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具有增強酸感受離子通道1a電流作用的多肽及其用途的制作方法

文檔序號:3567834閱讀:266來源:國知局
專利名稱:具有增強酸感受離子通道1a電流作用的多肽及其用途的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)學和分子生物學領域,具體而言,本發(fā)明涉及一組能與酸感受離子通道(ASICs)特異性結(jié)合并增強ASICla同聚體電流的多肽。
背景技術
酸感受離子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是H+門控的陽離子通道,位于細胞膜上,在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達。ASICs通道是鈉通道ENaC/ DEG (epithelial Na+channel/degenerin)家族重要成員之一,雖然它們與家族中其他成員只有20%-25%的同源性,但卻具有了家族成員的所有特征。到目前為止,共發(fā)現(xiàn)由4個基因編碼的6個亞基,它們分別是ASICla,ASIClb,ASIC2a,ASIC2b,ASIC3*ASIC4。每個亞基的長度都在500個氨基酸左右。其結(jié)構(gòu)包括兩個疏水跨膜區(qū),位于細胞內(nèi)的羧基端和氨基端,以及胞外作為受體接受H+的刺激信號的一段富含半胱氨酸的長鏈。ASICs由3個亞基組成,通道位于它們中央。亞基組合形式多種多樣,可以是同聚體也可以是異聚體通道(其中ASIC2b和ASIC4不能形成功能性同聚體)。這些由不同亞基組合形成的離子通道,其電生理學、藥理學特性和離子選擇性各有不同。當胞外組織液pH值下降時,ASICs被激活而開放,細胞外Na+或Ca2+通過其開放的離子通道進入胞內(nèi),導致細胞去極化而興奮。ASICs 在外周感覺神經(jīng)元的生物學功能涉及痛覺、觸覺、和酸味覺的形成;而在中樞神經(jīng)元,其功能則涉及突觸可塑性和學習記憶等活動。在病理情況下,如風濕性關節(jié)炎、心腦組織缺氧缺血、肌肉勞累、癲癇發(fā)作導致局部組織的酸增高或酸中毒時,ASICs開放,不僅形成和傳導傷害性感受信息,同時還可加重這些病理因素對相關組織造成的損傷。酸感受離子通道Ia(ASICla)主要在中樞的大腦皮層、海馬、小腦、上丘腦、脊髓和外周的背根節(jié)神經(jīng)元等部位表達,在外周軟骨組織、人類造骨細胞和味蕾細胞中也有表達。 亞細胞定位發(fā)現(xiàn),ASICla遍及胞體并沿著神經(jīng)元軸突和樹突的分支分布,但在突觸小體或突觸膜上分布很少。無論在中樞還是外周神經(jīng)系統(tǒng),神經(jīng)活動很活躍的地方以及神經(jīng)信號高頻傳導的局部,均為ASICla高表達區(qū)域。ASICla同聚體通道對H+敏感性較高(激活閾值pH為7. 0-6. 8),對Na+和Ca2+都有較高的通透性。近年來,ASICla亞基引起了越來越多研究者的注意。研究表明,ASICla參與了多種疾病的病例過程。首先,在大腦缺血過程中,由于血液供應不足,引起組織細胞缺氧,導致了組織液的酸化。這種酸化可激活ASICla同聚體通道,導致胞內(nèi)Ca2+超載,進而形成神經(jīng)元的損傷。在動物模型中,已經(jīng)證實了該通道的特異性阻斷劑狼蛛毒素PcTXl具有缺血性神經(jīng)保護作用;該基因敲除后也可有效保護酸化所致的神經(jīng)損傷。其次,該亞基同聚體還與癲癇發(fā)作的持續(xù)時間密切相關。過表達該基因可有效縮短癲癇的持續(xù)時間,傳統(tǒng)的CO2療法也依賴于ASICla。第三,該通道還涉及抑郁癥病理,其拮抗劑對抑郁癥有較好的治療效果。 綜上所述,該通道已經(jīng)成為了多種疾病的靶標分子,針對ASICla亞基進行激動劑或拮抗劑的篩選具有重要的意義。近幾十年來,多肽在人體中的作用已引起科學界的高度重視,涉及人體的激素、神經(jīng)、細胞生長和生殖等各個領域。多肽類藥物的主要特點是用量小、生物活性強,對癌癥、自身免疫性疾病、記憶力減退、精神失常、高血壓和某些心血管及代謝等疾病有顯著的療效和廣泛的應用前途。獲取特異多肽最經(jīng)典和最有效的手段是噬菌體肽庫展示技術,該技術是將外源DNA通過基因工程技術克隆到適當?shù)氖删w載體上,使外源DNA片段對應的表達產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白,呈現(xiàn)在噬菌體表面。