專利名稱：一種檢測腐馬素的免疫試劑盒及其專用抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測腐馬素的免疫試劑盒及其專用抗體。
背景技術(shù)：
腐馬素(Fumonisins，F(xiàn)B)是主要由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組真菌毒素。 腐馬素大多存在于玉米及玉米制品中，其含量一般超過lmg/kg，在大米、面條、調(diào)味品、高 粱、啤酒中、蘆筍中也有較低濃度的腐馬素存在.腐馬素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與神經(jīng)鞘氨醇很相似， 能特異性地干擾神經(jīng)鞘氨醇在體內(nèi)的代謝，進(jìn)而能夠引起馬腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫、羊的 腎病變等疾病。一些試驗表明玉米中腐馬素的含量與人類食管癌的發(fā)生率之間存在著平行 對應(yīng)關(guān)系。國際癌癥研究中(International Agency forResearch on Cancer, IARC)把腐 馬素劃分到2B組，即人類可能的致癌物.腐馬素污染食品及飼料后對人類及動物的健康造 成很大的威脅。目前，用于腐馬素的檢測方法主要有化學(xué)檢測方法和免疫學(xué)檢測方法?；瘜W(xué)檢測 方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和 氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)法，但前處理過程復(fù)雜，需要比較昂貴的儀器，且分析速度慢，因 此不適于大量樣品的快速檢測分析。免疫分析方法因其高靈敏度、高通量及檢測所需時間 較少而日益受到研究人員的青睞。在免疫分析方法中，酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)在農(nóng)藥 殘留檢測方面得到了最廣泛的應(yīng)用。但在一些實際樣品檢測中，酶聯(lián)免疫分析方法對部分 農(nóng)藥在樣品中的最低檢測限仍達(dá)不到其MRL值要求?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)不同于酶聯(lián)免 疫吸附分析法，它是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，同時具有化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的 高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高特異性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法的基本原理與ELISA相似，不 同之處在于酶標(biāo)記物的反應(yīng)體系是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆 抗體的制備必須通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得，整個生產(chǎn)過程復(fù)雜，消耗時間長，費(fèi)用高，且不易進(jìn)行 操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因通過一個短肽鏈連接后融合表達(dá)出 來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結(jié)合力強(qiáng)、易于利用基因工程技術(shù)操作等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種單鏈抗體及其編碼基因。本發(fā)明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、 輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-118位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第134-246位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的氨基酸序列如序列 1自N末端起第119-133位氨基酸殘基所示。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)所示
1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-354位核苷 酸所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第400-738位核 苷酸所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的 5'末端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)盒也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測腐馬素中的應(yīng)用或上述任一所述單鏈抗體在檢測 腐馬素Bl中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測腐馬素的免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測腐馬素的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試 劑盒1)試劑盒中包括腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一所述單鏈抗體和酶 標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括腐馬素半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗體；其 中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括腐馬素半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體；其中，所述 單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一所述單鏈抗體的酶 標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣 品濃縮液；所述腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品為腐馬素Bl ；所述腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、 1350ng/L和 4050ng/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。上述任一所述免疫試劑盒中，所述腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下 方法制備的將每5mg腐馬素Bl半抗原溶于0. IM鹽酸水溶液中，并預(yù)冷至0°C，加入IOmg NaNO2,4°C條件下攪拌5h，得到的溶液記作溶液I ；20mg載體蛋白溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液 中，得到的溶液記作溶液II ；將溶液II加到溶液I中，4°C條件下攪拌6h，即得到所述腐馬 素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述腐馬素半抗原為腐馬素B1 ；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠 血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白；
