專利名稱：一種人甲狀旁腺激素(1-34)的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及來(lái)匹盧定的純化方法。
背景技術(shù)：
來(lái)匹盧定(L印irudin)是一種用于治療血栓栓塞性疾病、腦血腫、皮下血腫等病癥的多肽藥物，其效果好且副作用小，具有很好的市場(chǎng)前景。在已公開(kāi)的文獻(xiàn)和專利中，未有報(bào)道適用于大規(guī)模生產(chǎn)、且具有高收率的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種適于產(chǎn)業(yè)化的來(lái)匹盧定的純化方法，純度高且收率好。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括以下步驟 1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2. 5-3. 5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B% :17% 32%，將粗肽溶液進(jìn)行梯度洗脫；A相的磷酸鹽緩沖溶液物質(zhì)量濃度小于0. 2% mol/L。 所述"粗肽"是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經(jīng)過(guò)精制處理的來(lái)匹盧定粗肽或者純度不能滿足藥用的來(lái)匹盧定。"粗肽溶液"是指粗肽溶于水所得到的溶液，水優(yōu)選符合注射用水標(biāo)準(zhǔn)，更優(yōu)選超純水。"乙腈"的純度級(jí)別優(yōu)選色譜純。步驟l)下文也表述為純化。 2)采用反相高效液相色譜法將來(lái)匹盧定轉(zhuǎn)成醋酸鹽。步驟2)下文也表述為"轉(zhuǎn)
^! . o 轉(zhuǎn)鹽的方法優(yōu)選為所述"反相高效液相色譜"的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以質(zhì)量濃度0. 05% —0.2X醋酸水溶液為A相；乙腈為B相，梯度B% :6% 36%，進(jìn)行梯度洗脫。A相醋酸水溶液的濃度優(yōu)選O. 1%。"乙腈"的純度級(jí)別優(yōu)選色譜純。
本發(fā)明提供的來(lái)匹盧定肽純化方法，操作簡(jiǎn)單、純度高、收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
純化規(guī)模包括以下規(guī)格色譜柱(柱子直徑X長(zhǎng)度)50mmX300mm、150mmX300mm、300mmX300mm。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過(guò)濾，收集濾液備用。
2.純化 純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為50mmX300mm。流動(dòng)相A相物質(zhì)量濃度為0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調(diào)pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速70-80ml/min，梯度B%:17% 32%，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。進(jìn)樣量為1.3-1.5g。 純化過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1. 3-1. 5g。線性梯度洗脫45min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液于水溫不超過(guò)3(TC條件下減壓旋蒸濃縮至約100 120mg/ml后備用。 3、轉(zhuǎn)鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為50mmX300mm。流動(dòng)相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速70-80ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，梯度B% :6% 36%。進(jìn)樣量為1. 6-2. Og。 轉(zhuǎn)鹽過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為150-200ml樣品溶液。線性梯度洗脫30min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約50-80mg/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶，然后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到純度大于98%的來(lái)匹盧定。 實(shí)施例二 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過(guò)濾，收集濾液備用。
2.第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為150mmX300mm。流動(dòng)相A相0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調(diào)pH至
2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速450-550ml/min，梯度B%:17% 32%，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。進(jìn)樣量為13-15g。 純化過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為13-15g。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液于水溫不超過(guò)30°C條件下減壓旋蒸濃縮至約70-80mg/ml后備用。 3、轉(zhuǎn)鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為150mmX300mm。流動(dòng)相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速450-550ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，梯度B% :6% 36%。進(jìn)樣量為15_20g。 轉(zhuǎn)鹽過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為1200-1600ml樣品溶液。線性梯度洗脫60min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約50-80mg/ml后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶，然后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到純度大于98%的來(lái)匹盧定。
實(shí)施例三 1.樣品處理粗肽用水溶解，使樣品完全溶解后用濾膜過(guò)濾，收集濾液備用。
2.第一次純化純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為300mmX300mm。流動(dòng)相A相0. 2% mol/L磷酸溶液用三乙胺調(diào)pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈，流速1900-2200ml/min，梯度B% :17% 32%，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。進(jìn)樣量為55-75g。 純化過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為55-75g。線性梯度洗脫120min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液于水溫不超過(guò)3(TC條件下減壓旋蒸濃縮至約70-80mg/ml后備用。 3、轉(zhuǎn)鹽以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為300mmX300mm。流動(dòng)相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色譜純乙腈，流速1900-2200m1/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。梯度B% :6% 36% 。進(jìn)樣量為55_75g。 轉(zhuǎn)鹽過(guò)程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為1200-1600ml樣品溶液。線性梯度洗脫90min，收集目的峰，將收集的來(lái)匹盧定溶液合并旋蒸濃縮至約
450-80ml/g后轉(zhuǎn)至合適大小西林瓶，然后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到純度大于98X的的來(lái)匹盧定。
權(quán)利要求
一種來(lái)匹盧定的純化方法，包括以下步驟1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2.5-3.5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B％17％～32％，將粗肽溶液進(jìn)行梯度洗脫；2)采用反相高效液相色譜法將來(lái)匹盧定轉(zhuǎn)成醋酸鹽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟l)中A相的磷酸鹽緩沖溶液由磷酸溶液采用三乙胺調(diào)pH獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中A相的磷酸鹽緩沖溶液物質(zhì)量濃度小于O. 2% mol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟1)中A相的磷酸鹽緩沖溶液物質(zhì)量 濃度小于0. 2% mol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于實(shí)現(xiàn)步驟2)的方法為所述 "反相高效液相色譜"的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，以質(zhì)量濃度0. 05% —O. 2%醋酸水溶液為A相；乙腈為B相，梯度B% :6% 36%，進(jìn)行梯度洗脫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于A相的醋酸水溶液濃度為0. 1%。
全文摘要
一種人甲狀旁腺激素(1-34)的純化方法。本發(fā)明提出了一條適于產(chǎn)業(yè)化純化來(lái)匹盧定的方法，包括以下步驟1)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以pH值為2.5-3.5的磷酸鹽緩沖溶液為A相，乙腈為B相，梯度B％17％～32％，將粗肽溶液進(jìn)行梯度洗脫；2)采用反相高效液相色譜法將來(lái)匹盧定轉(zhuǎn)成醋酸鹽。本發(fā)明提供的來(lái)匹盧定的純化方法，操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高、收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求。
文檔編號(hào)C07K14/815GK101781367SQ20101011639
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者付信, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司