利用靶分子采用適當?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y(jié)合的噬菌體,最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體。目前已廣泛用于抗原表位分析、分子間相互識別、新型疫苗及藥物開發(fā)等各個方面。這項技術通過“吸附一洗脫一擴增”的親和篩選過程,可以將展示特異性外源肽的噬菌體從噬菌體肽庫篩選出來,經(jīng)擴增可以得到上千倍乃至IO8的倍的富集,從而可以很容易地對所篩選的克隆進行序列測定,最終確定表達的外源肽的氨基酸序列。 由于篩選ASICla亞基的激動劑或拮抗劑具有重要的實用價值,我們希望利用噬菌體表面肽庫能夠篩選到新的ASICla亞基的激動劑或拮抗劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用噬菌體表面展示技術,以ASICla胞外區(qū)為靶標,篩選具有激動或抑制其電流的多肽。應用這些多肽,一方面可以開展ASICla相關的基礎研究,另一方面還可以探索以其為靶標治療相關疾病的可行性。為了達到上述目的,本發(fā)明通過表達、純化酸感受離子通道Ia胞外區(qū),得到純化蛋白,然后以該蛋白為靶標,篩選環(huán)七肽庫和十二肽庫,得到了 14種與胞外區(qū)結(jié)合活性較高的多肽,通過與GST融合表達,得到了相應的GST融合表達肽,將GST融合表達肽用 GSTrap FF純化柱進行純化。通過爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)和體外急性分散培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元系統(tǒng),使用雙電極電壓鉗和全細胞記錄技術檢測了融合表達肽和合成肽的活性。發(fā)現(xiàn)在特異性表達ASICla亞基的爪蟾卵母細胞和培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上,單純使用 GST-P13不能誘發(fā)出任何電流,但能夠使胞外H+誘發(fā)的內(nèi)向電流幅度明顯增加,其作用是可逆的?;谝陨霞夹g方案和實驗結(jié)果,本發(fā)明涉及以下幾個方面本發(fā)明的一個方面涉及一種具有酸感受離子通道Ia結(jié)合活性的多肽,其選自SEQ ID NO 1-10中的至少一種。序號氨基酸序列
PlMPSFNYQ(SEQ ID NO:1)
P2HSILTTY(SEQ ID NO2)
P3PSHRPFM(SEQ ID NO3)
P6THHTHEH(SEQ ID NO4)
P7HHGSARH(SEQ ID NO5)
P8HYQHMHSRLGVH(SEQ ID NO6)
P9EGTVEMIffAYSI(SEQ ID NO7)
PllHYFSNQA(SEQ ID NO8)
P13ISffEIQYKSLPL(SEQ ID NO:9)
P14AATLYQRPISPM(SEQ ID NO:10)
4
根據(jù)以上所述的多肽,其為SEQ ID NO 9所示的多肽。本發(fā)明另一方面涉及一種融合肽,其可操作地連接有一個或幾個SEQ ID NO=I-IO 中所示的肽,所述肽可以相同或不相同。本發(fā)明的另一方面涉及一種融合蛋白,其可操作地連接有一個或幾個SEQ ID NO 1-10中所示的肽,所述肽可以相同或不相同,以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白。其中,起靶向作用的蛋白是指靶向于特異器官或細胞亞結(jié)構(gòu)的分子,方便純化的蛋白是指標簽如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和多聚組氨酸(HIQ等。本發(fā)明的另一方面涉及一種DNA或RNA序列,其編碼如上所述的多肽或蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體,其含有上述的DNA或RNA序列。本發(fā)明還涉及如上所述多肽或蛋白在制備酸感受離子通道Ia靶向治療藥物中的用途。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO 9所示的多肽作為酸感受離子通道Ia激動劑的用途。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物,其含有如上所述多肽或蛋白,以及藥學上可接受的載體。發(fā)明的有益效果本發(fā)明篩選出的多肽對ASICla具有較高的親和力并且對ASICla功能有明顯的影響,提示這些多肽對以ASICla為靶標的疾病防治具有潛在的應用價值。