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所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測腐馬素Bl的方法。本發(fā)明所提供的檢測腐馬素Bl的方法，包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)和C)中的任一a)所述待測樣品為谷物或飼料樣品；將每Ig述待測樣品與0.25g氯化鈉和 5mL70% (ν/ν)的甲醇水溶液混合，震蕩3min,過濾，取濾液200 μ L加入1800 yL 1% (m/m) 氯化鈉水溶液，混勻后即得到待測樣本溶液；b)所述待測樣品為牛奶；將每0. 5mL牛奶與2mL樣品稀釋液混勻，25°C、4000r/ min離心lOmin，取上清液，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為豬肉、牛肉、羊肉或雞肉；將每3g所述待測樣品的勻漿組織與 15mL pH值為6. 9的PBS緩沖液混勻，200r/min震蕩30min, 4000r/min離心IOmin,取上清 液，即得到待測樣本溶液；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。所述腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)原理為用重氮化法將半抗原FBl偶聯(lián)于載 體蛋白OVA上，由于FBl具有芳伯氨基的半抗原，在強(qiáng)酸和冷卻條件下芳伯氨基生成親電動 重氮鹽，與載體蛋白中的強(qiáng)給電子集團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成重氮產(chǎn)物，形成包被抗原FB1-0VA。上述試劑盒既可以為酶聯(lián)免疫試劑盒，又可為發(fā)光免疫試劑盒，當(dāng)為發(fā)光免疫試 劑盒時，試劑盒中還包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成；A液由(1)中所述 物質(zhì)(即發(fā)光劑)中的至少一種和(2)中所述物質(zhì)(即發(fā)光增強(qiáng)劑)中的至少一種組成 ⑴魯米諾、異魯米諾和4-氨基己基-N-乙基異魯米諾，(2)對_碘苯酚、鄰_碘苯酚和對 甲苯酚；B液為過氧化氫溶液或尿素過氧化氫溶液。所述發(fā)光底物液分為A液和B液保存， 在臨用前按11混合使用。上述試劑盒的檢測原理如下當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，加入樣本溶液 或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入腐馬素單鏈抗體溶液，樣本中殘留的腐馬素或腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品與酶 標(biāo)板上包被的腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物競爭腐馬素單鏈抗體，加入酶標(biāo)記二抗進(jìn) 行放大作用，催化底物發(fā)光，樣本發(fā)光強(qiáng)度值與樣本中腐馬素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線 比較即可得出樣本中腐馬素的含量。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被二抗時，加入腐馬素單鏈抗體孵育后，加入樣本溶液 或標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入酶標(biāo)記腐馬素半抗原溶液，樣本中的腐馬素或腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo) 記腐馬素半抗原競爭腐馬素特異性抗體，用催化底物發(fā)光，樣本發(fā)光強(qiáng)度值與樣本中腐馬 素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中腐馬素的含量。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被腐馬素單鏈抗體時，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后， 再加入酶標(biāo)記腐馬素半抗原溶液，樣本中殘留的腐馬素或腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記抗原競爭 包被在酶標(biāo)板上的腐馬素單鏈抗體，用催化底物發(fā)光，樣本發(fā)光強(qiáng)度值與腐馬素的含量成 負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中腐馬素的含量。當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時，加入樣本溶液
6或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記腐馬素單鏈抗體溶液，樣本中的腐馬素或腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品與 酶標(biāo)板上包被的腐馬素抗原競爭腐馬素單鏈抗體，用催化底物發(fā)光，樣本發(fā)光強(qiáng)度值與樣 本中腐馬素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中腐馬素的含量。本發(fā)明提供的試劑盒檢測方法為當(dāng)包被原為腐馬素偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加 入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)二抗，溫育后洗滌拍干，催化底物發(fā)光、用化學(xué)發(fā)光檢 測儀測定發(fā)光強(qiáng)度值；當(dāng)包被原為腐馬素偶聯(lián)抗原時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加 入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，催化底物發(fā)光、用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定發(fā)光強(qiáng)度值；當(dāng)包被原為腐馬素單鏈抗體時，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加 入酶標(biāo)記腐馬素半抗原，溫育后洗滌拍干，催化底物發(fā)光、用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定發(fā)光強(qiáng)度 值；當(dāng)包被原為二抗時，向酶標(biāo)板微孔中加入腐馬素單鏈抗體，溫育后洗滌拍干，再加 入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)腐馬素半抗原，溫育后洗滌拍干，催化底物發(fā)光、用化 學(xué)發(fā)光檢測儀測定發(fā)光強(qiáng)度值。本發(fā)明提供的檢測結(jié)果分析過程為以所獲得的樣品發(fā)光強(qiáng)度⑶與第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光強(qiáng)度(Btl)的比值(B/ B0)為縱坐標(biāo)，以FB標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，通過專業(yè)分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出IC5tl，以 20%的抑制作為最低檢測限。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快 速分析，整個檢測過程只需較短時間，1.5h內(nèi)即可以完成。本發(fā)明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變 區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗原親和活 性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術(shù)體外表達(dá)得到，可在細(xì)菌中很經(jīng) 濟(jì)地大規(guī)模生產(chǎn)，從而使得免疫檢測抗體的生產(chǎn)變得非常容易、簡便和經(jīng)濟(jì)，進(jìn)而大大減少 檢測試劑的費(fèi)用，比雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)得到單抗的方法要簡單得多。