專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用烷基修飾的核酸及其修飾方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸，具體涉及一種用烷基修飾的核酸及其化學(xué)修飾方法，以及該方法在提高反義核酸和siRNA穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
反義核酸是指與靶DNA或RNA堿基互補(bǔ)，并能與之結(jié)合的一段DNA或RNA。反義核酸技術(shù)是指利用反義核酸特異地抑制某些基因的表達(dá)。1978年，Paul等利用一段反義DNA寡聚核苷酸鏈成功地抑制了勞斯(Rous)肉瘤病毒的復(fù)制，引起人們極大的關(guān)注。20世紀(jì)80年代，隨著寡核苷酸人工合成技術(shù)的成功，反義核酸的研究快速發(fā)展起來(lái)，使反義技術(shù)在抗腫瘤、抗病毒以及細(xì)胞凋亡機(jī)理、信號(hào)傳遞機(jī)制等方面取得了一定的進(jìn)展。反義核酸技術(shù)在發(fā)展過(guò)程還存在種種困難，但可以相信反義技術(shù)必將成為人類(lèi)研究和治療病毒病、腫瘤乃至各生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)不可或缺的手段。
RNA干擾(RNAi)是具有同源序列的雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，這一技術(shù)已成為分子生物學(xué)家分析基因組功能和基因治療的一個(gè)有力工具。siRNA(小干擾RNA)是RNAi的效應(yīng)分子，由兩條互補(bǔ)的RNA單鏈構(gòu)成，長(zhǎng)21～23個(gè)核苷酸(nt)。siRNA雙鏈中和信使RNA(mRNA)的靶向序列相同的鏈稱(chēng)為正義鏈，與之互補(bǔ)的另一條鏈為反義鏈。siRNA包括5′-磷酸末端、19nt的雙鏈區(qū)、3′-羥基末端和2個(gè)不配對(duì)的3′端核苷酸突起。
從原理上來(lái)說(shuō)，RNAi藥品的研發(fā)將會(huì)比現(xiàn)存藥品更有效率，同時(shí)RNAi藥品可能治愈那些現(xiàn)存藥品難以治療的疾病。因此，RNAi藥品將能夠以前所未有的速度填補(bǔ)現(xiàn)存醫(yī)療不能實(shí)現(xiàn)的需求。另外，目前市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大的抗體藥是利用細(xì)胞制作而來(lái)的，而siRNA卻可以通過(guò)化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)，所以RNAi藥品的生產(chǎn)成本可能會(huì)比抗體藥更低。同時(shí)通過(guò)高效開(kāi)發(fā)可以降低開(kāi)發(fā)成本，結(jié)合這些因素綜合考慮，RNAi藥品的總價(jià)格將比抗體藥要低。如果RNAi藥品研發(fā)成功實(shí)現(xiàn)上市，或許會(huì)得到比抗體藥更加廣泛的應(yīng)用。
單鏈寡核苷酸片段，尤其是RNA易形成多種如發(fā)卡(hairpin)，莖-環(huán)(stem-loop)、G-四聚體(G-tetramer)、假節(jié)(pseudoknot)、鼓包(bulge)等熱力學(xué)上非常穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，在溶液中是各種構(gòu)象的組合體，而不是生物活性相關(guān)的單一構(gòu)象，因此與靶分子相互作用的能力大大降低。理論上，如果能人為的控制寡核苷酸的空間結(jié)構(gòu)，不僅能減少構(gòu)象不均一性，還能夠增強(qiáng)抗酶解的能力。
然而，未經(jīng)修飾的寡核苷酸在體內(nèi)是不穩(wěn)定的，尤其是RNA鏈，其2`-OH在核酶降解過(guò)程中參與對(duì)3`-磷酸二酯鍵的親核進(jìn)攻，被降解的半衰期只有幾秒到幾分鐘。siRNA的化學(xué)穩(wěn)定性差不是由于其在雙鏈形式下被降解，而是由于在雙鏈—單鏈的雜交—解旋平衡中，其單鏈形式被RNase酶降解造成的。因此改進(jìn)寡核苷酸在體內(nèi)的生物穩(wěn)定性是其作為藥物研究的一個(gè)主要方向，基本概念是限制底物與酶的相互作用，通常的做法是對(duì)核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。核苷酸的糖環(huán)、堿基和磷酸骨架都可以成為修飾位點(diǎn)。但是，已有的修飾方法對(duì)siRNA的穩(wěn)定性的改進(jìn)十分有限。
2009年3月，美國(guó)OPKO HEALTH公司宣布停止RNAi候選藥品“bevasiranib”的臨床試驗(yàn)。該公司表示，藥品本身并不存在安全方面的重大問(wèn)題，而是因?yàn)樵撍幤返闹饕煞帧猻iRNA很容易在體內(nèi)被分解，siRNA的不穩(wěn)定性是研發(fā)被迫停止的重要原因之一。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的核酸。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種使核酸穩(wěn)定的化學(xué)修飾方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提高反義核酸的穩(wěn)定性。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提高siRNA雙鏈的穩(wěn)定性。
為了解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明涉及一種用烷基修飾的核酸，其結(jié)構(gòu)如通式1、通式2、通式3或通式4所示
其中，N表示核苷酸，由5-50個(gè)堿基組成；n為1-6的整數(shù)，n1和n2為1-3的整數(shù)，烷基在核酸鏈上摻雜的距離為2-10個(gè)堿基。
為了解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還涉及一種核酸的化學(xué)修飾方法，該方法可通過(guò)構(gòu)象控制來(lái)提高核酸的穩(wěn)定性。
所述核酸的化學(xué)修飾方法包括如下步驟 1)制備通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體
其中，n為1-6的整數(shù)；n1和n2為1-3的整數(shù)；B為天然的或非天然的核苷堿基，所述天然的或非天然的核苷堿基帶有或者不帶有保護(hù)基； 2)通過(guò)固相合成的方式，合成需要修飾的核酸鏈，并在合成過(guò)程中將兩個(gè)選自通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體摻雜到核酸鏈中；摻雜的位置可以根據(jù)核酸鏈的不同進(jìn)行優(yōu)化； 3)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，將側(cè)鏈烯烴偶聯(lián)成烷烴鏈，從而達(dá)到控制和穩(wěn)定寡核苷酸構(gòu)象的目的。
本發(fā)明提高核酸穩(wěn)定性的化學(xué)修飾方法的示意圖見(jiàn)圖1。
優(yōu)選的，所述通式5選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；?、異丙?；蛞阴；?；n為1-6的整數(shù)。
優(yōu)選的，所述通式6選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；惐；蛞阴；?；n為1-6的整數(shù)。
優(yōu)選的，所述通式7選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；惐；蛞阴；?；n1和n2為1-3的整數(shù)。
優(yōu)選的，所述通式8選自如下結(jié)構(gòu)中的一種