圖 1 純化的 GST-ASICla 胞外區(qū) SDS-PAGE 圖(A)及純度圖(B)。1. GST-ASICla 胞外區(qū);2.蛋白分子量標準(Da)圖2通過ELISA鑒定篩選噬菌體隨機肽庫得到的GST-ASICla胞外區(qū)結(jié)合噬菌體。圖3結(jié)合噬菌體展示的多肽序列。圖4純化的GST融合多肽的SDS-PAGE圖。圖5雙電極電壓鉗實驗檢測GST-P13對爪蟾卵母細胞中表達的ASICla同聚體電流的激動作用。A圖表示所記錄的電流對阿米洛利(Amiloride)敏感,這與該電流特征相符;同時GST對該電流無明顯影響,表明用GST融合多肽測試多肽對電流的影響是可行的。 B所示GST-P13對ASICla同聚體電流的激動作用。圖6膜片鉗實驗檢測合成P13對大鼠海馬神經(jīng)元ASIC電流的激動作用。當胞外液PH值下降時,可記錄到ASIC電流,給予合成的P13后,電流增大,而重新給予低pH值刺激時,電流恢復,表明P13對海馬中表達的ASIC電流的增強作用是可逆的。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述,但是本領域技術人員將會理解,下列實施例僅用于說明本發(fā)明,而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者,按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 ASICla胞外區(qū)的克隆、表達與純化
1.材料GSTrap FF純化柱購自于Pharmacia Biotech公司;溶菌酶購自于 Promega公司;超聲破碎儀購自于寧波新芝科技有限公司,高保真Taq酶和內(nèi)切酶購自 TAKARA公司。原核表達載體pGEX-4T2購自于Pharmacia Biotech公司。2.實驗方法(1) PCR和表達載體的構(gòu)建以大鼠全腦總RNA為模板進行擴增。上游引物為5' -CGCGGATCCACTgAgCgTgTgC AgTACT-3 ‘ (SEQ ID NO 11);下游引物為 5' -GCGCTCGAGTCATTCAgCgCTgCAggCCTC-3 ‘ (SE Q ID NO: 12),PCR擴增程序為:95°C,5分鐘;以94°C,1分鐘,55°C,1分鐘,72°C,1分鐘,進行35個循環(huán)。將得到的PCR產(chǎn)物純化,然后和pGEX-4T2同時用BioI和BamHI酶切,連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)菌株中。對轉(zhuǎn)化子進行酶切鑒定和測序。(2)表達菌株的培養(yǎng)與目標蛋白的誘導表達取上述構(gòu)建好的載體菌株20 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中,37°C空氣搖床培養(yǎng)過夜,次日按5% (體積百分比)的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基,37°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時,當0D600值達到0. 7時,加入終濃度為ImM的IPTG誘導4_5個小時,收獲細菌。(3) ASICla胞外區(qū)蛋白的純化將上述收獲的細菌離心后棄去上清,將菌體進行超聲破碎,將超聲處理后的菌液于4°C,12,000r/min離lOmin。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式,證明目的蛋白以可溶性形式存在,分子量約為38kD。將離心上清用GSTrap FF親和純化柱進行純化。首先將樣品結(jié)合于純化柱,然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白,用lOmmol/L還原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl緩沖液配制,pH8. 