本發(fā)明抗體的親和常數(shù) 為1. 73X IO9LAioI、半數(shù)抑制量(IC5tl)為0. 15ng/mL。本發(fā)明為食品中腐馬素殘留檢測方 法的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗中，本發(fā)明試劑盒的每批試劑盒各測定10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù) 數(shù)在5. 3% 8. 2%之間；樣本準(zhǔn)確度和精密度實驗中，玉米樣品的添加回收率為81. 3% 91. 3%;牛奶樣品的添加回收率為86. 2% 102.6%。玉米樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為6. 8. 1%，批間變異系數(shù)為8. 8% 11.9% ；牛奶樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為6. 7% 8.9%，批間 變異系數(shù)為8. 4% 10. 9%。交叉反應(yīng)檢測實驗中，本發(fā)明試劑盒對腐馬素Bl的特異性好。 綜上表明，本發(fā)明試劑盒的靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、對腐馬素Bl的特異性好。另外， 本發(fā)明試劑盒成本低廉。用本發(fā)明的試劑盒檢測樣品中腐馬素Bl的含量，具有操作簡便快 捷、樣品前處理簡單的特點，能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因 此，本發(fā)明的抗體及試劑盒及檢測方法在腐馬素Bl的檢測中將發(fā)揮重大作用。


圖1為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、抗體的制備及功能檢測一、腐馬素單鏈抗體的制備(一)抗體的篩選取6個月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細(xì)胞總RNA，純化得到mRNA，再逆 轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用全套引物，以cDNA為模板分別擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū) (VL)基因，經(jīng)疊加延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Overlap-PCR)將VH、VL基因隨機(jī)拼接為單鏈抗體 基因(ScFv)，然后將ScFv與載體pCANTAB5E連接得pCANTAB5E/ScFv，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl， 即得到鼠源非免疫單鏈抗體庫。用ELISA方法篩選得到帶有特異性的抗腐馬素的單鏈抗體 的噬菌體顆粒，通過測序得到該抗體的核苷酸序列。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 1-354位核苷酸編碼重鏈可變區(qū)，自序列2的5'末端起第400-738位核苷酸編碼輕鏈可變 區(qū)，自序列2的5'末端起第355-399位核苷酸編碼短肽。該單鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變 區(qū)順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-118 位氨基酸殘基為重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第134-246位氨基酸殘基為 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第119-133位氨基酸殘基為短肽序列。( 二)抗體的制備表達(dá)載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌BL21購自德國N0VAGEN公司； 蛋白純化用HisLink Protein Purification Resin購自美國Promega公司，產(chǎn)品目錄號 為 V8823。合成序列表中序列2所示基因，并在兩端引入酶切位點Xba I和Not I，用限制性 內(nèi)切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶Xba I和Not I酶切表達(dá) 載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選培養(yǎng)，挑取單克隆；將單 克隆接入液體培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測序驗證，結(jié)果測得的序列如序列表中 序列2所示，表明重組載體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達(dá) 載體 pET20b/ScFv。采用電擊轉(zhuǎn)化法重組表達(dá)載體pET20b/ScFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經(jīng)菌 液PCR及質(zhì)粒酶切驗證，得到含有重組表達(dá)載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組大 腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養(yǎng)液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養(yǎng) 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質(zhì)量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養(yǎng)液是按照如下方法得到的向2XTY
8培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質(zhì)量百分 含量)。發(fā)酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養(yǎng)液中，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A6tltl為0. 6時，收集細(xì) 菌；將細(xì)菌重懸于2ml LB液體培養(yǎng)基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的 A600 為 0. 6 時，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導(dǎo)，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細(xì)菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復(fù)3次，至細(xì)胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結(jié) 合緩沖液I (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結(jié)合緩沖液I)洗滌一次，而后，懸于結(jié)合緩沖液II (將20mmol Tris,0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結(jié)合緩沖液II)中，4°C，12000 X g離心20min,收集上清，經(jīng)0. 