專利名稱：一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹 瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬傳染性胃腸炎，豬流行性腹瀉是目前證實的引起豬發(fā)生腹瀉的重要的兩個病毒 性傳染性病。這兩種疾病主要對仔豬的影響較大，是引起仔豬死亡的主要病毒性腹瀉病。這 兩種病常?；旌细腥?，在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理解剖學(xué)變化上都非常相似，很難區(qū)別到 底是哪一種病毒感染，而且發(fā)病急速，在發(fā)病后近幾個小時就可波及全群，主要是造成哺乳 期仔豬的大批死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。豬傳染性胃腸炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠狀 病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的傳染 病，對新生仔豬具有高度致死率，通常為100%。雖然不同年齡的豬對這種病毒均易感，但5 周齡以上的豬感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美國首次報道了這一疾病以后，世界上 許多國家都相繼報道了豬傳染性胃腸炎。我國從1956年在廣東省首次發(fā)生這種疾病后，全 國大多數(shù)省份也有豬傳染性胃腸炎的發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重危害。豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhae, PED)是冠狀病毒科 (Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus，PEDV)引起的一種豬腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。各種年齡 的豬均易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達100%，尤其哺乳仔豬受害最為嚴重。 豬流行性腹瀉主要發(fā)生在冬季和早春天氣較為寒冷的季節(jié)，但在夏季也可發(fā)生。上世紀70 年代初期許多國家相繼報道了豬流行性腹瀉的發(fā)生，我國上世紀80年代開始陸續(xù)有發(fā)生 豬流行性腹瀉的報道。目前主要用疫苗免疫母豬來預(yù)防這兩種疾病的發(fā)生。由于還沒有針對病毒性疾病 的特效藥物，因此在臨床治療上主要采取對癥治療和用抗生素類藥物預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生， 其治療效果不理想。此外，由于這兩種疾病發(fā)病急速，出現(xiàn)腹瀉后，仔豬大多由于腹瀉而脫 水，很快就會衰竭而死亡。因此，在生產(chǎn)中急需一種既具有特異性，療效又確實，治療效果迅 速顯現(xiàn)的治療制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備 方法。本發(fā)明的免疫原采用細胞培養(yǎng)物加油佐劑乳化制備而成，其中豬傳染性胃腸炎病 毒用豬腎細胞(PK15)傳代細胞培養(yǎng)；豬流行性腹瀉病毒用非洲綠猴腎細胞(Vero)傳代細胞進行培養(yǎng)；這兩種病毒的病毒含量都彡106_°TCID5(l/ml，將這兩種病毒以體積比(1 3) (1 3)的比例混合后與油佐劑以1 2體積比乳化后作為免疫原，免疫非免疫產(chǎn)蛋 雞，收集蛋黃進行蛋黃抗體效價檢測，選擇高效價的蛋黃提純蛋黃抗體。該抗體經(jīng)口服后直 接作用于仔豬腸道，以治療和預(yù)防傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和流行性腹瀉病毒(PEDV)感
^fe ο為達到上述目的，本發(fā)明采用下列技術(shù)步驟 一、TGEV抗原的制備將傳染性胃腸炎病毒液接種在PK15單層細胞上，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明 顯，則收獲細胞懸液凍融后離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細 胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，凍融，離心分離，除去細胞碎片，收集上層清液， 濃縮后用作抗原。二、PEDV抗原的制備將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后于離 心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞 病變時，收獲細胞懸液，凍融后于離心分離，收集上清液，濃縮后用作抗原。