專利名稱：一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈及鎖定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA雙鏈，具體涉及一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈。

背景技術(shù)：
干擾RNA(RNAi，或siRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種抑制基因表達(dá)的小RNA。RNAi的作用機(jī)制可以分為四步首先，dsRNA被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識(shí)別并被切割成含有21～23堿基的小片斷，即siRNA，上述特殊的核酸內(nèi)切酶在果蠅中稱為Dicer，Dicer同時(shí)具有RNaseIII功能、解旋酶功能以及dsRNA結(jié)合區(qū)和PAZ結(jié)合區(qū)，它可以識(shí)別長(zhǎng)鏈dsRNA并將其加工成siRNA；其次，被加工成的siRNAs或?qū)爰?xì)胞的人工合成的siRNAs形成沒(méi)有活性的核蛋白復(fù)合體；第三，在ATP依賴的解旋酶的作用下形成具有活性的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，ATP用以保證siRNAs 5’端的磷酸化；第四，非ATP依賴的過(guò)程，RISC特異性的與細(xì)胞內(nèi)的同源mRNA結(jié)合后，mRNA與dsRNA中的反義鏈交換，原先siRNAs中的正義鏈被mRNA代替，mRNA隨即被切割。切割部位大約位于siRNA結(jié)合的中部，于是mRNA片斷由于缺少poly(A)尾或穩(wěn)定的帽子結(jié)構(gòu)而很快被降解，最終導(dǎo)致基因沉默。
siRNA的化學(xué)穩(wěn)定性差不是由于其在雙鏈形式下被降解，而是由于在雙鏈—單鏈的雜交—解旋平衡中，其單鏈形式被RNase酶降解造成的。根據(jù)以上原理，用非核酸分子將兩條siRNA鏈的兩端分別連接起來(lái)，將siRNA雙鏈鎖定，siRNA雙鏈就不易解旋降解，從而可以改善siRNA雙鏈的化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間。在細(xì)胞內(nèi)，可以利用細(xì)胞內(nèi)存在的Dicer酶釋放被鎖定的siRNA，對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制。但是，已有的修飾和連接方法對(duì)siRNA的穩(wěn)定性的改進(jìn)十分有限?，F(xiàn)有的siRNA仍存在化學(xué)穩(wěn)定性差、血液容留時(shí)間短等缺陷。
從化學(xué)活性角度看，烷烴是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)之一。尤其在機(jī)體內(nèi)它們可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶的水解，對(duì)生理環(huán)境的氧化、還原、取代、消除、加成等反應(yīng)及廣泛的pH環(huán)境均可耐受。從生物學(xué)的角度看，由于烷烴親脂性，膜透性非常好，因此設(shè)計(jì)合成烷烴鎖定siRNA將是提高siRNA穩(wěn)定性和活性的理想途徑。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，該siRNA雙鏈的兩條單鏈的兩端分別通過(guò)烷烴連接，兩條單鏈至少80％互補(bǔ)，其結(jié)構(gòu)如通式1所示
其中，N表示為核苷酸；n為1-6的整數(shù)；所述siRNA雙鏈可以為常規(guī)的各種具有干擾靶基因表達(dá)功能的siRNA雙鏈。
優(yōu)選地，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-50個(gè)堿基； 更優(yōu)選地，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-30個(gè)堿基。
本發(fā)明還涉及一種用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法，該方法包括如下步驟 1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列； 2)制備選自通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體；

其中，n優(yōu)選1-6的整數(shù)；n1和n2優(yōu)選1-3的整數(shù)；B為天然的或非天然的核苷堿基，所述天然的或非天然的核苷堿基可以帶有常見(jiàn)的保護(hù)基； 3)通過(guò)固相合成的方式，合成需要被鎖定的siRNA，并在合成過(guò)程中將通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體連接到兩條siRNA鏈的3’端和5`端，使每條siRNA鏈的3’端和5`端都含有一個(gè)末端雙鍵； 4)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，即用烷烴鏈將兩條siRNA鏈鎖定。本發(fā)明用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法的示意圖如圖1所示。
優(yōu)選地，所述通式2選自如下結(jié)構(gòu)中的一種


其中，R為H或常見(jiàn)的氨基保護(hù)基，諸如苯甲酰基、異丙?；蛞阴；?；n優(yōu)選1-6的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述通式3選自如下結(jié)構(gòu)中的一種


其中，R為H或常見(jiàn)的氨基保護(hù)基，諸如苯甲?；?、異丙?；蛞阴；龋籲優(yōu)選1-6的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述通式4選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或常見(jiàn)的氨基保護(hù)基，諸如苯甲?；惐；蛞阴；?；n1和n2優(yōu)選1-3的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述通式5選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或常見(jiàn)的氨基保護(hù)基，諸如苯甲?；惐；蛞阴；?；n1和n2優(yōu)選1-3的整數(shù)。
步驟2)中，通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體的合成路線如圖2所示，其制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008。
步驟3)中，固相合成的方式參考Current Protocols in NucleicAcid Chemistry(Chapter3 and Chapter 4)。
步驟4)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將固相合成的siRNA(1摩爾)溶于DMSO中，加入Grubbs催化劑(0.05摩爾)，常溫下攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，采用本領(lǐng)域常用的技術(shù)手段先將粗產(chǎn)物經(jīng)NAP-10凝膠柱脫鹽，然后再用HPLC純化。
本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果 (1)本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了2`-或3`-位修飾的核苷單體，其制備方法簡(jiǎn)單，不需要苛刻的反應(yīng)條件和復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。
(2)本發(fā)明采用化學(xué)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的烷烴鎖定siRNA雙鏈，該siRNA雙鏈具有良好的親脂性和膜透性，在機(jī)體內(nèi)可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等的水解，對(duì)生理環(huán)境的氧化、還原、取代、消除、加成等反應(yīng)及廣泛的pH環(huán)境均可耐受。
(3)本發(fā)明利用Grubbs催化劑進(jìn)行偶聯(lián)鎖定，反應(yīng)簡(jiǎn)單易行。
(4)通過(guò)本發(fā)明的方法鎖定的siRNA雙鏈，其化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間均得到明顯的改善，而且容易透過(guò)細(xì)胞膜。被烷烴鎖定的siRNA進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)存在的Dicer酶的剪切和加工后釋放被鎖定的siRNA，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制。