其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；惐；蛞阴；?；n1和n2為1-3的整數(shù)。
步驟2)中，通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體的合成路線(xiàn)如圖2所示，其制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008。
步驟3)中，固相合成的方式參考Current Protocols in NucleicAcid Chemistry(Chapter3 and Chapter 4)。
步驟4)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將固相合成的siRNA(1摩爾)溶于DMSO中，加入Grubbs催化劑(0.05摩爾)，常溫下攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，采用本領(lǐng)域常用的技術(shù)手段先將粗產(chǎn)物經(jīng)NAP-10凝膠柱脫鹽，然后再用HPLC純化。
為了解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還涉及核酸的化學(xué)修飾方法在提高反義核酸穩(wěn)定性中的應(yīng)用。
為了解決上述第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還涉及核酸的化學(xué)修飾方法在提高siRNA穩(wěn)定性中的應(yīng)用。該應(yīng)用采用如下方法進(jìn)行 1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列； 2)制備通式5、通式6、通式7或通式8所示的含末端雙鍵的核苷單體； 3)固相合成siRNA的正義鏈和反義鏈，并在合成過(guò)程中將兩個(gè)選自通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體摻雜到siRNA的正義鏈或反義鏈中；摻雜的位置可以根據(jù)核酸鏈的不同進(jìn)行優(yōu)化； 4)退火雜交形成siRNA雙鏈； 5)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，固定siRNA鏈的構(gòu)象。
其中，所述siRNA的正義鏈和反義鏈至少80％互補(bǔ)；所述siRNA的正義鏈和反義鏈各含19-50個(gè)堿基；優(yōu)選地，所述siRNA的正義鏈和反義鏈各含19-30個(gè)堿基。
步驟2)中，通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體的合成路線(xiàn)如圖2所示，其制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)J.Org.Chem，Vol.73，No.1，2008。
步驟3)中，固相合成的方式參考Current Protocols in NucleicAcid Chemistry(Chapter3 and Chapter 4)。
步驟4)中，將固相合成的正義鏈和反義鏈溶于pH為7.0的TBE緩沖液中，90℃加熱5min，緩慢冷卻至室溫，加入兩倍體積的乙醇，離心，棄上清液，所得沉淀即為雜交形成的siRNA雙鏈。
步驟5)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將固相合成的siRNA(1摩爾)溶于DMSO中，加入Grubbs催化劑(0.05摩爾)，常溫下攪拌48h。反應(yīng)結(jié)束后，采用本領(lǐng)域常用的技術(shù)手段先將粗產(chǎn)物經(jīng)NAP-10凝膠柱脫鹽，然后再用HPLC純化。
本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果 (1)本發(fā)明所用的核苷單體制備方法簡(jiǎn)單，不需要苛刻的反應(yīng)條件和復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。
(2)本發(fā)明利用Grubbs催化劑進(jìn)行偶聯(lián)固定，反應(yīng)簡(jiǎn)單易行。
(3)本發(fā)明所提供的核酸的化學(xué)修飾方法是通過(guò)構(gòu)象控制來(lái)提高整個(gè)核酸鏈的穩(wěn)定性和活性，避免了針對(duì)單一的核苷單體進(jìn)行修飾的局部性。
(4)本發(fā)明采用烷烴修飾的核酸鏈的構(gòu)象穩(wěn)定，具有良好的親脂性和膜透性，在機(jī)體內(nèi)可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等各種酶的水解，對(duì)生理環(huán)境的氧化、還原、取代、消除、加成等反應(yīng)及廣泛的pH環(huán)境均可耐受。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成烷烴固定的核酸是提高核酸穩(wěn)定性和活性的理想途徑。
(5)經(jīng)本發(fā)明的化學(xué)修飾方法所修飾的反義寡核苷酸鏈，其化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間均得到明顯的改善。
(6)經(jīng)本發(fā)明的化學(xué)修飾方法所修飾的siRNA鏈，其化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間均得到明顯的改善。