0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測純化效果,并進行了純度測定(圖1)。結(jié)果表明獲得了與預期分子量相符并且純度較高的靶標蛋白。實施例2 ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽的篩選1.材料噬菌體隨機環(huán)七肽庫和十二肽庫均購自New EnglandBiolab。2.實驗方法在得到實施例1中純化的ASICla胞外區(qū)蛋白的基礎上,以其為靶標從噬菌體隨機環(huán)七肽庫和十二肽庫中,分別經(jīng)過三輪篩選得到了特異的與ASICla胞外區(qū)蛋白結(jié)合的肽 (篩選方法參照隨機肽庫說明書)。利用ELISA對篩選得到的結(jié)合肽噬菌體進行鑒定。具體方法為,用濃度為50 μ g/ml的GST-ASICla胞外區(qū)融合蛋白和50g/ml的GST蛋白100 μ 1 4°C包被酶聯(lián)板過夜,每個孔設平行對照。10%奶粉37°C封閉Ih ;然后每孔各加100μ 1 (約 IO11 pfu/ml)單克隆噬菌體上清,37°C作用Ih;每孔加1 5000倍稀釋的HRP-抗M13 二抗 100μ 1,37°C反應Ih ;加入100μ 1 TMB顯色液顯色,反應IOmin后加50 μ 1 2Μ的H2S04終止反應,測0W450nm)值。由圖2可以看出,有10個噬菌體克隆表現(xiàn)出了對靶標融合蛋白較高的親和力,與陰性對照(標簽蛋白GST)的親和力差異顯著,表明它們與ASICla胞外區(qū)結(jié)合而不是與標簽蛋白GST結(jié)合。通過DNA序列分析,推斷出相應的結(jié)合肽氨基酸序列,共得到了 10種ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽(圖3)。實施例3 GST-多肽融合蛋白的表達和純化為了探討篩選到的ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽能否具有調(diào)控ASICla電流的活性,將多肽(ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽)分子分別與GST融合表達并純化。1.材料GSTrap FF純化柱購自于Pharmacia Biotech公司;溶菌酶購自于 Promega公司;超聲破碎儀購自于寧波新芝科技有限公司。原核表達載體pGEX_4T2購自于 Pharmacia Biotech2.實驗方法(I)GST-多肽融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建為了不影響結(jié)合肽本身的結(jié)構(gòu),在合成結(jié)合肽編碼序列時引入了三個甘氨酸和一個絲氨酸密碼子,并在此序列的兩端加上了 BamH I和)(h0 I酶切位點。將合成的多肽基因片段的兩互補序列分別溶于滅菌的去離子水中,使其終濃度為1 μ g/μ ,各取5 μ 1,加入 40 μ 1滅菌去離子水中,終體積為50 μ 1,混勻后放入95°C水浴中5分鐘,然后緩慢降至室溫使兩互補片段退火。將經(jīng)BamH I和)(h0 I酶切回收的pGEX_4T2載體片段與上述退火的結(jié)合多肽基因片段按1 5的摩爾比連接,并轉(zhuǎn)化E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細胞。挑單克隆測序。(2) GST-多肽融合蛋白的表達與純化將上述經(jīng)測序鑒定正確的重組菌菌液按1 100接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 5,加入終濃度為0. 1-0. 5mmol/L的IPTG誘導表達 3小時,離心后,棄去上清,將菌體進行超聲破碎,將超聲處理后的菌液于4°C,12,000r/min 離心IOmin0將離心上清用GSTrap FF親和純化柱進行純化。首先將樣品結(jié)合于純化柱,然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白,用lOmmol/L還原型谷胱甘肽(用50mmol/L 的Tris-HCl緩沖液配制,pH8. 0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測純化效果(圖4),表明已得到GST-多肽融合蛋白。