圖1為本發(fā)明鎖定siRNA的方法的示意圖； 圖2為通式2、通式3、通式4或通式5所示核苷單體的合成路線。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1用烷烴鎖定的siRNA雙鏈及鎖定方法 1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列 選擇GAPDH(Genbank登記號(hào)為NC_000012)為靶基因，設(shè)計(jì)siRNA，其對(duì)應(yīng)于NC_000012的位置為2700-2718bp； 正義鏈5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3`； 反義鏈5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3`； 2)制備選自通式2和通式3所示的核苷單體
制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008； 3)固相合成siRNA
4)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，將兩條siRNA鏈鎖定
實(shí)施例2用烷烴鎖定的siRNA雙鏈及鎖定方法 1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列 選擇GAPDH(Genbank登記號(hào)為NC_000012)為靶基因，設(shè)計(jì)siRNA，其對(duì)應(yīng)于NC_000012的位置為2700-2718bp； 正義鏈5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3`； 反義鏈5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3`； 2)制備選自通式4和通式5所示的核苷單體
制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008； 3)固相合成siRNA
4)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，將兩條siRNA鏈鎖定
實(shí)施例3實(shí)施例1和2制備的用烷基鎖定的siRNA雙鏈的穩(wěn)定性 將未鎖定的siRNA雙鏈和實(shí)施例1、2制得的用烷基鎖定的siRNA雙鏈分別在10％的血清中孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h，進(jìn)行20％PAGE電泳，以觀察上述siRNA雙鏈在血清中的穩(wěn)定性。
結(jié)果表明未鎖定的siRNA雙鏈在血清中孵育30min時(shí)明顯降解，6h時(shí)完全降解，而實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的用烷基鎖定的siRNA雙鏈在24h內(nèi)未觀察到明顯降解。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例2制備的用烷基鎖定的siRNA雙鏈在36h時(shí)開(kāi)始降解，72h后降解明顯，而實(shí)施例1制備的用烷基鎖定的siRNA雙鏈?zhǔn)冀K未觀察到明顯降解。
顯然，本發(fā)明用烷基鎖定的siRNA雙鏈的化學(xué)穩(wěn)定性很好，血液容留時(shí)間較長(zhǎng)。
實(shí)施例4體內(nèi)(胞內(nèi))抑制靶基因活性作用 培養(yǎng)HEK293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞系)，分別用未鎖定的siRNA雙鏈和實(shí)施例1、2制得的用烷基鎖定的siRNA雙鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)中HEK293細(xì)胞GAPDH基因mRNA的表達(dá)量，以未轉(zhuǎn)染siRNA的HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
結(jié)果表明未鎖定的siRNA對(duì)GAPDH的抑制率為91％，實(shí)施例1中鎖定的siRNA的抑制率為93％，實(shí)施例2中鎖定的siRNA的抑制率為89％，說(shuō)明用本發(fā)明的方法鎖定的siRNA雙鏈，其活性作用與未鎖定的siRNA雙鏈相比，沒(méi)有顯著性差異。
權(quán)利要求
1.一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，其特征在于，該siRNA雙鏈的兩條單鏈的兩端分別通過(guò)烷烴連接，兩條單鏈至少80％互補(bǔ)，其結(jié)構(gòu)如通式1所示
其中，N表示為核苷酸；n為1-6的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，其特征在于，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-50個(gè)堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，其特征在于，所述siRNA雙鏈的每條單鏈含19-30個(gè)堿基。
4.一種用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法，其特征在于，包括如下步驟
1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列；
2)制備選自通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體；
其中，n為1-6的整數(shù)；n1和n2為1-3的整數(shù)；B為天然的或非天然的核苷堿基，所述天然的或非天然的核苷堿基帶有或不帶有保護(hù)基；
3)通過(guò)固相合成的方式，合成需要被鎖定的siRNA，并在合成過(guò)程中將通式2、通式3、通式4或通式5所示的核苷單體連接到兩條siRNA鏈的3’端和5`端；
4)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，將兩條siRNA鏈鎖定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式2選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；n為1-6的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式3選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；n為1-6的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式4選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；n1和n2為1-3的整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述通式5選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；n1和n2為1-3的整數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；?、異丙?；蛞阴；?。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用烷烴鎖定的siRNA雙鏈，該siRNA雙鏈的兩條單鏈的兩端分別通過(guò)烷烴連接，兩條單鏈至少80％互補(bǔ)。該siRNA雙鏈具有良好的親脂性和膜透性，在機(jī)體內(nèi)可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等的水解，對(duì)生理環(huán)境的氧化、還原、取代、消除、加成等反應(yīng)及廣泛的pH環(huán)境均可耐受。本發(fā)明還涉及用烷烴鎖定siRNA雙鏈的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法鎖定的siRNA雙鏈，其化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間均得到明顯的改善。
文檔編號(hào)C07H1/00GK101824062SQ20101014990
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者高源 , 劉迎春 申請(qǐng)人:北京歐凱納斯科技有限公司