專利名稱：鹽孢菌酰胺及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及抗腫瘤劑，特別是涉及鹽孢菌酰胺及其作為抗腫瘤劑的應(yīng)用。
冃京fe息 特征是細(xì)胞增生不受細(xì)胞生長正?？刂频哪[瘤類疾病，是人類死亡的一個主要原 因。化療的臨床經(jīng)驗(yàn)表明，希望有新的更有效的細(xì)胞毒素類藥物來治療這些疾病。的確，由 于對轉(zhuǎn)移到不同部位的新的腫瘤和癌細(xì)胞類型的識別，以及由于抗腫瘤治療方案作為一種 主要的和附加的癌癥醫(yī)學(xué)療法的有效性，抗腫瘤劑的使用已經(jīng)增加。 由于抗腫瘤劑是細(xì)胞毒素(對細(xì)胞有毒)，因此它們不僅會干擾腫瘤細(xì)胞的生長， 而且也會干擾正常細(xì)胞的生長?？鼓[瘤劑對腫瘤細(xì)胞的作用要大于對正常細(xì)胞的作用，原 因是腫瘤細(xì)胞的生長很快。因此，抗腫瘤劑所作用的正常組織細(xì)胞是快速分裂的細(xì)胞，如骨 髓(在低血細(xì)胞計(jì)數(shù)中見到)，毛囊(以脫發(fā)方式見到)以及GI粘膜上皮(引起惡心，嘔 吐，喪失食欲，腹瀉)。通常，抗腫瘤劑具有任何種類的人類用藥的最低治療指數(shù)，從而產(chǎn)生 了對生命造成威脅的重大潛在毒性。某些通常使用的抗腫瘤劑對特異性組織具有獨(dú)特而急 性的毒性。例如，長春花屬生物堿對神經(jīng)組織有重大毒性，而阿霉素對心臟組織有特異性毒 性，博來霉素對肺部組織具有毒性。 因此，對于有效抑制高增生性細(xì)胞的增生，同時具有低于現(xiàn)有抗腫瘤劑的IC50 值，從而導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重副作用顯著下降的抗腫瘤劑，仍存在繼續(xù)的需求。
發(fā)明概述 本發(fā)明基于海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的某些發(fā)酵產(chǎn)物是高增生性哺乳動 物細(xì)胞的有效抑制劑這一發(fā)現(xiàn)。CNB392和CNB476菌株存在于小單孢菌科中，而且鹽孢菌 (Salinospora)這一屬名(generic印ithet)已經(jīng)被提議用于這種專性海洋族群。由這種 菌株產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物被歸為鹽孢菌酰胺，在治療腫瘤疾病方面特別有效，這是由于其具有
8低分子量、低IC50值、高藥效，以及癌細(xì)胞對真菌的選擇性。
在本發(fā)明的 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物<formula>formula see original document page 9</formula>其中A至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈
烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基， 取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基(thioalkyl)，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺 基，羧基，-C (0) H，?；?，氧?；?oxyacyl)，氨基甲酸酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個R4獨(dú) 立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代 環(huán)烷基A至E4各自獨(dú)立地為-0， -NR5或-S，其中R5為-H或C「Ce烷基；且x為0到8。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(II)的化合物<formula>formula see original document page 9</formula>其中A至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯
基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取 代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺基，羧基，-c(o)
H，?；?，氧酰基，氨基甲酸酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈 烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立 地為-0， -NR5，或-S，其中R5為-H或C「C6烷基；以及x為0到8。 在本發(fā)明的另 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(III)的化合物其中至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，
炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)
烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺基，羧基，-C (0) H， ?；貂；被姿狨?，磺?；?，氨磺酰，或砜基，每個R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯 基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，E工至E4各自獨(dú)立地 為-0， -NR5，或-S，其中R5為-H或CrC6烷基，以及x為0到8。 在本發(fā)明的又 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(IV)的化合物
CI 在本發(fā)明的另 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(V)的化合物
10<formula>formula see original document page 11</formula> 在本發(fā)明的另 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(VI)的化合物
<formula>formula see original document page 11</formula> 在另一種實(shí)施方式中，提供了一種藥物組合物，其包括存在于藥學(xué)上可接受的載
體中的至少一種結(jié)構(gòu)i-vi的化合物。 在另一種實(shí)施方式中，提供了制品，其包括包裝材料和裝在包裝材料內(nèi)的藥物組 合物，其中該包裝材料包括指明該藥物組合物可用于治療細(xì)胞增生性疾病的標(biāo)簽，以及其
中該藥物組合物包括至少一種結(jié)構(gòu)i-vi的化合物。 在又一種實(shí)施方式中，提供了一種治療哺乳動物細(xì)胞增生性疾病的方法。這樣的
方法可通過例如將治療有效量的結(jié)構(gòu)i-vi的化合物向所需的患者給藥的方式進(jìn)行。 在另外的實(shí)施方式中，提供了制備結(jié)構(gòu)I-VI的化合物的方法，該化合物具有 抑制高增生性哺乳動物細(xì)胞增生的能力。這樣的方法可通過例如對鹽孢菌種的菌株
CNB392(ATCC#_)或CNB476 (ATCC PTA-5275)培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)物中分離
出結(jié)構(gòu)I的至少一種化合物的方式進(jìn)行。附圖簡要說明

圖1示出了本發(fā)明示例性化合物鹽孢菌酰胺A的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有相對的立體化學(xué)。 圖2示出了說明"鹽孢菌"系統(tǒng)發(fā)育的系統(tǒng)樹。 圖3示出了用于治療幾種人類癌癥的抗腫瘤劑，足葉乙甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 圖4比較了鹽孢菌酰胺A和足葉乙甙的細(xì)胞毒素活性和劑量響應(yīng)曲線。 圖5是描繪用于分離鹽孢菌酰胺A的示例性分離方案的方塊圖。 圖6-14是用于闡明鹽孢菌酰胺A結(jié)構(gòu)的NMR， IR和UV光譜數(shù)據(jù)。 圖15是菌株CNB392和CNB476在其16S rDNA內(nèi)具有的標(biāo)記核苷酸，該標(biāo)記核苷