45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達(dá)載體上帶有的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)標(biāo)記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調(diào)節(jié) pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer (將lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。蛋白驗證Western blot 收集上述各階段產(chǎn)物，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳；將電泳 條帶印跡到NC膜上，再與HRP標(biāo)記的腐馬素Bl雜交，檢測發(fā)光條帶。腐馬素Bl購自美國 Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為32936。同時以轉(zhuǎn)入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對照，并按照上述方法進(jìn)行表達(dá) 和純化，和Western blot檢測。Western blot檢測結(jié)果表明1)實驗組得到的蛋白具有與腐馬素Bl結(jié)合的功能， 蛋白的分子量為28kD，與預(yù)期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白為與腐馬素Bl結(jié)合的抗 體。2)對照組沒有檢測到任何與腐馬素Bl結(jié)合的蛋白條帶。(三)抗體的功能檢測1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC5tl)a、將實施例2中制備得到的偶聯(lián)物(FB1-OVA)用包被緩沖液溶解，得到FB1-OVA的
9溶液(該溶液中FB1-OVA的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩沖 液。向96孔板的孔中加入FB1-OVA的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。C、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的腐馬素Bl標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各50 μ L每孔， 37°C孵育1小時。以只加入單鏈抗體溶液不加入腐馬素Bl標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔作陽性對照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實驗(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的腐馬素Bl溶液的制備用樣品稀釋液稀釋腐馬素Bl得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，加 入HRP標(biāo)記的鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，37°C孵育1小時；e、用 PBST 溶液(PBS,0. 05%Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應(yīng)10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應(yīng)，每孔50 μ L，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。實驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如下1)吸光度值與每孔所加入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中FB1的濃度成反比；證明，所表達(dá)純化 得到的單鏈抗體具有針對腐馬素Bl的結(jié)合特異性，并呈現(xiàn)線性關(guān)系，說明該抗體可用于對 腐馬素Bl的免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對照孔(即不添加腐馬素Bl標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔)的吸光度 值為Btl，各實驗孔的吸光度值為B，當(dāng)BziBci為50%時所對應(yīng)的腐馬素Bl標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度 即為半抑制率(IC5tl)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為0. 15ng/mL。2、抗體的親和常數(shù)測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加的抗原里，可使抗體的結(jié)合 達(dá)到飽和，以結(jié)合部分(B)為縱坐標(biāo)，抗原濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)繪制飽和曲線，求出抗體 飽和程度為50%時的游離抗原濃度，其倒數(shù)即為該抗體在此稀釋度下的親和常數(shù)。結(jié)果抗體的親和常數(shù)為1. 73 X IOVmol0實施例2、化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備與應(yīng)用一、化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒由下述物質(zhì)組成1、包被腐馬素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；2、腐馬素單鏈抗體實施例1中所述抗體?？贵w工作液的濃度為5ng/mL，抗體工 作液是用樣品稀釋液稀釋實施例1中的純化抗體得到的；3、腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、 1350ng/L 和 4050ng/L ；腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品為腐馬素 Bl (Fumonisin Bi)，購自 Sigma-Aldrich 公 司，產(chǎn)品目錄號為32936 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標(biāo)二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為A7058。5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為魯米諾與對-碘苯酚混合溶液，B液為過氧化氫水溶液；在該發(fā)光體系中加入增強(qiáng)劑對_碘苯酚可增加化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，并在較長 時間保持穩(wěn)定，從而大大提高免疫分析的靈敏度。所述發(fā)光底物液分為A液和B液保存，在 臨用前按11混合使用。6、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;7、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進(jìn)行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒的制備半抗原腐馬素Bl (Fumonisin Bi，簡稱FBI)購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目 錄號為32936 ；1、包被原及其制備用重氮化法將半抗原FB1偶聯(lián)于載體蛋白OVA上，由于FB1具有芳伯氨基的半抗 原，在強(qiáng)酸和冷卻條件下芳伯氨基生成親電動重氮鹽，與載體蛋白中的強(qiáng)給電子集團(tuán)發(fā)生 反應(yīng)，生成重氮產(chǎn)物，形成包被抗原FBfOVA。