專利名稱：真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-ndm及其合成方法與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物，尤其是涉及一種真菌環(huán)氧二烯煙酸衍 生物4-NDM及其合成方法與用途。
背景技術：
細胞凋亡是多細胞生物保證個體正常生長發(fā)育和細胞新陳代謝、維持機體穩(wěn)定及 體內平衡的重要生物學功能之一，其功能異常與腫瘤等疾病的發(fā)生有關。真菌環(huán)氧二烯 (Mycoepoxydiene)可以通過作用于Hsp90，進而引起其客戶蛋白質的降解，誘導腫瘤細胞 凋亡，從而在制備抗腫瘤等藥物中具有重要價值。Mycoepoxydiene是一種利用新分離獲得的菜豆間座殼菌HLY2代謝產(chǎn)生的化合物 乙酸2-(8_甲基-9-氧雜雙環(huán)[4. 2. 1]九-2，4-二烯-7-基]-6-氧-3，6-二氫-2H-吡
喃-3-基酯])，其結構式為
O研究表明，Myco印oxydiene具有抗腫瘤活性，其對人口腔皮樣癌KB細胞IC5tl < 6. 25μ g/mL，對人骨肉瘤MG63細胞IC5tl = 34. 6 μ g/mL(參見公開號為CN101024647的 發(fā)明專利申請)。鑒于Myco印oxydiene在引起腫瘤細胞凋亡等生物學過程中發(fā)揮著重要的作用， 且其作用機制的獨特性，因而真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM具有抗腫瘤功能的開發(fā)價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種結構新穎的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM及其合 成方法與用途。本發(fā)明所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-冊11為6-[(11 ，65，71 ，85)-8-甲基_9_氧 雜雙環(huán)[4. 2. 1]九-2，4-二烯-7-基]-5-(卩比啶-4-氧基)-5，6-二氫-2H-吡喃_2_酮， 簡稱為4-NDM，其分子式為C19H19NO4，結構式為<formula>formula see original document page 4</formula>4-NDM化合物為白色針狀晶體，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亞砜等有機溶劑中。本發(fā)明所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成路線為
<formula>formula see original document page 4</formula>
其具體步驟為將DAM (南強菌素)和煙酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴條件下，加入脫水劑和催化 齊 ，混合后，撤去冰浴，再攪拌反應后，反應產(chǎn)物過濾，將濾液減壓濃縮至干，柱層析分離得 到反應產(chǎn)物真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM。所述DAM是一種可以從海洋微生物分離到的已知的Myco印oxydiene的衍生物，其 結構式見上述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的化學合成路線。所述DAM和煙酸的用量可相同；所述脫水劑可采用N，N: 二環(huán)己基碳化二亞胺 (DCC)，所述催化劑可采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述脫水劑的加入量可與DAM相同；所 述催化劑的加入量可為DAM的0. 01% 5% ；所述混合后，撤去冰浴，最好是混合30min后 撤去冰??；所述再攪拌反應，可在室溫下攪拌反應4 8h。反應產(chǎn)物的結構式和分子量可分別通過核磁共振(NMR)分析和質譜(MS)分析予
以鑒定。本發(fā)明所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM合成路線簡單，得率高，實驗證實 4-NDM具有很強的抗腫瘤活性，對HeLa細胞的IC5tl為4. 71 μ mol/L ；能產(chǎn)生誘導腫瘤細胞凋 亡的效應，抗腫瘤作用靶點明確，可用于制備治療癌癥的藥物。