三、蛋黃抗體的制備1.動物免疫(1)免疫準備將TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，按總量的0. 1 %加入飽 和甲醛水溶液(即市售40%甲醛水溶液)于37°C滅活24h后，作為首免用免疫原；取適量 的TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，按總量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于 37°C滅活24h后，與2倍量的油佐劑乳化后，作為二免、三免和四免用免疫原。(2)免疫用上述制備的免疫原對非免疫產(chǎn)蛋雞進行免疫，另設(shè)不免疫的空白對 照組。免疫程序為首免時對雞胸肌多點注射，同時滴鼻、點眼共Iml ；2周后進行二免， 與初免時免疫劑量和途徑相同；再隔2周后進行三免(免疫量為2ml，途徑相同)，再隔4 8周后進行第四次免疫(免疫量為2ml，途徑相同)。2.蛋黃液制備二免后1周開始每隔3天抽樣用瓊脂擴散方法測定高免雞蛋蛋黃中抗TGEV、PEDV 特異抗體效價。若抗體效價達到1 8以上即可集蛋，蛋黃液用于制備TGEV、PEDV 二聯(lián)蛋 黃抗體。3.抗體效價檢測得到的TGEV、PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體通過瓊脂擴散試驗中的抗原抗體反應(yīng)進行證明。 瓊脂擴散試驗中的抗原為濃縮的病毒，因為產(chǎn)蛋雞免疫用的免疫原來自細胞感染物，其中 不純成分可能為細胞碎片，而檢測抗原中沒有細胞成分，若該檢測抗原與蛋黃抗體發(fā)生反 應(yīng)，可證明蛋黃抗體中含有針對抗原即TGEV和PEDV的抗體。制備瓊脂凝膠將步驟2收集的蛋黃液用0. 01mol/L的PBS (pH7. 4)倍比稀釋后加 入瓊脂凝膠周圍孔中，中間孔中加入步驟一、二中經(jīng)離心濃縮純化的TGEV、PEDV抗原，置濕盒中37°C溫箱反應(yīng)24h，以出現(xiàn)沉淀帶的最高稀釋度蛋黃液為該蛋黃液的抗體效價。檢測結(jié)果二免后1周采集蛋黃液檢測TGEV和PEDV抗體效價都能達到1 8，再收集蛋黃一個月檢測抗體效價都達到高峰1 64。4.蛋黃抗體的提純蛋黃抗體的提純采用酸化蒸餾水法提純和辛酸法提純相結(jié)合的方法。收集經(jīng)抽樣 檢測合格的高免雞蛋，將蛋殼消毒，采用手工或機械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盤和系 帶，收集蛋黃。充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)121°C 30min滅菌并冷卻的蒸餾 水，攪拌混勻，62. 5°C加熱滅活30min。然后先在隔層反應(yīng)罐中加入相當于原蛋黃6倍體積 的PH值為4. 2的滅菌蒸餾水，并降溫至1 4°C。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌， 4 8°C靜置4h。管式低溫連續(xù)離心機14000rpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。按 總量的0. 2%加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置2 4h。用濾布過濾后，再用K型多層板框過 濾至澄清，按總量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫 放置24h，期間振搖數(shù)次。最后用0.22 μ m微孔濾芯過濾除菌，用截留分子量為IOOOKDa的 超濾膜過濾除病毒。得到提純的蛋黃抗體，即TGEV、PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體。5.將提純的蛋黃抗體液凍干，貯存于4°C。四、TGEV、PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體治療試驗實驗動物為1日齡未吃初乳的仔豬，試驗組動物用TGEV和PEDV病毒口服攻毒，然 后口服飼喂本發(fā)明的蛋黃抗體。另設(shè)攻毒未用抗體組、不攻毒未用抗體組、不攻毒用抗體組 3組作為對照。根據(jù)各組臨床癥狀及死亡率來判斷TGEV和PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體的治療效果。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的TGEV和PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體對TGEV和PEDV引起的 仔豬腹瀉具有明顯的治療作用，未出現(xiàn)任何毒副作用。豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒同屬冠狀病毒科，二者致病的臨床癥狀 又極其相似，且一般呈混合感染，各個年齡的豬均可感染，最明顯的特征就是水瀉，發(fā)病率 較高，仔豬死亡率較高。其作用機理一般都是吸附于小腸粘膜上，感染上皮細胞而使小腸吸 收和代謝紊亂，造成腹瀉的發(fā)生。因此，提高豬小腸局部免疫能力，抑制病原對小腸粘膜的 吸附和增值是治療和預(yù)防傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的關(guān)鍵。本TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體 通過口服直接被小腸吸收，提高了小腸的局部免疫力，抑制了病原對小腸粘膜的吸附和增 殖。本發(fā)明方法制備的豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體，采用兩種免 疫原制備預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉這兩種疾病，具有特異性高，針對性強 的特點，對治療和預(yù)防豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉有重要意義。
具體實施例方式為了舉例說明，以非限制性的方式提供下面的實施例。實施例1豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)增殖及抗原制備1. TGEV病毒增殖及抗原的制備將傳染性胃腸炎病毒液接種3瓶PK15細胞(瓶底面積25cm2)，每瓶細胞接種 Iml病毒液，蓋好瓶蓋，橫臥瓶管輕輕轉(zhuǎn)動，使病毒液與整個細胞單層充分接觸，37°C吸附40min，其間每隔IOmin晃動1次，無需吸棄病毒液，直接加含2%胎牛血清的DMEM細胞維持 培養(yǎng)液5ml，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后倒掉維持液進行換液。逐 日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變(CPE)不明顯，則收獲細胞懸液-20°C 20°C反復(fù) 凍融3次后在4°C條件下3000rpm離心30min取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代 出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，-20°C 20°C反復(fù)凍融3次，然后在4°C 條件下，3000rpm離心30min，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮后用作抗原。2. PEDV病毒增殖及抗原的制備將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液-20°C 20°C反復(fù)凍融3次后于4°C條件下3000rpm離心30min，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲 傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時，表現(xiàn)為細胞融合和圓縮，部分細胞 脫落，出現(xiàn)空斑化。此時收獲細胞懸液，_20°C 20°C反復(fù)凍融3次后在4°C條件下，3000rpm 離心30min，除去細胞碎片，收集上清液，濃縮后用作抗原。實施例2 TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體的制備1.免疫原制備取收獲的TGEV抗原和PEDV抗原以1 1的比例混合后，按總量的0. 1 %加入甲 醛溶液(40%水溶液)，37°C滅活24h，作為首免用免疫原。將上述滅活的抗原96份加4份 吐溫-80混合后作為水相(用前現(xiàn)配)；油相制備94份白油+6份司盤-80，再按0.015g/ ml的量加入硬脂酸鋁，水浴加熱混合后，121°C高壓滅菌30min，備用；乳化先加入油相， 3000rpm預(yù)攪拌5min，然后慢慢加入水相，邊加邊搖晃，攪拌30s后，將轉(zhuǎn)速調(diào)至12000rpm， 攪拌5min即可，放4°C備用。取乳化后的滅活苗IOml于15ml離心管中，3000rpm離心15min， 下層分層液體量小于0.5ml即表明乳化成功。乳化成功后的免疫原作為二免、三免和四免 用免疫原。2.免疫首免時對雞胸肌、腿肌多點注射，同時滴鼻、點眼共Iml ；2周后進行二免，用乳化 后的油苗，與初免時免疫劑量和途徑相同；再隔2周進行三免(免疫量為2ml，途徑相同)， 再隔6周后進行第四次免疫(免疫量為2ml，途徑相同)。3.蛋黃液的制備3. 1.蛋黃的收獲及滅活二免后1周開始收集經(jīng)抽檢合格的免疫雞所產(chǎn)高免雞蛋，將蛋殼消毒，采取手工 或機械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃。充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，力口 入等體積經(jīng)121°C 30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62. 5°C加熱滅活30min。3. 2.抗體的酸化蒸餾水法提純先在隔層反應(yīng)罐中加入相當于原蛋黃6倍體積的pH值為4. 2的滅菌蒸餾水，并降 溫至1 4°C。然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4 8°C靜置4h。管式低溫連續(xù)離 心機HOOOrpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中。3. 3.抗體的辛酸法提純按總量的0. 2%加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過濾后，再用K型多層 板框過濾至澄清，再按總量的0. 加入甲醛溶液(40%水溶液)于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫放置24h，期間振搖數(shù)次。3.4.過濾除菌
用0. 22 μ m微孔濾芯過濾除菌。用截留分子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒。4.抗體效價檢測(瓊脂擴散法)4. 1.實驗準備TGEV和PEDV標準陽性血清，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 提供；抗原，由實施例1制備；瓊脂糖、打孔器、16#針頭、剪刀、鑷子、酒精燈、記號筆、潔凈平 皿、水浴鍋。4. 2. TGEV瓊擴抗原的制備用聚乙二醇(PEG-20000)干粉包埋透析袋進行抗原濃 縮。透析袋的處理方法4. 2. 1. 0. 5mol/LEDTA-2Nalml 加 IOg 碳酸氫鈉，補蒸餾水至 500ml，調(diào) pH 至 8. 0。4. 2. 2.透析袋放上述液體中煮沸l(wèi)Omin。4. 2. 3.取出透析袋蒸餾水清洗干凈，再放蒸餾水中煮沸l(wèi)Omin。4.2.3.冷卻后可用。(如果暫時不用，可放苯鉀酸鈉或疊氮化鈉中保存)4.2.4.用過的透析袋同法處理，放50%甘油水溶液或50%乙醇水溶液中保存，下 次用前蒸餾水洗凈即可。4. 2. 5.注意取透析袋一定要戴手套。將40ml病毒液倒入處理后的透析袋中，扎緊袋口，放在干凈鋁盒中，用聚乙二醇 (PEG-20000)干粉包埋透析袋，放4°C透析。觀察透析袋中液體剩余3_4ml時取出，吸出濃 縮的抗原即為制備的瓊擴抗原。用同樣的方法制備PEDV瓊擴抗原。4. 3. 1 %瓊脂糖平板的準備取0. Olmol/L 的 PBS (pH7. 0)液 100ml，加瓊脂糖 lg, Nacl 8. 0g，煮沸融化后濾去 沉淀，加0. 01%的硫柳汞防腐，冷卻到50°C左右倒置瓊脂板。在直徑90mm的平皿中注加融 化的瓊脂糖16ml。瓊脂糖厚度不少于2. 8mm，4°C冷卻后打孔。4. 4.操作步驟4. 4. 1.取瓊脂糖平板用六角形七孔模具打孔，孔徑5mm，孔距為3mm。瓊脂用打孔 器打孔后，在酒精燈外焰上過一下，對孔的底部進行封口，以防蛋黃液滲漏。4. 4. 2.抗原標定中間孔加TGEV (或PEDV)標準陽性血清，周圍孔從最上方孔開始依次加入抗原原 液、2倍稀釋的抗原、4倍稀釋的抗原、8倍稀釋的抗原、16倍稀釋的抗原、32倍稀釋的抗原。 每孔加液40 μ 1，加樣完畢后，將瓊脂糖板放在鋪有濕紗布的帶蓋容器中，并用支持物將瓊 脂糖平板放穩(wěn)，置37°C溫箱濕盒內(nèi)反應(yīng)24 72h，直至沉淀線產(chǎn)生。以出現(xiàn)沉淀線最明顯 的稀釋度的抗原作為標準抗原。4. 4. 3.抗體效價的測定將收獲的待測定抗體效價的卵黃用0. 01mol/L的PBS(pH7. 0)作倍比稀釋，稀釋度 分別為1X、4X、8X、16X、32X、64X及更高的稀釋倍數(shù)。中間孔中加入標定的TGEV(或 PEDV)抗原，周圍孔中加入不同稀釋度的抗體，其中1孔加入標準陽性血清，每孔加液 40 μ 1，加樣完畢后，將瓊脂糖板放在鋪有濕紗布的帶蓋容器中，并用支持物將瓊脂糖平板 放穩(wěn)，置37°C溫箱濕盒內(nèi)反應(yīng)24 72h，直至沉淀線產(chǎn)生。以觀察到沉淀線的抗體最大稀 釋倍數(shù)為檢測樣品的抗體效價。