制備過程如下取5mg腐馬素Bl溶于0. IM 鹽酸水溶液中，并預(yù)冷至0°C，加入IOmg NaNO2,4°C條件下攪拌5h，得到的溶液記作溶液I ； 20mg OVA溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液中，得到的溶液記作溶液II ；將溶液II加到溶液I中， 4°C條件下攪拌6h，即得到所述腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；用葡聚糖凝膠G-25進(jìn) 行純化后，測包被原的濃度，存于4°C備用。半抗原FB1與載體蛋白OVA的偶聯(lián)比為1 11。2、包被有包被原的酶標(biāo)板及其制備用包被緩沖液將步驟1制得的腐馬素Bl與載體蛋白的偶聯(lián)物稀釋成5. 0μ g/mL， 每孔加入100 μ L，37°C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍 干，然后在每孔中加入200μ L封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法(一)樣品前處理(1)谷物、飼料樣品處理將樣品粉碎，稱取Ig置于20mL的試管中，加入0.25g氯 化鈉和5mL 70% (ν/ν)的甲醇水溶液，強(qiáng)力震蕩3min，過濾，取濾液200 μ L加入1800 μ L 1% (m/m)氯化鈉水溶液，混勻后即得到檢測樣本溶液，取50yL用于檢測。(2)牛奶樣品處理取牛奶0. 5mL，加入樣品稀釋液2mL，充分混勻，室溫4000r/min 離心lOmin，上清液即為檢測樣本溶液，取50 μ L上清液用于檢測。(3)肉類樣品的處理(包括豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等)將樣品勻漿，稱取3g加入 15mL PBS 緩沖液(pH 6. 9), 200r/min 震蕩 30min，然后 4000r/min 離心 lOmin，上清液即為 檢測樣本溶液，取50 μ L上清液用于檢測。(二)用試劑盒檢測
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μ L，再加入腐馬素單 鏈抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入 250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根 過氧化物酶標(biāo)記的抗His抗體工作液100 μ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重 復(fù)洗滌步驟，加入底物顯色液用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行測定。用每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光強(qiáng)度平均值(B)與第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)) 的發(fā)光強(qiáng)度值(Btl)的比值(B/BJ作為縱坐標(biāo)，以FBl標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/L)的濃度為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。2、樣品中腐馬素濃度的測定向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入腐馬素單鏈抗 體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250 μ L 洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入HRP標(biāo)記的抗 His抗體工作液100μ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，加入底物 顯色液用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行測定。用每個檢測樣本溶液的發(fā)光強(qiáng)度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的 發(fā)光強(qiáng)度值(Btl)的比值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測樣本溶液中的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶 液的濃度值，換算出檢測樣本溶液中腐馬素的殘留量。四、試劑盒的效果檢測(一)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗按照實驗一中所述方法制備試劑盒，從3個不同批次的試劑盒中各抽取10個試劑 盒(即10個酶標(biāo)板)進(jìn)行實驗，每個酶標(biāo)板抽出20個微孔，測定2 μ g/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā) 光強(qiáng)度值，計算變異系數(shù)，結(jié)果見表1。變異系數(shù)的計算方法變異系數(shù)(CV)=測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值的百分比。表1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗結(jié)果(CV% )
12345678910cv%NO. 15.47.66.25. 35.96.07. 27. 36.87.4NO. 26.36. 75.47.68. 15.58.06.45.86.9NO. 37.97.25.66. 17. 86. 67.48. 26. 35.7通過上述試驗結(jié)果可以得出，每批試劑盒各測定10次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在 5. 3% -8. 2%之間。(二)樣本準(zhǔn)確度和精密度試驗向不含腐馬素的樣品(玉米和牛奶)中添加腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品，使腐馬素在樣品中的 終濃度分別為0. 2,0. 5、1. 0μ g/kg(y g/L)；將添加后的樣品分別按照實驗三中所述方法 進(jìn)行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法如實驗三中所
12述，每個實驗重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表2?；厥章实挠嬎惴椒≧G =測定值與真實值的比值X 100% ；變異系數(shù)的計算方法CV=(各平行樣本的標(biāo)準(zhǔn)差與各平行樣本平均值的比 it) X 100% ；批內(nèi)變異系數(shù)的計算方法批內(nèi)CV =同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)。批間變異系數(shù)的計算方法批間CV =同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)， 取其平均值。表2準(zhǔn)確度和精密度試驗結(jié)果
樣品添加多紀(jì)度1 (0.2)添加多娘 2 (0.5)添加 良度3 (1.0)平均 RG批內(nèi) CV批間 CV平均 RG批內(nèi) CV批間 CV平均 RG批內(nèi) CV批間 CV玉米 (Pg/kg)82.16. 411.981.66.98.887.48. 19. 783.26. 181.37.691.37.486.77.688.47.883.76.2牛奶 (Kg/L)88.96. 98. 494.58. 110. 9100. 77.59. 687.57. 497. 66. 7102. 67. 986.28.999. 78.691. 58. 3從表中可看出，玉米樣品的添加回收率為81. 3% 91. 3% ；牛奶樣品的添加回 收率為86. 2% 102.6%，符合準(zhǔn)確度的測定標(biāo)準(zhǔn)。玉米樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為6. 8. 1%，批間變異系數(shù)為8. 8% 11.9% ；牛奶樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為6. 7% 8.9%，批間 變異系數(shù)為8. 4% 10. 9%，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。(三)交叉反應(yīng)率試驗選擇與腐馬素類似結(jié)構(gòu)的化合物和臨床使用的代表獸藥，測定交叉反應(yīng)率。通過 各種標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它類似物的交叉反應(yīng)率。