圖1為真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM對HeLa細胞的抑制效果。在圖1中，橫坐 標為濃度(μ mol/L)，縱坐標為抑制率；由圖1表明，4-NDM對HeLa細胞的生長具有很強的 抑制作用。圖2顯示化合物4-NDM對HeLa細胞存活的影響。在圖2中，橫坐標為濃度(ymol/ L)，縱坐標為Pl陰性細胞數(shù)(％ )。
圖3顯示化合物4-NDM對HeLa細胞的形態(tài)的影響。在圖3中，標尺為100 μ m ；用不同濃度(0，2，5，10 μ mol/L)的4-NDM作用于HeLa細胞12，36h后普通光學顯微鏡直接觀 察細胞的形態(tài)變化。圖4為4-NDM對HeLa細胞的細胞核的影響。在圖4中，用不同濃度(0，5，10μπιο1/ L)的4-NDM作用于HeLa細胞24h后對細胞進行DAPI染色，并進行熒光顯微觀察，箭頭所示 為HeLa細胞發(fā)生核固縮的凋亡細胞核；由圖4表明，4-NDM可以誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡。圖5為4-NDM對HeLa細胞周期分布的影響。在圖5中，橫坐標為DNA含量，縱坐標 為細胞數(shù)；圖5給出用不同濃度(0，5，10 μ mol/L)的4-NDM作用HeLa細胞12h、36h和72h 后用流式細胞儀分析細胞周期的變化；由圖5表明，隨著濃度和作用時間的延長，HeLa細胞 周期分布發(fā)生明顯的變化，表現(xiàn)在DNA含量和相對細胞數(shù)的變化。圖6為4-NDM誘導HeLa細胞凋亡峰的百分含量對比。在圖6中，橫坐標為作用時間 (h)，縱坐標為亞二倍體峰(簡寫為SubGl)；由圖6表明，4-NDM作用濃度越高(如15ymol/ L)，作用時間越長(如72h)，引起HeLa細胞凋亡的凋亡峰的百分含量越高(接近75%)。圖7為4-NDM對Hsp90客戶蛋白質降解作用。在圖7中，顯示4-NDM作用HeLa細 胞24h后相關蛋白質表達的Western blot分析結果；由圖7表明，隨著4-NDM濃度(0.5， 10，15，2015 μ mol/L)的增加，Hsp90的客戶蛋白(簡寫為Akt，Raf-1，IKKβ，磷酸化的Akt) 表達量下調，而Hsp70的表達量顯著上調，即4-NDM對Hsp90客戶蛋白質具有降解作用；GA 為陽性對照。圖8為化合物4-NDM對凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達的影響。由圖8表明，隨著 4-NDM濃度的升高，Bcl-2的表達水平降低；4-NDM對凋亡抑制蛋白(簡寫為Bcl_2)的表達 具有抑制作用；GA為陽性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不 用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1、體外抗腫瘤活性檢測在實施例1中，采用MTT (Methyl Thiazolyltetrazolium)法檢測化合物在體外對 腫瘤細胞的抑制效果。試驗方法收集對數(shù)生長期的HeLa細胞制成單細胞懸液，以6X IO4個/mL接種于96孔板 中，每孔80yL.另設3孔無細胞的空白對照孔(僅含DMEM完全培養(yǎng)基).置37°C，5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后加入20 μ L用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋好的樣品，等量DMSO作為 陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)72h.每孔加IOyL濃度為5mg/mL MTT溶液，37°C反應3h，每孔加 100 μ L終止液(10% SDS,0.01mol/L HCl)過夜，酶標儀比色測定(測定波長595nm，參考 波長655nm).對腫瘤細胞生長的抑制率按下式計算抑制率=(陰性對照組OD值-實驗組 OD值)/ (陰性對照組OD值-空白組OD值)X 100 %，實驗重復3次，取平均值。IC50為抑制率為50%時的樣品濃度。試驗結果化合物4-NDM對宮頸癌細胞HeLa具有很強的抑制活性，IC5tl為4. 71 μ mol/L (參見圖1)。實施例2、細胞凋亡分析在實施例2中，采用DAPI染色及流式細胞儀測定法檢測化合物誘導腫瘤細胞凋亡 的效果。試驗方法