酸使這些菌株與小單孢菌科中的其它成員在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上區(qū)分開來。 圖16示出了本發(fā)明示例性化合物鹽孢菌酰胺A(結(jié)構(gòu)V)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有絕對 的立體化學(xué)。 圖17繪出了鹽孢菌酰胺A的最終X-射線結(jié)構(gòu)的ORTEP圖(熱橢圓形點(diǎn)圖)，描述 了其絕對立體化學(xué)。
發(fā)明詳述<formula>formula see original document page 12</formula>中A至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基， 取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷 氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；?，氧?；?，氨基甲酸 酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取 代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基&至E4各自獨(dú)立地為-0， -NR5，或-S，其中R5 為-H或C「Ce烷基；以及x為0到8。 在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(II)的化合物<formula>formula see original document page 13</formula>其中A至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯
II
基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取
代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺基，羧基，-c(o)
H，?；貂；被姿狨?，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每個R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈 烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立 地為-0， -NR5，或-S，其中R5為-H或C「C6烷基；以及x為0到8。
&至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代 芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基， 硫烷基，取代硫烷基，羥基，卣素，氨基，酰胺基，羧基，-C(0)H，?；?，氧酰基，氨基甲酸酯，磺 酰基，氨磺酰，或砜基，每個R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔 基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，E工至E4各自獨(dú)立地為-0， -NR5，或-S，其中R5為-H 或C「Ce烷基，以及x為0到8。 在本發(fā)明的又 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(IV)的化合物<formula>formula see original document page 13</formula> 在一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(III)的化合物
其中
拷2<formula>formula see original document page 14</formula>IV 在本發(fā)明的另 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(V)的化合物:
<formula>formula see original document page 14</formula>
在本發(fā)明的另 一 種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(VI)的化合物:<formula>formula see original document page 15</formula> 此處所用的術(shù)語〃 烷基〃 是指具有1至約12個碳原子的單價直鏈或支鏈烴基，包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正己基，和類似基團(tuán)。
此處所用的術(shù)語〃 取代烷基〃 是指帶有一個或多個取代基的烷基，這些取代基選自羥基，烷氧基，氫硫基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，芳氧基，取代芳氧基，鹵素，氰基，硝基，氨基，酰胺基，-C (0) H，?；?，氧?；?，羧基，磺酰基，氨磺酰，砜基，和類似基團(tuán)。 此處所用的術(shù)語〃 低級烷基〃 是指具有1至約6個碳原子的烷基。 此處所用的術(shù)語〃 鏈烯基〃 是指具有一個或多個碳碳雙鍵以及約2至12個碳原
子的直鏈或支鏈烴基，以及〃 取代鏈烯基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的鏈烯基。 此處所用的術(shù)語〃 炔基〃 是指具有至少一個碳碳叁鍵以及約2至約12個碳原子的直鏈或支鏈烴基，而〃 取代炔基〃 是指進(jìn)一步帶有上述一個或多個取代基的炔基。
此處所用的術(shù)語〃 芳基〃 是指具有6至14個碳原子的芳香基團(tuán)，而〃 取代芳基〃是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的芳基。 此處所用的術(shù)語〃 雜芳基〃 是指含有一個或多個雜原子(例如N， 0， S或類似原子)作為環(huán)結(jié)構(gòu)一部分，以及具有3至14個碳原子的芳香基團(tuán)，而〃 取代雜芳基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的雜芳基。 此處所用的術(shù)語〃 烷氧基〃 是指-0-烷基-部分，其中烷基如上定義，而〃 取代烷氧基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的烷氧基。 此處所用的術(shù)語〃 硫烷基〃 是指-S-烷基-部分，其中烷基如上定義，而〃 取代硫烷基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的硫烷基。 此處所用的術(shù)語〃 環(huán)烷基〃 是指具有約3至約8個碳原子的含環(huán)烷基，而〃 取代環(huán)烷基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的環(huán)烷基。 此處所用的術(shù)語〃 雜環(huán)基〃 是指具有一個或多個雜原子(例如N， 0， S或類似原子)作為環(huán)結(jié)構(gòu)一部分以及具有3至14個碳原子的環(huán)狀(即含環(huán))基團(tuán)，而〃 取代雜環(huán)基〃 是指進(jìn)一步帶有一個或多個上述取代基的雜環(huán)基。
在一些實(shí)施方式中，提供了結(jié)構(gòu)I-III的化合物，其中Ep E3和E4為-0，而E2為-NH。 在一些實(shí)施方式中，提供了結(jié)構(gòu)I-III的化合物，其中&和R2為-H，烷基或取代烷基，而R3為羥基或烷氧基。在一些實(shí)施方式中，Ri為取代烷基。預(yù)期使用的示例性取代烷基包括鹵化烷基，例如諸如氯化烷基。 本發(fā)明的化合物可被配制成天然形式或鹽形式的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的非毒性鹽包括堿加成鹽(base addition salt)(采用自由羧基或其它陰離子基團(tuán)形成)，其可來源于無機(jī)堿，例如鈉，鉀，銨，鈣，或鐵的氫氧化物，以及有機(jī)堿，例如異丙基胺，三乙基胺，2-乙基氨基-乙醇，組氨酸，普魯卡因，和類似物。這類鹽也可以用任何的自由陽離子基團(tuán)形成為酸加成鹽，通常是用無機(jī)酸如鹽酸，硫酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸，對甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，酒石酸，苦杏仁酸，和類似酸。本發(fā)明的鹽包括采用無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸和類似酸對氨基基團(tuán)進(jìn)行質(zhì)子化而形成的胺鹽。本發(fā)明的鹽也包括采用合適的有機(jī)酸如對甲苯磺酸、乙酸和類似酸對氨基基團(tuán)進(jìn)行質(zhì)子化而形成的胺鹽。