實施例4 GST-融合多肽對ASICla電流的影響為了進一步探索這些GST-融合多肽對ASICla電流的影響,需要將轉(zhuǎn)錄好的 ASICla cRNA注射入爪蟾卵母細胞,記錄電流,觀察多肽對電流產(chǎn)生的效應。1.材料反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Reverse Transcription System A3500 購自 Promega 公司;成熟雌性非洲爪蟾購自中國科學院;雙電極電壓鉗裝置(放大器、示波器、AD轉(zhuǎn)換板、 兩電極探頭)購自美國Axor^nstrument ;膠原酶(typelA)購自SIGMA公司;微電極拉制儀 (pp-830型)購自日本Narishige公司。pcDNA3. 1載體購自hvitrogen公司。2.實驗方法(I)ASICla 表達載體 pcDNA3. 1-rASICla 的構(gòu)建以大鼠全腦總RNA為模板進行擴增。所用引物為上游5’ -CggATCCATggAATTgAAg ACCgAggA-3 ‘ (SEQ ID NO 13)和下游5,-CgATATCTgCAggTAAAgTCCTCAAACg-3 ‘ (SEQ ID NO 14),PCR程序為:95°C,5分鐘;以94°C,1分鐘,55°C,1分鐘,72°C,2分鐘,進行35個循環(huán)。將得到的PCR產(chǎn)物純化,然后和pcDNA 3. 1同時用EcoRV和BamHI酶切,連接后轉(zhuǎn)化, 對轉(zhuǎn)化子進行酶切鑒定和測序,即獲得ASICla表達載體pcDNA3. 1-rASICla。(2)目標基因的體外轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System的要求,首先將上述獲得的 pcDNA3. Ι-rASICla線性化,按試劑盒所述體系將cDNA體外轉(zhuǎn)錄成cRNA,然后純化cRNA,測濃度備用。(3)爪蟾卵母細胞的注射手術器械在75%乙醇溶液中浸泡30分鐘,取出晾干,沸水中消毒5-0絲線10分鐘;將爪蟾掩埋于碎冰下40分鐘使其麻醉;把已麻醉的爪蟾腹部向上放置于碎冰托盤上, 用碎冰掩埋其頭部和四肢;酒精棉球消毒下腹部皮膚,然后用針頭挑起下腹部皮膚,用眼科剪剪開一個Icm左右小口,再剪開肌肉層;小心取出Icm3左右的卵巢小葉,放入0R-2溶液(NaCl 82mM ;KCl 2. 5mM ;MgC12 1. OmM ;HEPES 5. OmM,pH7. 6)中,分別縫合肌肉層和皮膚層。用干凈的移液管將卵母細胞轉(zhuǎn)入無菌的玻璃離心管中,反復用0R-2溶液清洗,去除殘留血液,然后加入膠原酶溶液振搖1小時,再更換新的膠原酶溶液繼續(xù)振搖1小時;除去消化液,用0R-2溶液清洗5 6次,轉(zhuǎn)入盛有ND-96溶液(NaCl 96mM ;KCl 2. OmM ;CaCl2 1. 8mM ;MgCl2 1. OmM ;HEPES 5. OmM ;Na-pyrnvate 2. OmM, ρΗ7· 6)的培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下觀察并挑選出外型較圓、色澤清晰、有一定張力、細胞表面光滑、無殘留纖維組織及毛細血管的V、VI期成熟卵母細胞,將挑選出的好的細胞放入盛有ND-96溶液的培養(yǎng)皿中,置于生化培養(yǎng)箱中18 22°C保存?zhèn)溆?。將專用注射針用兩步法電極拉制儀拉制好后,在干凈的薄面巾紙上刺一下,使針尖的口徑變粗,并在拋光儀上拋光,使得針尖光滑平整。根據(jù)上述所得原始cRNA的濃度,調(diào)整注射濃度大約為2ng/nl。取1 μ 1混合好的cRNA小心滴在干凈的parafilm上,用微量注射儀將cRNA吸入到注射用針中。將挑選好的健康的V、VI期成熟卵母細胞置入底部粘有網(wǎng)格的培養(yǎng)皿中。仔細調(diào)節(jié)三維微操縱儀,使針尖接觸細胞表面。將50nl cRNA注射入卵母細胞,注射后細胞會輕微鼓脹。注射好的卵母細胞置于ND-96溶液中,在生化培養(yǎng)箱(20°C 左右)培養(yǎng)4 后,可記錄表達電流。(3) GST-融合多肽對ASICla電流的影響卵母細胞置于容積約Iml的記錄槽中,各種不同細胞外液持續(xù)灌流的速度為:3ml/ min。使用微電極拉制儀拉制玻璃微電極,灌充3mol/LKCl溶液,電阻為0. 