1)細胞存活率測定取對數(shù)生長期的細胞，均以個1. 5 2X IO5個/mL密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板上 或者是以0. 5 1 X IO5個/mL密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)過夜后，用相應藥物 處理細胞，同時以未經(jīng)處理細胞為陰性對照。消化收集藥物處理了 一定時間的細胞，包括培養(yǎng)液中懸浮的死細胞，SOOrpm離 心5min，去上清，加ImL PBS緩沖液重懸細胞，再次離心去上清，最后重懸細胞于含5 μ g/ mL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)的 PBS 緩沖液中(PI buffer :3. 4mmol/L 檸檬酸鈉 (Trisodium Citrate) ,9. 65mmol/L NaCl,PI20mg/mL,0. 03% Nonidet P-40，配于 H2O 中)， 避光冰上孵育lOmin，上流式細胞儀(Flow CytoMeter，F(xiàn)CM)測定細胞存活率。2)細胞周期測定細胞的前期接種、藥物處理與收集同上。收集的細胞經(jīng)PBS緩沖液洗一次后，去上 清，將細胞逐滴加入70%預冷的乙醇中，-22°C固定6h以上。之后，離心去上清，重懸細胞 于PBS緩沖液，再次離心，去上清，最后重懸細胞于含lOOimit/mL RNA酶的PBS緩沖液中， 避光37°C處理30min，加2mg/mL PI至終濃度50 μ g/mL,避光孵育lOmin，過濾后上流式細 胞儀分析。3) DAPI染色檢測細胞凋亡細胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。加藥物對細胞處理一定時間后進行染色操 作將細胞消化，并用PBS洗滌后，將細胞置于1.5毫升離心管，加入固定液，放在靜音混勻 器上4°C固定30min，PBS洗滌PBS洗2次，每次5min。然后以50 μ g/mL的DAPI (其中含有 100 μ g/mL RNA酶Α)避光染色，PBS洗滌后封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)活的 細胞核染色質在核內分布均勻，凋亡細胞核染色質凝集、邊緣化或裂解為小片段。試驗結果如下用不同濃度的化合物4-NDM作用于HeLa細胞24h后，以DNA結合型染料PI對細 胞DNA染色，用流式細胞儀測定細胞的存活率。隨著4-NDM濃度的增加，細胞的存活率逐漸 下降(參見圖2)?？梢?-NDM可以誘導HeLa細胞的死亡，在一定時間內，其作用隨著濃度 的增加而增強。對經(jīng)4-NDM作用后的HeLa細胞的形態(tài)進行顯微觀察。HeLa細胞經(jīng)濃度為2、5和 10 μ mol/L的4-NDM分別處理12和36h。正常的HeLa細胞呈多角形，飽滿，細胞邊緣較為 圓滑，貼壁牢固；而5 μ mol/L的4-NDM處理12h的HeLa細胞開始皺縮，10 μ mol/L的4-NDM 處理12h的HeLa細胞呈細長的梭形，邊緣出現(xiàn)鋸齒狀，并且有細胞變圓，開始從壁上脫落， 隨著作用時間的延長，細胞邊緣鋸齒化明顯，懸浮細胞增多(參見圖3)。為了觀察4-NDM對細胞核的影響，用濃度分別為5禾Π 10 μ mol/L的4-NDM作用HeLa 細胞24h后，收集細胞進行DAPI染色。結果可以觀察到，陰性對照組的細胞核呈完整圓滑 的腎形，染色質均勻分布；而4-NDM作用24h后有些細胞核開始出現(xiàn)固縮，細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現(xiàn)濃縮邊緣化，甚至出現(xiàn)核裂解(參見圖4)，箭頭所示為發(fā)生核 固縮的細胞核，具有細胞凋亡的典型形態(tài)變化。根據(jù)DAPI染色結果可知4-NDM可以引起HeLa細胞凋亡，為了進一步驗證此結論， 用濃度為5，10和15 μ mol/L的4-NDM作用HeLa細胞12，36和72h，測定細胞周期分布，檢 測其是否可以誘導HeLa細胞出現(xiàn)凋亡峰(Sub G1，亞二倍體峰)。從圖中可以看出隨時間 的延長，濃度的升高，相應的凋亡峰逐漸增加(參見圖5)，Sub Gl的百分含量越來越高(參 見圖6)。實施例3、4_NDM對HeLa細胞中與Hsp90相關的蛋白的表達水平的影響Western Blot分別用適宜濃度的待測樣品處理HeLa細胞，吸去培養(yǎng)液，用PBS漂 洗一次，加入細胞裂解液，4°C裂解lOmin，~快速刮取細胞置于1. 5mL離心管中.冰浴超聲 裂解細胞10次，每次ls，得到的細胞裂解液于4°C，13500rpm/min離心15min.取上清用 Bradford法測定蛋白質濃度，調整蛋白濃度一致，電泳前加入SDS樣品緩沖液，100°C水浴 IOmin后進行SDS-PAGE電泳.再100V電轉Ih到預先用甲醇浸潤過的硝酸纖維素(PVDF) 膜上.5% BSA室溫封閉lh，一抗(體積比1 1000稀釋)室溫孵育2h或4°C過夜，TBST 洗滌3次，每次IOmin. 二抗(體積比1 5000稀釋)室溫孵育lh，TBST洗滌后的PVDF膜 用增強型化學發(fā)光劑(ECL)溶液浸潤，顯影觀察.試驗結果分別用不同濃度的4-NDM處理HeLa細胞24h，隨著濃度的升高，Hsp70明顯上調，Hsp90的客戶蛋白Akt，Raf-I，IKK β呈下調趨勢，且Akt變化趨勢最顯著，ρ-Akt下調明顯 (參見圖7)，與公認的Hsp90的抑制劑格爾德霉素(GA)對這些蛋白的影響趨勢一致，推測 4-NDM可能是Hsp90的抑制劑。此外，4-NDM也能引起凋亡抑制蛋白Bcl_2的下調，進一步揭示，4-NDM能夠誘導 HeLa細胞發(fā)生凋亡(參見圖8)。