本發(fā)明實(shí)踐中預(yù)期采用的其它賦形劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲知的那些賦形劑，如在UnitedStates Pharmacopeia Vol. XXII禾口 National Formulary Vol. XVII， U. S. PharmacopeiaConvention, Inc. ， Rockville，MD (1989)中可見到的那些賦形劑，這里將這些文獻(xiàn)的相關(guān)內(nèi)容引入作為參考。 根據(jù)本發(fā)明的化合物可包含一個或多個不對稱碳原子，因此可存在為外消旋物或外消旋混合物、單個的對映體、非對映異構(gòu)混合物和單獨(dú)的非對映異構(gòu)體。術(shù)語〃 立體異構(gòu)體〃 是指分子中不同基團(tuán)僅在空間取向上互不相同的化合物。立體異構(gòu)體具有相同的分子量，化學(xué)組成，以及結(jié)構(gòu)，但原子的組合方式不同。也就是說，某些相同的化學(xué)部分在空間取向上有所不同，因此，當(dāng)為純化合物時，該化合物具有旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力。然而， 一些純立體異構(gòu)體的旋光度很小，以至于采用目前的儀器探測不到。這些化合物的所有這類異構(gòu)體形式都清楚地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 每個立體型的碳可以具有R或S構(gòu)型。盡管本申請中舉例的具體化合物被以特定的構(gòu)型描繪，但也想象得出在任何給定的手性中心處具有相反立體化學(xué)的化合物或它們的混合物。當(dāng)在本發(fā)明的衍生物中發(fā)現(xiàn)手性中心時，應(yīng)該理解，本發(fā)明涵蓋了所有可能的立體異構(gòu)體。術(shù)語〃 光學(xué)純的化合物〃 或〃 光學(xué)純的異構(gòu)體〃 是指手性化合物的單一立體異構(gòu)體，而不管化合物的構(gòu)型如何。 本發(fā)明示例性的結(jié)構(gòu)I化合物如下所示
鹽孢菌酰胺A的分子結(jié)構(gòu)中具有可被化學(xué)修飾以制造合成衍生物的各種官能團(tuán)(內(nèi)酯，鹵代烷，酰胺，羥化物)。因此，示例性的本發(fā)明化合物鹽孢菌酰胺A具有優(yōu)異的形成合成和半合成衍生物的引導(dǎo)性結(jié)構(gòu)。確實(shí)，可對鹽孢菌酰胺A進(jìn)行衍生以改進(jìn)藥物代謝動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，這使得衍生物易于給藥并增加了其作為抗腫瘤劑的利用度。對本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物進(jìn)行化學(xué)修飾而制得本發(fā)明范圍內(nèi)的其它化合物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的。 在HTC-116細(xì)胞分析試驗(yàn)中，鹽孢菌酰胺A顯示出對人類結(jié)腸癌細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞毒素活性。IC50值為11ng/mL，這幾乎超過足葉乙甙(參見圖3， IC50值為828ng/mL)的活性達(dá)2個數(shù)量級(參見圖4)，足葉乙甙是一種用于治療多種癌癥的抗癌藥物。這種高活性使本發(fā)明的鹽孢菌酰胺成為用于治療各種人類癌癥的優(yōu)異候選物，尤其是減慢了目前尚無治療方案的頑固癌(refractile cancers)的生長。鹽孢菌酰胺A對抑制哺乳動物細(xì)胞具有特效，對白念珠菌(Candida albicans)的抗真菌活性很小(IC50 250 y g/mL)，且不具有抗細(xì)菌活性(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，尿腸球菌(Enterococcusfaecium))。鹽孢菌酰胺A的IC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前已在使用或處于臨床試驗(yàn)中的最強(qiáng)化療劑。
鹽孢菌酰胺A是海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的發(fā)酵產(chǎn)物。這些菌株是放線菌目的成員，其為高G+C革蘭氏陽性菌。CNB392和CNB476的新穎性在于屬這一級別上。這里所述的發(fā)明化合物由某些〃 鹽孢菌〃 種產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物由〃鹽孢菌〃 種的菌株CNB392和CNB476產(chǎn)生。為此，根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約，于2003年6月20日將〃 鹽孢菌〃 種的CNB392和CNB476菌株保藏在位于12301Parklawn Drive, Rockville， Md. 20852U. S. A.的美國模式菌種收集中心的專利菌種存放處，ATCC保藏號分別為_和PTA-5275。 如同其它生物體的情況， 〃 鹽孢菌〃 種的特征易于變化。例如，可采用各種已知
的物理和化學(xué)誘變劑，如紫外線J-射線、Y _射線和N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍，進(jìn)
行處理，可得到特定菌株的重組體、變異體或突變體。保留了產(chǎn)生本發(fā)明化合物這個特性的
特定菌株的所有天然的和誘發(fā)的變異體、突變體和重組體都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。 本發(fā)明的化合物可例如通過細(xì)菌發(fā)酵而制備，其產(chǎn)生的化合物的量足以用于開發(fā)
藥物和用于臨床試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物是通過在AlBfe+C或CKA-液體介質(zhì)中對放線菌菌株CNB392和CNB476進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生的。培養(yǎng)介質(zhì)中還應(yīng)該包括培養(yǎng)物生長和發(fā)育所必需的基本痕量元素。這類痕量元素在介質(zhì)的其它組分中作為雜質(zhì)存在，其存在量足以滿足生物體的生長要求。如果發(fā)泡變成問題，需要向大規(guī)模的培養(yǎng)介質(zhì)中加入少量的(即0. 2mL/L)消泡劑如聚丙二醇(M. W.約為2000)。通過將有機(jī)代謝物吸附到安珀萊特(amberlite)XAD-16樹脂上，使有機(jī)代謝物分離。例如，采用甲醇二氯甲烷l : l洗脫XAD-16樹脂而分離出鹽孢菌酰胺A，每升培養(yǎng)物中得到的粗提取物為約105mg。然后采用反相快速色譜法，接著采用反相HPLC和正相HPLC，從初提取物中分離鹽孢菌酰胺A，獲得6. 7mg鹽孢菌酰胺A。圖5給出了本發(fā)明化合物分離和分開方案的方塊圖。
采用各種NMR技術(shù)、質(zhì)譜、IR和UV光譜對鹽孢菌酰胺A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，如圖6_14所示。 鹽孢菌酰胺A的絕對結(jié)構(gòu)，以及對鹽孢菌酰胺A的整體結(jié)構(gòu)的確認(rèn)是采用單晶體X-射線衍射分析獲得的(參見實(shí)施例3)。 本發(fā)明還提供了包括包裝材料和裝在包裝材料內(nèi)的藥物組合物的制品，其中所述的包裝材料包括說明藥物組合物可用于治療癌癥的標(biāo)簽，及其中所述的藥物組合物包括本發(fā)明的化合物。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明化合物的藥物組合物，其中所述的化合物的濃度為有效治療細(xì)胞增生性疾病的濃度。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)治療方案或采用動物體內(nèi)試驗(yàn)來確定該濃度。 用作本發(fā)明制品的構(gòu)成部分的藥物組合物可以以固體、溶液、乳液、分散系、膠束、脂質(zhì)體的形式和類似形式使用，其中最終的組合物含有一種或多種作為活性成分的本發(fā)明化合物，與適于經(jīng)腸或腸胃外應(yīng)用的有機(jī)或無機(jī)載體或賦形劑相混合。用作本發(fā)明制品的構(gòu)成部分的化合物可以例如與常規(guī)的無毒性藥學(xué)可接受載體結(jié)合，形成片劑、顆粒劑、膠囊、栓劑、溶劑、乳液、懸浮液，以及其它適用的劑型。