4. 5.結(jié)果判定 陽性血清與對應(yīng)抗原孔中間形成一條清晰、致密的沉淀線時，才能進行判定。陽性被檢蛋黃液與抗原孔中間形成沉淀線，并與陽性血清沉淀線彎曲環(huán)連，判為 陽性⑴。可疑沉淀線不清晰或陽性對照沉淀線向被檢血清孔微彎時，判為可疑(士)。可 疑樣品應(yīng)予重檢，重檢結(jié)果相同時應(yīng)判為陽性(+)。陰性無沉淀線出現(xiàn)為陰性。沉淀線與陽性對照沉淀線交叉或不相連時，均屬非特 異性反應(yīng)。判為陰性(_)。5.提純的蛋黃抗體凍干將提純并經(jīng)檢驗合格的蛋黃抗體液小量分裝于西林瓶，于凍干機上凍干過夜，凍 干過程中溫度最低降至_38°C，維持3 4h至完全凍干，然后逐漸恢復(fù)至室溫，取出貯存于 4°C。實施例3 TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體治療試驗取1日齡未吃初乳無TGEV和PEDV發(fā)病史的仔豬16頭，試驗動物房溫度控制在 25 30°C，采用人工哺乳方法，每隔2h飼喂1次牛奶，飼喂觀察1天后隨機分為4個小組， 分別為攻毒治療組(4頭)、攻毒不治療組(4頭)、治療不攻毒組(4頭)和不治療不攻毒 組(4頭)。攻毒所用病毒為超濾的TGEV和PEDV經(jīng)0. 01mol/L的PBS (pH7. 4) 10倍稀釋后 直接口服，攻毒劑量為最小發(fā)病量的5倍，每頭仔豬攻毒劑量相同，觀察仔豬攻毒后的腹瀉 情況。待仔豬剛開始出現(xiàn)腹瀉癥狀時治療組飼喂TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體，治療所用蛋黃 抗體為提純級樣品，瓊脂擴散試驗測定蛋黃抗體效價為1 64。不抬療組飼喂等量生理鹽 水，逐日觀察每頭仔豬腹瀉癥狀和TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體治療效果，以糞便指數(shù)和死亡 率2個指標判斷TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體的治療效果。糞便指數(shù)按照Sherman等(Sherman D Μ, Acres S D, Sadowski P L, et al. Protection of calvesagainst fatal enteric colibacillosis by orally administered Escherichiacoli K99_specipic monoclonal antibody [J], Infectlmmun, 1974，10 :770_782.)制定的標準判定，即0分為正常；2分為中 度腹瀉，糞便呈黃色水樣；3分為重度腹瀉，糞便呈水樣噴射。攻毒后12 24h所有仔豬均出現(xiàn)不同程度的黃色水瀉，攻毒治療組在口服 TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體1天后腹瀉癥狀減輕，2天后變?yōu)辄S色稀糞，3天后糞便變粘稠， 4 5天后變?yōu)槌尚蔚能浖S；不攻毒治療組與不攻毒不治療組仔豬精神狀態(tài)正常，無腹瀉癥 狀；攻毒不治療組仔豬腹瀉呈水樣噴射，2 3天后因極度脫水死亡。結(jié)果見表1。表1仔豬攻毒治療后不同天數(shù)死亡情況及糞便指數(shù) 注分母為存活仔豬數(shù)，分子為腹瀉仔豬數(shù)；括號內(nèi)為平均糞便指數(shù)試驗結(jié)果表明兩不攻毒組仔豬生長正常，未出現(xiàn)腹瀉癥狀，飼喂TGEV-PEDV 二聯(lián) 蛋黃抗體與否對其生長沒有影響；而兩攻毒組仔豬均出現(xiàn)嚴重的腹瀉癥狀，表現(xiàn)為黃色水瀉，仔豬迅速消瘦，不用蛋黃抗體治療組仔豬3天全部死亡，而蛋黃抗體治療組仔豬腹瀉癥 狀則明顯減輕，糞便由水瀉變?yōu)檐浖S，并逐漸成形，一周左右逐漸恢復(fù)，未出現(xiàn)死亡情況。結(jié)論通過本發(fā)明所制的TGEV-PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體進行治療試驗，結(jié)果顯示能有效的的 降低仔豬死亡率和腹瀉癥狀，并逐步好轉(zhuǎn)，直至康復(fù)，具有完全的保護作用，對于防治豬腹 瀉具有明顯的效果。上列詳細說明系針對本發(fā)明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例并非用以限 制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實施或變更，均應(yīng)包含于本案 之專利范圍中。
權(quán)利要求