權利要求
真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM，其特征在于為6-[(1R，6S，7R，8S)-8-甲基-9-氧雜雙環(huán)[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基]-5-(吡啶-4-氧基)-5，6-二氫-2H-吡喃-2-酮，簡稱為4-NDM，其分子式為C19H19NO4，結構式為4-NDM化合物為白色針狀晶體，易溶于甲醇、丙酮、二甲基亞砜有機溶劑中。FSA00000069220800011.tif
2.如權利要求1所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM，其特征在于其合成路線為<formula>formula see original document page 2</formula>
3.如權利要求1所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于其具 體步驟為將DAM和煙酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴條件下，加入脫水劑和催化劑，混合后，撤去 冰浴，再攪拌反應后，反應產(chǎn)物過濾，將濾液減壓濃縮至干，柱層析分離得到反應產(chǎn)物真菌 環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM。
4.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 DAM和煙酸的用量相同。
5.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 脫水劑為N，N: 二環(huán)己基碳化二亞胺。
6.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 催化劑為4-二甲氨基吡啶。
7.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 脫水劑的加入量與DAM相同。
8.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述 催化劑的加入量為DAM的0. 01% 5%。
9.如權利要求3所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的合成方法，其特征在于所述混 合后，撤去冰浴，是混合30min后撤去冰浴；所述再攪拌反應，是在室溫下攪拌反應4 8h。
10.如權利要求1所述的真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的在制備治療癌癥的藥物中 的應用。
全文摘要
真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM及其合成方法與用途，涉及一種真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物。所述真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM的分子式為C19H19NO4。合成方法為將DAM和煙酸溶解在二氯甲烷中，在冰浴條件下，加入脫水劑和催化劑，混合后，撤去冰浴，再攪拌反應后，反應產(chǎn)物過濾，將濾液減壓濃縮至干，柱層析分離得到反應產(chǎn)物真菌環(huán)氧二烯煙酸衍生物4-NDM。合成路線簡單，得率高，實驗證實4-NDM具有很強的抗腫瘤活性，對HeLa細胞的IC50為4.71μmol/L；能產(chǎn)生誘導腫瘤細胞凋亡的效應，抗腫瘤作用靶點明確，可用于制備治療癌癥的藥物。
文檔編號C07D493/08GK101805351SQ20101015047
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者宋思揚, 張偉, 張連茹, 易玉婷, 沈月毛, 胡志鈺, 鄭忠輝, 黃耀堅 申請人:廈門大學