可以采用的載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、白明膠、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅膠、馬鈴薯淀粉、脲、中等鏈長的甘油三酯、右旋糖酐以及其它適于制備固體、半固體或液體形式制劑的載體。此外也可采用輔劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和著色劑以及香味劑。 本發(fā)明的組合物可包含下述的其它治療劑，并且例如，可采用常規(guī)的固體或液體載體或稀釋劑，以及適于所需給藥方式的藥物添加劑類型(例如，賦形劑，粘結(jié)劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑等)，根據(jù)藥物配制領(lǐng)域公知的技術(shù)，進(jìn)行配制。 本發(fā)明的藥物組合物可以采用任何合適的方式給藥，如口服給藥，諸如以片劑、膠囊、顆?；蚍勰┬问剑簧嘞陆o藥；口腔給藥；腸胃外給藥，諸如通過皮下、靜脈內(nèi)、肌肉或腦池內(nèi)的注射或輸注技術(shù)(如作為無菌注射性水性或非水性溶液或懸浮液)；鼻腔給藥，諸如通過吸入噴劑；局部給藥，諸如采用乳膏或藥膏形式；或者直腸給藥，諸如以栓劑形式；以含有無毒性藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的單位劑量制劑的形式。本發(fā)明的化合物可以例如以適于立即釋放或延遲釋放的形式進(jìn)行給藥?？刹捎冒ū景l(fā)明化合物的適當(dāng)藥物組合物，或者，特別在延遲釋放的情況下，可采用裝置，如皮下輸注裝置或滲透泵，實(shí)現(xiàn)立即釋放或延遲釋放。本發(fā)明的化合物也可以脂質(zhì)體方式進(jìn)行給藥。 本發(fā)明還提供了采用發(fā)明的結(jié)構(gòu)(I)-(VI)的鹽孢菌酰胺化合物來抑制哺乳動物細(xì)胞增生的方法，該方法是通過使這些細(xì)胞與其量足以抑制哺乳動物細(xì)胞增生的本發(fā)明鹽孢菌酰胺化合物相接觸而實(shí)現(xiàn)的。 一種實(shí)施方式是抑制高增生性哺乳動物細(xì)胞增生的方法。在本發(fā)明中， 〃 高增生性哺乳動物細(xì)胞〃 是指不受生長的特性限制，如編程性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的哺乳動物細(xì)胞。另一種優(yōu)選實(shí)施方式是哺乳動物細(xì)胞為人類細(xì)胞時。本發(fā)明還提供了使哺乳動物細(xì)胞和至少一種本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物以及至少一種其它的抗腫瘤劑相接觸的方法。 在另一種實(shí)施方式中，提供了治療哺乳動物細(xì)胞增生性疾病的方法，該方法包括
給予患者所需的治療有效量的結(jié)構(gòu)(i)-(vi)的化合物?？刹捎帽景l(fā)明的方法有效治療的
細(xì)胞增生性疾病包括以腫瘤的形成為特征的疾病。如此，本發(fā)明的化合物就是抗腫瘤劑。此處所用的術(shù)語〃 腫瘤的〃 涉及異常生長的腫瘤，這類生長的發(fā)生是由于細(xì)胞增生不受到生長的通常限制。此處所用的術(shù)語〃 抗腫瘤劑〃 是抑制、消除、阻礙、或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的腫瘤表型的任何化合物、組合物、混合物、共混物或摻和物。在一些實(shí)施方式中，腫瘤選自乳腺腫瘤，小細(xì)胞肺部腫瘤，非小細(xì)胞肺部腫瘤，結(jié)直腸腫瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，卵巢腫瘤，前列腺腫瘤，軟組織或骨肉瘤，頭頸部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏病的胃癌，胃部腫瘤，骨髓瘤，膀胱腫瘤，腎部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏和何杰金氏病的神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤。在一種實(shí)施方式中，腫瘤是結(jié)直腸腫瘤。 目前癌癥治療中使用化療，外科手術(shù)，放療，采用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的治療，以及免疫療法。每種治療方式都有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的特異性適應(yīng)癥，可采用一種療法或所有療法實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的全部毀滅。本發(fā)明提供了利用一種或多種本發(fā)明鹽孢菌酰胺的化療法。而且，本發(fā)明也提供了聯(lián)合利用本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物和其它抗腫瘤劑的聯(lián)合化療法，該聯(lián)合化療法一般比采用單獨(dú)一種抗腫瘤劑更有效。因此，本發(fā)明的再一方面提供了組合物，其包括治療有效量的至少一種本發(fā)明鹽孢菌酰胺化合物與至少一種抗腫瘤劑。這類組合物也可與生理學(xué)容許的液體，凝膠或固體載體，稀釋劑，輔劑和賦形劑一起提供。這類載體，稀釋劑，輔劑和賦形劑可在United StatesPharmacopeiaVol.XXII禾口 National Formulary Vol.XVII， U.S.Pharmacopeia Convention, Inc.,Rockville， Md. (1989)中找到，這里將其內(nèi)容引入作為參考。其它的治療方法可參見AHFS Druglnformation，1993版，美國醫(yī)院處方月艮務(wù)機(jī)構(gòu)(American HospitalFormularyService)編輯，第522-660頁，在此將其內(nèi)容引入作為參考。 可與本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物聯(lián)合使用的抗腫瘤劑包括TheMerck Index, 11thed. Merck & Co. ， Inc. (1989)卯.Ther 16-17中提供的那些抗腫瘤齊U，在此將其內(nèi)容引入作為參考。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，抗腫瘤劑可以是抗代謝物，其包括但不限于氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-氫硫基嘌呤，阿糖胞苷，羥基脲，以及2-氯脫氧腺苷。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是烷基化試劑，其可包括但不限于環(huán)磷酰胺，美法侖，白消安，伯爾定(Paraplatin)，苯丁酸氮芥，以及氮芥。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，抗腫瘤劑是植物生物堿，其包括但不限于長春新堿，長春花堿，紫杉醇，以及足葉乙甙。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是抗生素，其包括但不限于亞德里亞霉素(可霉素)，道諾霉素，絲裂霉素c，以及博來霉素。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是激素，其包括但不限于卡普睪酮，diomostavolone，丙酸酯，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內(nèi)脂，三苯氧胺，聚磷酸雌二醇，醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)，氟他胺，尼魯米特，以及trilotane。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑包括酶或氨基吖啶衍生物，其中酶可包括但不限于左旋門冬酰胺酶，而氨基吖啶衍生物可包括但不限于安吖啶。其它的抗腫瘤劑包括Skeel， Roland T. ， 〃 Antineoplastic Drugs and Biologic ResponseModifier : Classification, Use and Toxicity of Clinically Useful Agents, 〃 Handbook of Cancer Chemotherapy (3rd ed.) ， Little Brown & Co. (1991)中所述的那些抗月中瘤劑，在 此將其內(nèi)容引入作為參考。 除了例如人類的靈長類動物之外，本發(fā)明的方法也可用于治療各種其它的哺乳動 物。例如，可被治療的哺乳動物包括但不限于母牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，豚鼠，大鼠或其它 的?？