圖1為提高核酸穩(wěn)定性的化學(xué)修飾方法示意圖； 圖2為通式5、通式6、通式7或通式8所示核苷單體的合成路線(xiàn)。

具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 腫瘤細(xì)胞端粒酶RNA有11個(gè)核苷酸，將其作為模板設(shè)計(jì)此段核苷酸的反義寡核苷酸序列 反義序列5`-GTT AGG GTT AGA CAA AAA AT-3` (1)制備選自通式5和通式6所示的核苷單體
(2)通過(guò)常規(guī)的固相合成方法，合成寡核苷酸鏈，并在合成過(guò)程中將核苷單體摻雜到寡核苷酸鏈的中；
(3)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，將側(cè)鏈烯烴偶聯(lián)成烷烴鏈。

實(shí)施例2 根據(jù)乙型肝炎的基因U5樣序列，設(shè)計(jì)此段核苷酸的反義寡核苷酸序列 反義序列5`-CAT GCC CCA AAG CCA C-3` (1)制備選自通式7和通式8所示的核苷單體
(2)通過(guò)常規(guī)的固相合成方法，合成寡核苷酸鏈，并在合成過(guò)程中將核苷單體摻雜到寡核苷酸鏈的中；
(3)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，將側(cè)鏈烯烴偶聯(lián)成烷烴鏈。

實(shí)施例3 本發(fā)明的化學(xué)修飾方法在提高siRNA穩(wěn)定性中的應(yīng)用 (1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列選擇GAPDH(Genbank登記號(hào)為NC_000012)為靶基因，設(shè)計(jì)siRNA，其對(duì)應(yīng)于NC_000012的位置為2700-2718bp； 正義鏈5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3` 反義鏈5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3` (2)制備選自通式5和通式6所示的核苷單體
(3)固相合成siRNA的正義鏈和反義鏈 正義鏈
反義鏈3`-TT CAU ACU GUU GUC GGA GUU C-5` (4)退火雜交形成siRNA雙鏈
(5)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，固定siRNA鏈的構(gòu)象。

實(shí)施例4本發(fā)明的化學(xué)修飾方法在提高siRNA穩(wěn)定性中的應(yīng)用 (1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列選擇GAPDH(Genbank登記號(hào)為NC_000012)為靶基因，設(shè)計(jì)siRNA， 其對(duì)應(yīng)于NC_000012的位置為2700-2718bp。
正義鏈5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3` 反義鏈5`-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3` (2)制備選自通式7和通式8所示的核苷單體
(3)固相合成siRNA的正義鏈和反義鏈 正義鏈5`-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3` 反義鏈
(4)退火雜交形成siRNA雙鏈
(5)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，固定siRNA鏈的構(gòu)象。