交叉反應(yīng)率(％)=引起50%抑制的腐馬素濃度X 100%
引起50%抑制的類似物濃度結(jié)果如表3所示。表3試劑盒的特異性
藥物名稱交叉反應(yīng)率(% )腐馬素Bl100. 0
13腐馬素B230. 0黃曲毒素< 1嘔吐毒素< 1T2毒素< 1實驗表明，本發(fā)明試劑盒對腐馬素Bl的特異性好，即本發(fā)明試劑盒可以檢測腐馬 素Bi。(四)試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2 8°C，經(jīng)過12個月的測定，試劑盒的最大發(fā)光強(qiáng)度值(零 標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、腐馬素添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]到運(yùn)輸和使用過程 中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存的條件下放置8天，進(jìn)行加速老化實 驗，結(jié)果表明該試劑盒的各項指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放 入-20°C冰箱冷凍8天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑 盒可以在2 8°C至少可以保存12個月以上。
1權(quán)利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1 118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第134 246位氨基酸殘基所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第119-133位氨基酸殘基所示。
3.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-354位核苷酸所 示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第400-738位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的5'末 端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和表達(dá)盒。
6.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體在檢測腐馬素中的應(yīng)用或權(quán)利要求1或2所述單鏈抗 體在檢測腐馬素Bl中的應(yīng)用。
7.—種檢測腐馬素的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體和 酶標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括腐馬素半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括腐馬素半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體；其中，權(quán)利 要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的 酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。
8.根據(jù)權(quán)利 求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品 溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品為腐馬素Bl ；所述腐馬素標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、 1350ng/L 和 4050ng/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L 的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的免疫試劑盒，其特征在于所述腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下方法制備的將每5mg腐馬素半抗原溶于0. IM鹽酸水溶液中，并預(yù)冷至0°C，加入IOmg NaNO2,4°C條件下攪拌5h，得到的溶液 記作溶液I ；20mg載體蛋白溶于0. IM磷酸鹽緩沖溶液中，得到的溶液記作溶液II ；將溶液 II加到溶液I中，4°C條件下攪拌6h，即得到所述腐馬素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述腐馬素半抗原為腐馬素Bl ；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血 清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白； 所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。
10. 一種檢測腐馬素Bl的方法，包括如下步驟1)將待測樣品進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求7-9中任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進(jìn)行檢測； 所述前處理的方法為下述a)、b)和c)中的任一a)所述待測樣品為谷物或飼料樣品；將每Ig述待測樣品與0.25g氯化鈉和5mL 70% (ν/ν)的甲醇水溶液混合，震蕩3min，過濾，取濾液200 μ L加入1800 μ L 1% (m/m)氯化鈉水溶液，混勻后即得到待測樣本溶液；b)所述待測樣品為牛奶；將每0.5mL牛奶與2mL樣品稀釋液混勻，25°C、4000r/min離 心lOmin，取上清液，即得到待測樣本溶液；c)所述待測樣品為豬肉、牛肉、羊肉或雞肉；將每3g所述待測樣品的勻漿組織與15mL pH值為6. 9的PBS緩沖液混勻，200r/min震蕩30min, 4000r/min離心IOmin,取上清液，即 得到待測樣本溶液；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測腐馬素的免疫試劑盒及其專用抗體。該單鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N端起第1-118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N端起第134-246位氨基酸殘基所示。本發(fā)明抗體的親和常數(shù)為1.73×109L/mol、半數(shù)抑制量(IC50)0.15ng/mL。本發(fā)明為食品中腐馬素殘留檢測方法的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。本發(fā)明試劑盒的靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、對腐馬素B1的特異性好，成本低廉。因此，本發(fā)明的抗體及試劑盒及檢測方法在腐馬素B1的檢測中將發(fā)揮重大作用。
文檔編號C07K16/44GK101955542SQ20101016520
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者劉丹, 吳小平, 徐飛, 李娜, 李杰超, 楊麗麗, 楊光, 江海洋, 沈建忠, 王富偉, 王戰(zhàn)輝, 王進(jìn) 申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司