疲d羊科，馬科，犬科，貓科，嚙齒目或鼠科動物。 術(shù)語〃 治療有效量〃 是指主題化合物的用量，其能引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它 臨床醫(yī)生所探尋的組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)，例如減輕細(xì)胞增生性疾病的 影響/癥狀。 術(shù)語〃 藥學(xué)上可接受的〃 是指載體，稀釋劑或賦形劑必須和制劑中的其它成分相 容，并且對其接受者無害。 術(shù)語〃 給予(administration of) 〃禾口或〃 提供(administering a) 〃化合物應(yīng) 該理解為，向需要治療的個體提供本發(fā)明的化合物。給予本發(fā)明化合物可以在其它治療劑 或其它抗腫瘤劑給藥之前、同時或之后進(jìn)行。 為進(jìn)行本發(fā)明化合物給藥的藥物組合物可方便地以單位劑型存在，并且可采用制 藥領(lǐng)域任何公知的方法進(jìn)行制備。所有的方法都包括使活性組分和載體結(jié)合的步驟，該載 體構(gòu)成了一種或多種輔助的組分。通常，藥物組合物是通過將活性組分和液體載體或細(xì)分 的固體載體或兩者均勻緊密地結(jié)合，必要時再將產(chǎn)物制成所需制劑形式而制備的。在藥物 組合物中，活性目標(biāo)化合物的含量足以產(chǎn)生對病程或病況的預(yù)期效果。 含有活性組分的藥物組合物可以為適合口服的劑型，如片劑，小藥錠，錠劑，水性 或油性懸浮液，可分散粉末或顆粒，乳液，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。 用于口服的組合物可根據(jù)藥物組合物制備領(lǐng)域公知的任何方法制備得到，并且這 類組合物可含有選自甜味劑，調(diào)味劑，著色劑和防腐劑的一種或多種試劑，以獲得藥學(xué)上精 致和可口的制劑。片劑含有活性組分，其與適于制造片劑的非毒性藥學(xué)可接受賦形劑相混 合。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，例如碳酸鈣，碳酸鈉，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；成粒 和崩解劑，例如玉米淀粉或藻酸；粘結(jié)劑，例如淀粉，白明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如 硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。片劑可為未包衣的，也可采用已知技術(shù)進(jìn)行包衣以延遲在胃腸道 中的崩解和吸收，從而獲得較長時間的持續(xù)作用。例如，可采用延時材料，例如單硬脂酸甘 油酯或二硬脂酸甘油酯。也可對片劑進(jìn)行包衣而形成可控制釋放的滲透性治療片劑。
用于口服的制劑也可以硬明膠膠囊存在，其中活性組分和惰性固體稀釋劑如碳酸 鈣、磷酸鈣或高嶺土相混合；或者可以軟明膠膠囊存在，其中活性組分與水或油介質(zhì)如花生 油，液體石蠟或橄欖油相混合。 水性懸浮液含有活性材料，該活性材料與適于制造水性懸浮液的賦形劑相混合。 這類賦形劑有懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙 烯_吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯膠；分散或潤濕劑，可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或 環(huán)氧烷烴與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚環(huán)氧乙烷硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合 產(chǎn)物，如十七亞乙氧基鯨蠟醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸 和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。水性懸浮液也可含有 一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種調(diào) 味劑，以及一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。 油性懸浮液可通過將活性組分懸浮于植物油如花生油，橄欖油，芝麻油或椰子油， 或懸浮于礦物油如液體石蠟中而配制得到。油性懸浮液可包含增稠劑，例如蜂蠟，硬石蠟或 鯨蠟醇?？杉尤肷鲜龅奶鹞秳┖驼{(diào)味劑以獲得可口的口服制劑?？杉尤肟寡鮿┤缈箟难?以保存這些組合物。 適于通過加入水而制得水性懸浮液的可分散粉末和顆粒中含有與分散或潤濕劑、
懸浮劑以及一種或多種防腐劑預(yù)混合的活性組分。合適的分散或潤濕劑以及懸浮劑的例子
已在上文中列舉。也可存在其他的賦形劑，例如甜味劑，調(diào)味劑和著色劑。 可采用甜味劑，例如甘油，丙二醇，山梨糖醇或蔗糖配制成糖漿或酏劑。這類制劑
還可含有緩和劑，防腐劑以及調(diào)味劑和著色劑。 藥物組合物可以是無菌的可注射水性或油性懸浮液形式。該懸浮液可采用上述合 適的分散或潤濕劑以及懸浮劑，按照本領(lǐng)域的方法配制而成。無菌的可注射制劑也可以是 存在于無毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如存在于l， 3-丁二醇中的溶液?？刹捎玫目山邮茌d體和溶劑中有水、Ringer' s溶液(林格氏液)和 氯化鈉等滲溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油通常也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可采用包 括合成的單-或二甘油酯在內(nèi)的無剌激性不揮發(fā)性油。另外，脂肪酸如油酸也可用于制備 可注射制劑。 本發(fā)明的化合物也可以直腸給藥的栓劑形式給藥。這些組合物可通過將藥物和合
適的非剌激性賦形劑相混合而制得，其中的非剌激性賦形劑在常溫下是固態(tài)，但在直腸溫
度下是液態(tài)，從而在直腸中融化而釋放出藥物。這類材料是可可油和聚乙二醇。 在局部使用的情況下，可采用含有本發(fā)明化合物的乳膏、油膏、凝膠劑、溶液或懸
浮液等。 本發(fā)明的化合物和組合物可以與其他治療劑相同的方式，在例如針對家畜的獸醫(yī) 應(yīng)用中或針對人類的臨床應(yīng)用中向哺乳動物給藥。 一般來說，達(dá)到療效所要求的劑量會隨 著應(yīng)用類型和給藥方式，以及單個主體的具體要求而有所不同。通常，劑量范圍為主體體重 的約0. 001到1000 ii g/kg，更通常為主體體重的0. 01到10 ii g/kg。可選地，這些范圍內(nèi)的 劑量可在延長的時間段內(nèi)，通常在超過24小時的時間段內(nèi)進(jìn)行持續(xù)輸注，直到達(dá)到期望的 治療效果。然而，應(yīng)該理解，對任何具體患者的具體劑量水平和劑量頻率可以是不同的，并 取決于各種因素，包括所采用的具體化合物的活性，該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間長 短，年齡，體重， 一般健康狀況，性別，食欲，給藥方式和時間，排泄率，聯(lián)合用藥情況，具體病 癥的嚴(yán)重性，以及受治療的主體。 現(xiàn)在將參照以下非限定性實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述。
實(shí)施例
方法和材料 HPLC-本發(fā)明化合物的純化是在C18-固體相(Aldrich)上進(jìn)行RP-MPLC法，在
21Kontes Flex-柱(15x7mm)上采用分步梯度而完成的。半制備性HPLC是在等度HPLC系統(tǒng) 上進(jìn)行的，該系統(tǒng)的正相柱Si-Dynamas-60 A (250x5mm)或反相柱C18-Dynamax-60 A上帶 有Waters泵6000H，流速為2mL/分鐘，并帶有差示折射率檢測儀Waters R401。
