié)果，泳道2為對(duì)pEGFP_C2-JN30重組體進(jìn)行菌落 PCR的結(jié)果；在IOObp處可見特異條帶。將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行HindIII及BamH I雙酶切鑒定， 結(jié)果如圖3所示圖3A中，泳道M為DL2000分子量marker，泳道1為pEGFP_C2_JN27經(jīng) HindIII及BamH I雙酶切，4. 7kb為載體骨架片段，箭頭所示條帶即為目的條帶JN27 ；圖3B 中泳道 M 為 DL2000 分子量 marker,泳道 1、2 為 pEGFP_C2_JN30 經(jīng) HindIII 及 BamH I 雙酶切，4. 7kb為載體骨架片段，箭頭所示條帶即為目的條帶JN30。對(duì)PCR鑒定有目的片段表達(dá)、并且酶切鑒定顯示克隆正確的陽(yáng)性克隆送上海生工 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明目的基因插入到了 PEGFP-C2載體預(yù)設(shè)的位點(diǎn)，而且核苷酸序列也正 確，其中插入目的片段的核苷酸序列具體為末端引入終止碼tga的JN27基因片段如SEQ. ID. NO. 4所示，末端引入終止碼tga的JN30基因片段如SEQ. ID. NO. 5所示；至此，融合表達(dá)載體構(gòu)建成功包含JN27基因的融合表達(dá)載體命名為 PEGFP-C2-JN27真核表達(dá)載體，包含JN30基因的融合表達(dá)載體命名為pEGFP_C2-JN30真核 表達(dá)載體。4、細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記4. 1. lCy3熒光標(biāo)記的多肽JN27和JN30導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記將U251細(xì)胞在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、50mL/L CO2條件 下培養(yǎng)；進(jìn)行細(xì)胞導(dǎo)入前l(fā)d，將U251細(xì)胞用2.5g/L胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸 液接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞密度調(diào)整為2. 5X105/L，每孔共ImL 培養(yǎng)液(含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，細(xì)胞密度達(dá)到80 %時(shí)，取出蓋玻片，依次用 PBS沖洗2次，40g/L多聚甲醛固定20min，PBS沖洗3次，0. 3% Triton χ-100作用lh, PBS 沖洗2次；將Cy3熒光標(biāo)記的JN27、JN30多肽分別加入抗體封閉液(4%山羊血清，0. 3% TritonX-100，0. 05%疊氮鈉，溶于PBS，pH 7.4)中，在不同細(xì)胞孔，與經(jīng)過Triton處理過的 細(xì)胞在37°C孵育2h，PBS沖洗3次，然后在同一樣品中加入FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Sigma， 5ug/ml)室溫作用2h，PBS沖洗3次，600mL/L甘油封片，在熒光顯微鏡下對(duì)同一個(gè)視野內(nèi)的 細(xì)胞觀察并照相。4. 1. 2Cy3熒光標(biāo)記的TatJN270多肽導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記以U251細(xì)胞為待標(biāo)記的細(xì)胞，當(dāng)U251細(xì)胞在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 中密度達(dá)到70% 80%時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記的TatJN27肽，37°C孵育12h ；在 Tat穿膜肽的引導(dǎo)下，TatJN270穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與F-actin結(jié)合，孵育完成后可以直 接在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞微絲的變化。4. 2pEGFP-C2-JN27、pEGFP_C2-JN30融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記將U251細(xì)胞在含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、50mL/L CO2條件 下培養(yǎng)；細(xì)胞進(jìn)行載體轉(zhuǎn)染前l(fā)d，將細(xì)胞用2. 5g/L胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于 預(yù)先置有蓋玻片的24孔板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞密度調(diào)整為2. 5X 105/L，每孔共ImL培養(yǎng)液(含 100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)；當(dāng)孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞密度達(dá)到70% 80%時(shí)，將載體按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì) 胞具體按Lipofectamine2000說明書進(jìn)行操作，將真核表達(dá)載體pEGFP_C2_JN27和 PEGFP-C2-JN30分別轉(zhuǎn)染不同孔板培養(yǎng)的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48h后，取出蓋玻片，將細(xì)胞依次用PBS沖洗2次，40g/L多聚甲醛固定20min， PBS沖洗3次后，用600mL/L甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或者于轉(zhuǎn)染后24h， 直接在熒光顯微鏡下觀察。
4. 3細(xì)胞骨架標(biāo)記結(jié)果的觀察在正置顯微鏡BX51 (OLYMPUS)觀察經(jīng)過40g/L多聚甲醛固定的細(xì)胞(觀察JN27、 JN30的標(biāo)記結(jié)果)，放大倍數(shù)為X 100 (油鏡)；倒置顯微鏡1X71 (OLYMPUS)觀察活細(xì)胞(觀 察TatJN270標(biāo)記，或者載體轉(zhuǎn)染標(biāo)記)，放大倍數(shù)為X 40 ；觀察上述3種導(dǎo)入的多肽或者表 達(dá)載體對(duì)細(xì)胞骨架的標(biāo)記情況由于Cy3標(biāo)記在568 574nm發(fā)射熒光，熒光顯微鏡下觀察呈鮮艷紅色熒光；FITC 在525nm發(fā)射熒光，熒光顯微鏡下觀察呈綠色熒光；標(biāo)記結(jié)果如圖4所示，導(dǎo)入Cy3標(biāo)記的JN30、JN27多肽的細(xì)胞，其細(xì)胞微絲的標(biāo)記 結(jié)果如圖A 導(dǎo)入Cy3標(biāo)記的JN30多肽的U251細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)紅色熒光 顯示的細(xì)絲；圖D為導(dǎo)入Cy3標(biāo)記的JN27多肽的U251細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)紅 色熒光顯示的特異的細(xì)絲。導(dǎo)入FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的U251細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)的微絲(呈細(xì)絲狀分布)被綠 色熒光標(biāo)記，如圖B、圖E所示。