一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法，豬傳染性胃腸炎病毒用豬腎細胞傳代細胞培養(yǎng)，豬流行性腹瀉病毒用非洲綠猴腎細胞傳代細胞進行培養(yǎng)，將這兩種病毒以體積比(1～3)∶(1～3)的比例混合后與油佐劑以1∶2體積比乳化后作為免疫原，免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，從其蛋黃中提取豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒蛋黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于包括以下步驟(1)TGEV抗原的制備將傳染性胃腸炎病毒液接種在PK15單層細胞上，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則 收獲細胞懸液凍融后離心分離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細胞病 變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，凍融，離心分離，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮 后用作抗原；(2)PEDV抗原的制備將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明顯，則收獲細胞懸液凍融后離心分 離，取上層清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變 時，收獲細胞懸液，凍融后離心分離，收集上清液，濃縮后用作抗原；(3)蛋黃抗體的制備將TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，滅活24h后，作為首免用免疫原；取適量的 TGEV和PEDV抗原以1 1的比例混合，滅活24h后，與2倍量的油佐劑乳化，作為二免、三 免和四免用免疫原；用上述制備的免疫原對非免疫產(chǎn)蛋雞進行免疫，另設(shè)不免疫的空白對 照組；二免后1周開始每隔3天抽樣測定高免雞蛋蛋黃中抗TGEV、PEDV特異抗體效價；若抗 體效價達到1 8以上即可集蛋，收集蛋黃；充分攪拌使蛋黃呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)滅 菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，滅活；然后先在隔層反應(yīng)罐中加入相當于原蛋黃6倍體積的 pH值為4. 2的滅菌蒸餾水，并降溫至1 4°C，然后將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4 8°C靜置4h;離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中，按總量的0.2%加入辛酸，攪拌均勻，室 溫放置2 4h ；用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清，按總量的0. 加入飽和甲 醛水溶液于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫放置24h，期間振搖數(shù)次，過濾除菌，用截留分 子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒，得到提純的蛋黃抗體，即TGEV、PEDV 二聯(lián)蛋黃抗體；(4)將提純的蛋黃抗體液凍干貯存
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于所用豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的病毒含量都> IO6 0TCID50/ ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于TGEV抗原的制備程序是將傳染性胃腸炎病毒液接種3瓶PK15細胞，瓶底 面積25cm2，每瓶細胞接種Iml病毒液，蓋好瓶蓋，橫臥瓶管輕輕轉(zhuǎn)動，使病毒液與整個細胞 單層充分接觸，37°C吸附40min，其間每隔IOmin晃動1次，無需吸棄病毒液，直接加含2% 胎牛血清的DMEM細胞維持培養(yǎng)液5ml，同時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后倒掉維持液進行換液，逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變(CPE)不明顯，則收獲細 胞懸液-20°C 20°C反復(fù)凍融3次后在4°C條件下3000rpm離心30min取上層清液繼續(xù)在 細胞上盲傳，盲傳至第二代出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時收毒，-20°C 20°C 反復(fù)凍融3次，然后在4°C條件下，3000rpm離心30min，除去細胞碎片，收集上層清液，濃縮 后用作抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于PEDV抗原的制備程序是將流行性腹瀉病毒液接種于Vero細胞單層上，同 時設(shè)立細胞對照，37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；逐日觀察細胞病變，若72h后感染細胞病變不明 顯，則收獲細胞懸液-20°C 20°C反復(fù)凍融3次后于4°C條件下3000rpm離心30min，取上層 清液繼續(xù)在細胞上盲傳，盲傳至第三代出現(xiàn)細胞病變，至75%細胞出現(xiàn)細胞病變時，表現(xiàn)為 細胞融合和圓縮，部分細胞脫落，出現(xiàn)空斑化；此時收獲細胞懸液，-20°C 20°C反復(fù)凍融3 次后在4°C條件下，3000rpm離心30min，除去細胞碎片，收集上清液，濃縮后用作抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于免疫原的制備程序是取收獲的TGEV抗原和PEDV抗原以1 1的比例混合 后，按總量的0. 