LC-MS-LC-MS色譜分析是在帶有DAD和MSD1100檢測的Hewlett-Packard系統(tǒng)系 列HP1100上進(jìn)行的。在反相C18柱(AgilentHypersil ODS 5 y m，柱尺寸為4. 6x100mm)上 進(jìn)行分離，流速為0. 7mL/分鐘，采用的標(biāo)準(zhǔn)梯度為10%乙腈，15分鐘；98%乙腈(Burdick fejackson高純度溶劑)。MS-檢測是在ESI正離子模式下進(jìn)行的，毛細(xì)管電壓為3500eV，碎 裂電壓為70eV，質(zhì)量范圍m/z為100-1000。 APCI-模式在流速為0. 5mL/分鐘、正離子檢測、 毛細(xì)管電壓為3000eV、碎裂電壓為70eV的條件下測定。 NMR-NMR譜是在對^或2D-NMR譜具有反相模式的Varian300MHz梯度場光譜儀上 測得的。13C和DEPT譜是在Varian 400MHz的寬譜帶儀器上測得的。參照物是內(nèi)標(biāo)四甲基 硅烷(TMS，O. OO卯m)。 MS-EI-低分辨率MS-EI光譜是在帶有扇形磁場設(shè)備(magneticsector field device)的Hewlett-Packard質(zhì)譜儀上測得的，以20°C /分鐘的加熱速率升溫到320°C，并 直接注入進(jìn)樣。 FTMS-MALDI-高分辨MS數(shù)據(jù)是在IonSpec Ultima FT質(zhì)譜儀上以MALDI操作模式 獲得的。 IR-紅外光譜是在Perkin-Elmer FT紅外光譜儀上采用NaCl窗測得的。 實(shí)施例1
〃鹽孢菌〃 種的分離和表征 培養(yǎng)物編號為CNB392和CNB476 CNB392和CNB476在其16S rDNA內(nèi)具有標(biāo)記核苷酸，這在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上將這些 菌株與所有其他的小單孢菌科成員區(qū)分開來(參見圖15)。這些標(biāo)記核苷酸已經(jīng)被確認(rèn) 為是這組成員的決定性標(biāo)記物，該組成員對鈉也具有生理學(xué)生長需求。利用Ribosomal Database Project中1_31_01上所有存在的小單孢菌科成員將標(biāo)記核苷酸排列到大腸桿 菌(E.coli)位置27-1492上。對〃 鹽孢菌〃 分化枝，45個部分測序的形態(tài)型顯示出所有來 自位置207-468的標(biāo)記核苷酸。這七個幾乎全部測序的〃 鹽孢菌〃 分離物(參見圖2)顯 示出圖15中的全部標(biāo)記。 菌株CNB392和CNB476在瓊脂上形成了鮮橙色至黑色的菌落，并且不存在氣生菌 絲體。取決于細(xì)胞的生長階段，產(chǎn)生了深棕色和鮮橙色的可擴(kuò)散色素。孢子使菌落表面變 黑，并負(fù)載在基質(zhì)菌絲體上。營養(yǎng)菌絲體被微細(xì)地分支且并不分裂成碎片。孢子被單獨(dú)地 或成群地產(chǎn)生。對這些菌株，既沒有觀察到孢子囊的游動性，也沒有觀察到孢子的游動性。 CNB392和CNB476對鈉具有專性生長需求，不會在用于維持小單孢菌科其它屬成員的通常 介質(zhì)中生長。已發(fā)現(xiàn)，CNB392和CNB476于3(TC下在固體介質(zhì)TCG或M1上最佳地生長。TCG 3g胰蛋白胨 Ml IO克淀粉 5克酪胨 4克酵母提取物
4克葡萄糖 2克蛋白胨 18克瓊脂(任選) 18克瓊脂(任
22選)1升過濾海水 1升過濾海水
發(fā)酵 于35 °C下，在1升的搖動AlBf e+C或CKA-液體介質(zhì)中培養(yǎng)CNB392和CNB476 達(dá)9天。4天之后，加20克Amberlite XAD-16樹脂(Sigma，非離子型聚合物吸附劑)。 AlBf e+C IO克淀粉 CKA 5克淀粉 4克酵母提取物 4mL
水溶性物(50% ) 2克蛋白胨 2克鯡魚粉 1克
CaC03 2克海藻粉 5mL KBr(水溶液，20g/1) 2克殼
5mL Fe2 (S04) 3x4H20 (8g/l)1升過濾海水1升過濾海水
提取 過濾XAD-16樹脂，并先用1升乙酸乙酯，再用1升甲醇洗脫有機(jī)提取物。然后，用 乙酸乙酯(3x200mL)提取濾液。XAD吸收的粗提取物為105mg。對人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 的分析試驗(yàn)得到的細(xì)胞毒性為IC50 < 0. Q76ii g/mL。
從CNB392分離出鹽孢菌酰胺A 在C18反相(RP)色譜上采用分段梯度，對粗提取物進(jìn)行快速色譜分析(圖5)。 HCT-l 16分析獲得了兩種活性級分，CNB392-5和CNB392-6 。然后，在等度的RP-HPLC上 對合并的活性級分(51. 7mg， HCT-116 < 0. 076 y g/mL)進(jìn)行色譜分析，采用流速為2mL/ 分鐘的85%甲醇作為洗脫液，并采用折射率檢測。采用流速為2mL/分鐘的乙酸乙酯 異辛烷(9 : 1)，在等度正相HPLC的硅膠上純化活性級分CNB392-5/6(7.6mg， HCT-116 < 0.076iig/mL)。分離出的鹽孢菌酰胺A(圖1)是無色的無定形固體，產(chǎn)率為每升 6. 7mg(6.4%)。在硅膠上進(jìn)行的TLC分析(二氯甲烷甲醇=9 : l)表明，鹽孢菌酰 胺A的rf = 0. 6，在256nm處無UV消光或熒光，采用H2S04/乙醇時是黃色，采用Godin試 劑(香蘭素/H2S04/HC104)時是暗紅棕色。鹽孢菌酰胺A可溶解于CHC13，甲醇，以及其它 極性溶劑如匿SO，丙酮，乙腈，苯，吡啶，N， N-二甲基甲酰胺和類似溶劑。^ NMR:(d「卩比 啶，300MHz) 1. 37/1. 66 (2H， m， CH2) ， 1. 70， 2. 29 (2H， m， CH2) ， 1. 91 (2H，寬，CH2) ， 2. 07 (3H， s， CH3) ，2. 32/2. 48(2H， ddd，3J = 7. OHz， CH2) ， 2. 85(1H，寬，m， CH) ， 3. 17(1H， dd，3J = lOHz， CH)，4.01/4. 13(2H，m，CH2)，4. 25(lH，d，3J = 9. OHz， CH) ， 4. 98 (1H，寬，OH) ， 5. 88， (1H， ddd， 3J = lOHz， CH)，6.41(lH，寬d，3j = lOHz， CH)10.62(1H， s， NH) 13C NMR/DEPT : (d5-妣啶， 400MHz) 176. 4(C00R) ， 169. O(CONH) ， 128. 8( = CH)，128.4( = CH) ， 86. 1 (Cq) ， 80. 2 (Cq)， 70. 9 (CH) ， 46. 2 (CH) ， 43. 2 (CH2) ， 39. 2 (CH) ， 29. 0 (CH2) ， 26. 5 (CH2) ， 25. 3 (CH2) ，21.7 (CH2)， 20. 0 (CH3) LC-MS (ESI) tr = 10. 0分鐘，流速0. 7mL/分鐘m/z : (M+H) +314， (M+Na) +336 ;片段: (M+H-C02)+29 2， (M+H-C02-H20)+270，252，204. CI圖樣(M+H， 100% )+314， (M+H， 30% )+316. LC MS(APCI) :tr= 11. 7分鐘，流速0. 5mL/分鐘，m/z : (M+H)+314，片段(M+H_C02-H20)+270， 252,232,216，160. CI圖樣(M+H，100 % )+314， (M+H，30 % )+316. EI :m/z :269,251,235， 217,204， 188(100% ) ， 160， 152， 138， 126， 110,81. FTMS-MALDI :m/z : (M+H)+314. 1144FT-IR : (cm—1) 2920， 2344， s， 1819m， 1702s， 1255， 1085s， 1020s， 797s.分子式C15H2。C1N04實(shí)施例2
生物活性分析試驗(yàn) 鹽孢菌酰胺A對人類結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的活性，IC50值為0.011 iig/mL(參 見圖4)。對抗細(xì)菌或抗真菌活性的篩選表明沒有明顯的活性，參見表l。表l分析試 驗(yàn) 鹽孢菌酰胺A的 IC50 (ii g/mL)
HCT-116 0. Oll白色念珠菌 250白色念珠菌(耐兩
性霉素 NSA*B)金黃色葡萄球菌(耐甲 NSA*氧西林)尿腸球菌(耐萬
古霉素) NSA*NSA* =無明顯活性
實(shí)施例3
絕對立體化學(xué)的測定 結(jié)構(gòu)I的化合物從乙酸乙酯/異辛烷中結(jié)晶，得到單個立方晶體，其作為單斜晶系 P2(l)進(jìn)行衍射。3009 A不尋常的大單胞體積內(nèi)容納了四個獨(dú)立的分子，其中對柔性氯乙 基取代基，觀察到不同的構(gòu)象位置。從氯取代基的衍射各向異性，指定絕對結(jié)構(gòu)，分辨出鹽 孢菌酰胺A的絕對立體化學(xué)為2R，3S，4R，5S，6S(圖16和17)， Flack參數(shù)為0. 01，而esd為 0. 03。 盡管參照上述實(shí)施例，對本發(fā)明展開了描述，但應(yīng)該理解，修飾和改變均落入本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受限于所附權(quán)利要求書。
權(quán)利要求