對(duì)圖C為對(duì)圖A與B疊加(Merge)的結(jié)果，如圖C所示，紅、綠色熒光發(fā)生重疊而 顯示為黃色的熒光，表明帶Cy3標(biāo)記的JN30多肽所染出的細(xì)絲就是FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽 所特異染出的細(xì)胞F-actin。圖F為對(duì)圖D與E疊加(Merge)的結(jié)果，如圖F所示，紅、綠色熒光發(fā)生重疊而顯 示為黃色的熒光，表明帶Cy3標(biāo)記的JN27多肽所染出的細(xì)絲與FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽所特 異染出的細(xì)胞微絲一致?？梢栽趫DC、F看到JN30、JN27多肽標(biāo)記發(fā)出的紅色熒光與鬼筆環(huán)肽標(biāo)記發(fā)出的綠 色熒光存在共定位；也即JN30、JN27多肽能夠?qū)?xì)胞微絲特異性的靶向標(biāo)記，從而可用于 細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-JN27、pEGFP_C2-JN30真核表達(dá)載體的細(xì)胞，其細(xì)胞微絲的標(biāo)記結(jié) 果如圖H、圖I所示；與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-C2 (圖G)的細(xì)胞相比，圖H、圖I顯示出了與鬼筆環(huán) 肽染色(圖B、E) —致的微絲。說明pEGFP-C2-JN27、pEGFP-C2-JN30真核表達(dá)載體表達(dá)的 融合蛋白在微絲靶向JN27、JN30多肽的特異性指向下，能夠?qū)?xì)胞微絲實(shí)現(xiàn)特異地的綠色 熒光標(biāo)記。將FITC標(biāo)記的TatJN27多肽導(dǎo)入的細(xì)胞，其細(xì)胞微絲的標(biāo)記結(jié)果如圖5所示，在 熒光顯微鏡下可清晰地觀察到F-actin，與鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲的結(jié)果相一致；而且，在FITC標(biāo)記的TatJN27多肽導(dǎo)入細(xì)胞的24h內(nèi)，自TatJN27多肽導(dǎo)入細(xì) 胞8h開始，此后每間隔2 4h，利用倒置熒光顯微鏡在相同視野下觀察，拍照；在8h、10h、 12h、16h、20h、24h的觀察結(jié)果如圖6所示在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)都觀察到了綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞 骨架蛋白，而且隨著細(xì)胞的活動(dòng)，細(xì)胞微絲的運(yùn)動(dòng)不同，熒光標(biāo)記的結(jié)果也相應(yīng)的發(fā)生了變 化；可以看到FITC標(biāo)記的TatJN27實(shí)現(xiàn)了對(duì)活的細(xì)胞的細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽，其特征在于該多肽為JN27，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽，其特征在于所述的多肽是在JN27 的C端增加3個(gè)氨基酸殘基得到的多肽JN30，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽，其特征在于所述的多肽是在JN27 的N端增加11個(gè)氨基酸殘基的穿膜肽得到的多肽TatJN27，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3 所示。
4.一種用于細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體，其特征在于該載體包含標(biāo)記基因 EGFP和細(xì)胞骨架蛋白靶向基因的融合基因，所述的細(xì)胞骨架蛋白靶向基因?yàn)榛騄N27或 JN30 ；基因JN27的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示，基因JN30的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5 所示。
5.如權(quán)利要求4所述的用于細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體，其特征在于所述 的真核表達(dá)載體是PEGFP-C2-JN27，通過HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)將基因JN27克隆到 PEGFP-C2載體上。
6.如權(quán)利要求4所述的用于細(xì)胞骨架蛋白標(biāo)記的真核表達(dá)載體，其特征在于所述 的真核表達(dá)載體是PEGFP-C2-JN30，通過HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)將基因JN30克隆到 PEGFP-C2載體上。
7.多肽JN27、JN30或TatJN27應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于將多肽JN27或JN30用熒光物質(zhì)標(biāo)記后，再 將熒光標(biāo)記的JN27或JN30加入到抗體封閉液中，與經(jīng)過固定、Triton處理的待標(biāo)記細(xì)胞 孵育2h，然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié)果；將多肽TatJN27用熒光物質(zhì)標(biāo)記后，再將熒光標(biāo)記的TatJN27直接加入待標(biāo)記細(xì)胞的 培養(yǎng)液中，37°C孵育12h ；然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié)果。
9.真核表達(dá)載體pEGFP-C2-JN27或pEGFP_C2-JN30應(yīng)用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于將真核表達(dá)載體pEGFP-C2-JN27或 PEGFP-C2-JN30轉(zhuǎn)染到待標(biāo)記的細(xì)胞中，使其得到表達(dá)后，然后在熒光顯微鏡下顯示標(biāo)記結(jié) 果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白的多肽及其真核表達(dá)載體，該多肽轉(zhuǎn)入細(xì)胞或者通過真核表達(dá)載體在細(xì)胞得到表達(dá)后能夠與微絲結(jié)合，熒光標(biāo)記的多肽能夠用于細(xì)胞骨架蛋白的標(biāo)記。所述的多肽為JN27、JN30或者TatJN27；所述的真核表達(dá)載體為pEGFP-C2-JN27或者pEGFP-C2-JN30。熒光標(biāo)記的JN27、JN30、TatJN27多肽導(dǎo)入細(xì)胞，pEGFP-C2-JN27和pEGFP-C2-JN30真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，均可以與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白中的微絲蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的熒光標(biāo)記。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101880321SQ20101010608
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者張斌, 王濤, 藥立波 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)