加入飽和甲醛水溶液，37°C滅活24h，作為首免用免疫原；將上述滅活的 抗原96份加4份吐溫-80混合后作為水相，現(xiàn)配現(xiàn)用；油相制備94份白油+6份司盤-80， 再按0. 015g/ml的量加入硬脂酸鋁，水浴加熱混合后，121°C高壓滅菌30min，備用；乳化先 加入油相，3000rpm預(yù)攪拌5min，然后慢慢加入水相，邊加邊搖晃，攪拌30s后，將轉(zhuǎn)速調(diào)至 12000rpm，攪拌5min即可，放4°C備用；取乳化后的滅活苗IOml于15ml離心管中，3000rpm 離心15min，下層分層液體量小于0. 5ml即表明乳化成功；乳化成功后的免疫原作為二免、 三免和四免用免疫原。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于免疫非免疫雞時所用免疫程序為首免時胸肌多點注射免疫原，同時滴鼻、 點眼共Iml ；2周后進行二免，注射免疫原Iml ；再隔2周后進行三免，免疫原2ml ；再隔4 8周后進行四免，免疫原2ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于蛋黃液的制備是二免后1周開始收集經(jīng)抽檢合格的免疫雞所產(chǎn)高免雞蛋， 將蛋殼消毒，采取手工或機械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃，充分攪拌 使蛋黃呈均勻膏狀，加入等體積經(jīng)121°C 30min滅菌并冷卻的蒸餾水，攪拌混勻，62. 5°C加 熱滅活30min。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方 法，其特征在于二聯(lián)抗體提純方法是先在隔層反應(yīng)罐中加入相當于原蛋黃6倍體積的pH 值為4. 2的滅菌蒸餾水，并降溫至1 4°C ；然后，將滅活的蛋黃液加入，邊加邊攪拌，4 8°C靜置4h ；管式低溫連續(xù)離心機HOOOrpm離心分離上清液并轉(zhuǎn)入另一反應(yīng)罐中；按總量 的0.2%加入辛酸，攪拌均勻，室溫放置4h。用濾布過濾后，再用K型多層板框過濾至澄清， 再按總量的0. 1 %加入飽和甲醛水溶液于上述濾液中，充分攪拌混勻，室溫放置24h，期間 振搖數(shù)次；用0. 22 μ m微孔濾芯過濾除菌；用截留分子量為IOOOKDa的超濾膜過濾除病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備 方法，其特征在于提純的二聯(lián)蛋黃抗體凍干貯存程序是將提純并經(jīng)檢驗合格的蛋黃抗體液小量分裝于西林瓶，于凍干機上凍干過夜，凍干過程中溫度最低降至_38°C，維持3 4h 至完全凍干，然后逐漸恢復(fù)至室溫,,取出貯存于4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉病毒二聯(lián)蛋黃抗體的制備方法。將豬傳染性胃腸炎病毒在豬腎細胞(PK15)上增殖，將豬流行性腹瀉病毒在非洲綠猴腎細胞(Vero)上增殖，取這兩種細胞培養(yǎng)物作為抗原，與油佐劑乳化后制備免疫原，即將這兩種病毒按照(1～3)∶(1～3)的比例混合制備免疫原，免疫非免疫產(chǎn)蛋雞，在收集蛋黃并提純的基礎(chǔ)上獲取了可用于預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉的二聯(lián)蛋黃抗體。使用本發(fā)明的蛋黃抗體治療試驗攻毒豬，試驗臨床癥狀比對照組明顯減輕，且試驗組的死亡率顯著低于對照組。將本發(fā)明提供的蛋黃抗體在豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉高發(fā)病率的豬場實地應(yīng)用，產(chǎn)生了明顯的預(yù)防和治療作用。
文檔編號C07K16/10GK101845095SQ201010166530
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者喬榮岑, 習向鋒, 孫進忠, 張海洋, 張許科, 李三, 郭麗霞, 陶家權(quán) 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司