一種藥物組合物，其包含具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、鹵素、氨基、酰胺基、羧基、-C(O)H、?；⒀貂；被姿狨?、磺酰基、氨磺?；蝽炕?；每個R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E1至E4各自獨(dú)立地為-O、-NR5或-S，其中R5為-H或C1-6烷基；以及X為0至8。FSA00000064181700011.tif
2.權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中&是_H、 C卜4烷基、取代(V12烷基、C2—12鏈烯基、取代C2—12鏈烯基、C2—12炔基、取代C2—12 炔基、C6—14芳基、取代C6—14芳基、C3—14雜芳基、取代C3—14雜芳基、C3—14雜環(huán)基、取代C3—14雜環(huán) 基、C3—8環(huán)烷基、取代C3—8環(huán)烷基、(V12烷氧基、取代12烷氧基、硫代C卜12烷基、取代硫代 (V12烷基、羥基、卣素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、?；?、氧?；?、氨基甲酸酷、磺?；?、氨磺 ?；蝽炕?；其中，當(dāng)&是取代(V12烷基時，(V12烷基可以進(jìn)一步攜帶一個或更多個取代基，所述取代基選自c卜12烷氧基、巰基丄3—8環(huán)烷基、取代c3—8環(huán)烷基丄3—14雜環(huán)基、取代c3—14雜環(huán)基、 c6—14芳基、取代c6—14芳基、c3—14雜芳基、取代c3—14雜芳基、芳氧基、取代芳氧基、氰基、硝基、氦基、酰胺基、-C(0)H、?；⒀貂；?、羧基、磺?；?、氨磺酰和砜基；R2是-H、 C卜12烷基、取代(V12烷基、C2—12鏈烯基、取代C2—12鏈烯基、C2—12炔基、取代C2—12 炔基、C6—14芳基、取代C6—14芳基、C3—14雜芳基、取代C3—14雜芳基、C3—14雜環(huán)基、取代C3—14雜環(huán)基、c3—8環(huán)烷基、取代c3—8環(huán)烷基、cv12烷氧基、取代12烷氧基、硫代c卜12烷基、取代硫代(V12烷基、羥基、卣素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酷、磺?；?、氨磺 酰或砜基；R3是-H、 C卜12烷基、取代(V12烷基、C2—12鏈烯基、取代C2—12鏈烯基、C2—12炔基、取代C2—12 炔基、C6—14芳基、取代C6—14芳基、C3—14雜芳基、取代C3—14雜芳基、C3—14雜環(huán)基、取代C3—14雜環(huán)基、c3—8環(huán)烷基、取代c3—8環(huán)烷基、cv12烷氧基、取代12烷氧基、硫代c卜12烷基、取代硫代(V12烷基、羥基、卣素、氨基、酰胺基、羧基、-C(0)H、?；⒀貂；?、氨基甲酸酷、磺酰基、氨磺、射?；蝽炕缓炭诟鱎4獨(dú)立為C卜12烷基、取代(V12烷基、C2—12鏈烯基、取代C2—12鏈烯基、C2—12炔基、取代 C2—12炔基、C6—14芳基、取代C6—14芳基、C3—8環(huán)烷基或取代C3—8環(huán)烷基。
3. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中E3和E4為-0，及E2為-NH。
4. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，&和R2為-H.烷基或取代烷基，和R3為羥基或烷氧基。
5. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中&為取代烷基。
6. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述的取代烷基為卣化烷基。
7. 權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中所述的鹵化烷基為氯化烷基。
8. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述化合物具有化合物(V)的結(jié)構(gòu)
9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含蔗糖。
10. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是固體形式。
11. 權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是無菌注射溶液的 形式。
12. 權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述無菌注射溶液是無菌注射水性溶液。
13. 權(quán)利要求l-8任一項(xiàng)所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含至少一種額外的抗腫瘤劑。
14. 權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述抗腫瘤劑包括抗代謝物、烷基化試劑、植 物生物堿、抗生素、激素或酶。
15. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述抗代謝物選自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、 6-氫硫基嘌呤、阿糖胞苷、羥基脲、以及2-氯脫氧腺苷。
16. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述烷基化試劑選自環(huán)磷酰胺、美法侖、白消 安、伯爾定、苯丁酸氮芥、以及氮芥。
17. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述植物生物堿選自長春新堿、長春花堿、紫 杉醇、以及足葉乙甙。
18. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述抗生素選自亞德里亞霉素(阿霉素)、道 諾霉素、絲裂霉素c、以及博來霉素。
19. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述激素選自卡普睪酮、diomostavolone、丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)脂、三苯氧胺、聚磷酸雌二醇、醋酸甲地孕酮、氟他胺、尼魯米 特、以及trilotane。
20. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中所述酶選自左旋門冬酰胺酶衍生物和氨基吖 啶衍生物。
21. 權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述氨基吖啶衍生物是安吖啶。
22. 權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備用于治療哺乳動物細(xì)胞增生疾病 的藥物中的用途。
23. 權(quán)利要求22所述的用途，其中所述哺乳動物細(xì)胞是人的。
24. 權(quán)利要求22所述的用途，其中所述疾病的特征是腫瘤形成。
25. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述腫瘤選自乳腺腫瘤，小細(xì)胞肺部腫瘤，非小細(xì)胞 肺部腫瘤，結(jié)直腸腫瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，卵巢腫瘤，前列 腺腫瘤，軟組織或骨肉瘤，頭頸部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏病在內(nèi)的胃癌，胃部腫瘤， 骨髓瘤，膀胱腫瘤，腎部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏及何杰金氏病在內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌性 腫瘤。
26. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述腫瘤是結(jié)直腸腫瘤。
27. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述腫瘤是骨髓瘤。
28. 權(quán)利要求22所述的用途，其中向個體口服給藥有效量的所述藥物組合物。
29. 權(quán)利要求22所述的用途，其中向個體腸胃外給藥有效量的所述藥物組合物。
30. 權(quán)利要求29所述的用途，其中所述藥物組合物通過皮下、靜脈內(nèi)、肌肉或腦池內(nèi)注 射進(jìn)行給藥。
31. 權(quán)利要求22所述的用途，其中向個體舌下給藥、口腔給藥、鼻腔給藥、局部給藥、或 者直腸給藥有效量的所述藥物組合物。