實(shí)施例5實(shí)施例1制備的反義寡核苷酸的穩(wěn)定性 將未修飾的反義寡核苷酸和實(shí)施例1制得的反義寡核苷酸分別在10％的血清中孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h后進(jìn)行20％PAGE電泳，觀察反義寡核苷酸在血清中的穩(wěn)定性。
結(jié)果表明未修飾的反義寡核苷酸在血清中孵育30min就明顯降解，3h時(shí)完全降解，而實(shí)施例1中修飾的反義寡核苷酸在24h內(nèi)未觀察到明顯降解。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例1中修飾后的反義寡核苷酸在48h時(shí)開(kāi)始明顯降解。
顯然，反義寡核苷酸的化學(xué)穩(wěn)定性得到了顯著提高。
實(shí)施例6實(shí)施例2制備的反義寡核苷酸的穩(wěn)定性 將未修飾的反義寡核苷酸和實(shí)施例2制得的反義寡核苷酸分別在10％的血清中孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h后進(jìn)行20％PAGE電泳，觀察反義寡核苷酸在血清中的穩(wěn)定性。
結(jié)果表明未修飾的反義寡核苷酸在血清中孵育30min就明顯降解，2h時(shí)完全降解，而實(shí)施例2中修飾的反義寡核苷酸在24h內(nèi)未觀察到明顯降解。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例2中修飾后的反義寡核苷酸在48h時(shí)開(kāi)始明顯降解。
實(shí)施例7實(shí)施例3和4制備的siRNA的穩(wěn)定性 將未修飾的siRNA和實(shí)施例3、4制得的siRNA分別在10％的血清中孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h后進(jìn)行20％PAGE電泳，觀察siRNA在血清中的穩(wěn)定性。
結(jié)果表明未修飾的siRNA在血清中孵育30min就明顯降解，6h時(shí)完全降解，而實(shí)施例3和實(shí)施例4中修飾的siRNA在24h內(nèi)未觀察到明顯降解。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例3和實(shí)施例4中修飾的siRNA在36h時(shí)開(kāi)始降解，72h后降解明顯。
顯然，siRNA的化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間得到了顯著提高。
權(quán)利要求
1.一種用烷基修飾的核酸，其結(jié)構(gòu)如通式1、通式2、通式3或通式4所示
其中，N表示核苷酸，由5-50個(gè)堿基組成；n為1-6的整數(shù)，n1和n2為1-3的整數(shù)，烷基在核酸鏈上摻雜的距離為2-10個(gè)堿基。
2.一種核酸的化學(xué)修飾方法，其特征在于，包括如下步驟
1)制備通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體
其中，n為1-6的整數(shù)；n1和n2為1-3的整數(shù)；B為天然的或非天然的核苷堿基，所述天然的或非天然的核苷堿基帶有或者不帶有保護(hù)基；
2)通過(guò)固相合成的方式，合成需要修飾的核酸鏈，并在合成過(guò)程中將兩個(gè)選自通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體摻雜到核酸鏈中；
3)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴關(guān)環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，將側(cè)鏈烯烴偶聯(lián)成烷烴鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式5選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；?、異丙?；蛞阴；?；n為1-6的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式6選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；?、異丙酰基或乙?；?；n為1-6的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式7選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲酰基、異丙?；蛞阴；?；n1和n2為1-3的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式8選自如下結(jié)構(gòu)中的一種
其中，R為H或氨基保護(hù)基；優(yōu)選地，所述氨基保護(hù)基為苯甲?；?、異丙?；蛞阴；?；n1和n2為1-3的整數(shù)。
7.權(quán)利要求2-6任一所述的核酸的化學(xué)修飾方法在提高反義核酸穩(wěn)定性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2-6任一所述的核酸的化學(xué)修飾方法在提高siRNA穩(wěn)定性中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用采用如下方法進(jìn)行
1)選擇靶基因，確定siRNA的正義鏈和反義鏈的序列；
2)制備通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體；
3)固相合成siRNA的正義鏈和反義鏈，并在合成過(guò)程中將兩個(gè)選自通式5、通式6、通式7或通式8所示的核苷單體摻雜到siRNA的正義鏈或反義鏈中；
4)退火雜交形成siRNA雙鏈；
5)在Grubbs催化劑的作用下發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，固定siRNA鏈的構(gòu)象。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述siRNA的正義鏈和反義鏈至少80％互補(bǔ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述siRNA的正義鏈和反義鏈各含19-50個(gè)堿基；優(yōu)選地，所述siRNA的正義鏈和反義鏈各含19-30個(gè)堿基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用烷基修飾的核酸及其化學(xué)修飾方法，經(jīng)該方法修飾的核酸具有良好的親脂性和膜透性，在機(jī)體內(nèi)可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶等的水解，對(duì)生理環(huán)境的氧化、還原、取代、消除、加成等反應(yīng)及廣泛的pH環(huán)境均可耐受。本發(fā)明還涉及核酸的化學(xué)修飾方法在提高反義核酸和siRNA的穩(wěn)定性中的應(yīng)用。通過(guò)本發(fā)明的方法修飾的反義核酸和siRNA，其化學(xué)穩(wěn)定性和血液容留時(shí)間均得到明顯的改善。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101824063SQ20101014990
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者高源 , 劉迎春 申請(qǐng)人:北京歐凱納斯科技有限公司