32. 具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物在制備用于治療頑固癌的藥物中的用途<formula>formula see original document page 4</formula>其中&至R3各自獨(dú)立地為-&烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、 芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取 代烷氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、卣素、氨基、酰肢基、羧基、-C(0)H、?；⒀貂；被?甲酸酯、磺酰基、氨磺酰或砜基；每個R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立地為-0、 -NR5或-S，其中R5為-H或C"烷基；以及X為0至8。
33.具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物在制備用于治療小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、軟組織瘤、骨肉瘤、頭 部癌癥、頸癌、胃癌、甲狀腺癌、何杰金氏病、非何杰金氏病、胃部腫瘤、骨髓瘤、膀胱癌或神經(jīng)內(nèi)分泌性癌的藥物中的用途<formula>formula see original document page 5</formula>其中&至R3各自獨(dú)立地為-&烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、 芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取 代烷氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、卣素、氨基、酰肢基、羧基、-C(0)H、?；?、氧?；?、氨基 甲酸酯、磺酰基、氨磺?；蝽炕幻總€R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立地為-0、 -NR5或-S，其中R5為-H或C"烷基；以及 X為0至8。
34.具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物在制備與至少一種額外的抗腫瘤劑聯(lián)合、用于治療哺乳動 物細(xì)胞增生疾病的藥物中的用途<formula>formula see original document page 5</formula>其中，&至R3各自獨(dú)立地為-&烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、 芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取 代烷氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、卣素、氨基、酰肢基、羧基、-C(0)H、?；⒀貂；?、氨基 甲酸酯、磺?；?、氨磺?；蝽炕?；每個R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立地為-0、 -NR5或-S，其中R5為-H或烷基；以及 X為0至8。
35. 權(quán)利要求34所述的用途，其中所述抗腫瘤劑包括抗代謝物、烷基化試劑、植物生物 堿、抗生素、激素或酶。
36. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述抗代謝物選白氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-氫硫基 嘌呤、阿糖胞苷、羥基脲、以及2-氯脫氧腺苷。
37. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述烷基化試劑選自環(huán)磷酰胺、美法侖、白消安、伯 爾定、苯丁酸氮芥、以及氮芥。
38. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述植物生物堿選自長春新堿、長春花堿、紫杉醇、 以及足葉乙甙。
39. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述抗生素選自亞德里亞霉素(阿霉素)、道諾霉 素、絲裂霉素c、以及博來霉素。
40. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述激素選自卡普睪酮、diomostavolone、丙酸酯、 環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)脂、三苯氧胺、聚磷酸雌二醇、醋酸甲地孕酮、氟他胺、尼魯米特、以 及trilotane。
41. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述酶選自左旋門冬酰胺酶衍生物和氨基吖啶衍生物。
42. 權(quán)利要求41所述的用途，其中所述氨基吖啶衍生物是安吖啶。
43. 制備具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物的方法，亂(I)其包括(a) 發(fā)酵海洋放線菌菌株；(b) 通過吸附到樹脂，從所述放線菌菌株分離有機(jī)代謝物；禾口 (C)通過色譜分離具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物；其中&至R3各自獨(dú)立地為-&烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、 取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取代烷 氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、卣素、氨基、酰胺基、幾基、-C(0)H、?；?、氧?；被姿?酯、磺?；被酋；蝽炕幻總€R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳 基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立地為-0、 -NR5或-S，其中R5為-H或烷基；以及 X為0至8。
44.制品，其包括包裝材料和裝在所述包裝材料內(nèi)的藥物組合物，其中所述包裝材料包 括指明所述藥物組合物可用于治療細(xì)胞增生性疾病的標(biāo)簽，以及其中所述藥物組合物包括 至少一種具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物<formula>formula see original document page 7</formula>其中&至R3各自獨(dú)立地為-&烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、 取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環(huán)基、取代雜環(huán)基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、烷氧基、取代烷 氧基、硫烷基、取代硫烷基、羥基、卣素、氨基、酰胺基、幾基、-C(0)H、?；?、氧?；被姿?酯、磺酰基、氨磺?；蝽炕?；每個R4獨(dú)立地為烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳 基、環(huán)烷基或取代環(huán)烷基；E工至E4各自獨(dú)立地為-0、 -NR5或-S，其中R5為-H或烷基；以及X為0至8。
45. 權(quán)利要求44所述的制品，其中所述細(xì)胞增生性疾病是結(jié)腸癌。
46. 權(quán)利要求44所述的制品，其中所述細(xì)胞增生性疾病是骨髓瘤。
47. 權(quán)利要求44所述的制品，其中所述細(xì)胞增生性疾病是頑固癌。
全文摘要
本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的某些發(fā)酵產(chǎn)物是高增生性哺乳動物細(xì)胞的有效抑制劑。CNB392和CNB476菌株存在于小單孢菌科中，而且鹽孢菌這一屬名已經(jīng)被提議用于這種專性海洋族群。由這種菌株產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物被歸為鹽孢菌酰胺，在治療腫瘤疾病方面特別有效，這是由于其具有低分子量、低IC50值、高藥效，以及癌細(xì)胞對真菌的選擇性。
文檔編號C07D491/04GK101791306SQ20101014548
公開日2010年8月4日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者P·R·詹森, R·H·R·費(fèi)林格, T·J·明瑟, W·H·費(fèi)尼科 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會