5 5ΜΩ。將拉制好的兩根玻璃微電極分別插入到放大器的探頭上。使用微操動儀分別將兩只電極放入記錄槽中,當電極尖端進入液面后,將放大器面板上的mV、V2調(diào)節(jié)至零電位,同時測量電極的電阻是否滿足實驗需要。采樣軟件為pClamp7.0(AXonInStrumentS公司產(chǎn)品)。所有實驗在室溫Ol 23°C)下進行。GST-融合多肽及GST的工作濃度為5μΜ,其中GST為陰性對照。由圖5Α可以看出,當胞外液ρΗ值下降時,可記錄ASICla電流,該電流對阿米洛利敏感,符合文獻報道中的電流特性,融合多肽GST-P13對ASICla電流有增強作用(n = 3,圖 5Β),而單獨的標簽蛋白GST則對電流沒有影響。實驗結(jié)果表明,在篩選得到的十個多肽中,多肽Ρ13具有增強H+誘發(fā)ASICla同聚體電流激動活性的作用。實施例5多肽Ρ13對海馬神經(jīng)元ASIC電流的影響為進一步求證Ρ13對ASICla的作用,本實驗選擇海馬神經(jīng)元作為模型。根據(jù)文獻報告,海馬神經(jīng)元中酸感受離子通道電流中ASICla同聚體所占比例較大。另外,為去除其它因素的干擾,本實驗所用的多肽為公司合成的純品。1.材料Wistar大鼠(出生12h以內(nèi)),二級,由軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。 L-多聚賴氨酸和阿糖胞苷購自Sigma公司。N-2添加劑和B-27添加劑購自Gibcol。放大器(Axopatch 1-D)、AD轉(zhuǎn)換板(1200series)和電極探頭(CV-4)均購自美國Axon公司。 微操縱儀(Mo-203)購自日本Narishige公司。P13多肽由賽百盛公司合成。2.實驗方法(1)大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)取當天新生Wistar大鼠,用75%乙醇消毒。在無菌條件下取腦,剝離出海馬置于冰浴的解剖液(葡萄糖 3. Og,蔗糖 7. 5g,NaCl 8. Og, KCl 0. 4g,Na2HP04 · 7H20 0. 18g, KH2P04 0. 03g,青鏈霉素個10萬單位,用含9. OmM HEPES的緩沖液溶解,加水到1000ml,調(diào) PH值為7. 3。用0.2μπι的微孔濾膜過濾,4°C保存?zhèn)溆?中。將海馬剪成l_2mm3的組織塊,用含0.25% (質(zhì)量/體積百分比)胰蛋白酶的解剖液在37°C下消化30min,然后將消化好的組織塊移入種植液(DMEM培養(yǎng)基79%,馬血清10%,胎牛血清10%,谷氨酰胺儲備液1%,青鏈霉素100單位/ml,使用前池配制,放在37°C 10% C02培養(yǎng)箱中備用)中終止消化,在種植液中用適當口徑(尖端直徑2mm)的滴管吹打細胞,使之均勻分散,制成細胞懸液,取少量懸液以臺盼藍染液記數(shù)細胞。加入適量種植液,將細胞按1 XlO5Ail的密度接種在涂有多聚賴氨酸的35mm培養(yǎng)皿中,置于36°C 10%的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜,24h后更換培養(yǎng)基,將種植液換為2ml飼養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基約86%,馬血清10%,N_2 1%, B-27 2%, 谷氨酰胺儲備液1 %,青鏈霉素100單位/ml,使用前池配制,放在37°C、10% C02培養(yǎng)箱中備用)。以后每3天半量換液一次,培養(yǎng)細胞在12-15天期間用于膜片鉗實驗。為抑制非神經(jīng)元過度增殖,在培養(yǎng)的第3天向培養(yǎng)基中加入適量阿糖胞苷。(2)膜片鉗方式記錄ASIC電流將培養(yǎng)好的海馬細胞加入1. 5-2. Oml細胞外液(NaCl 150mM, KC15mM, MgCl2 2mM, CaCl2 2mM,葡萄糖 10mM,HEPES 10mM,pH7. 45,CNQX20mM,犬尿烯酸 IOmM)。在倒置相差顯微鏡下,通過微操縱儀將充滿電極內(nèi)液的記錄電極輕輕壓向細胞表面,并通過示波器和放大器的聲音監(jiān)控裝置監(jiān)測電極電阻的變化。通過記錄電極內(nèi)部施加10-30cmH20負壓,使電極和細胞表面形成緊密封接。調(diào)節(jié)放大器進行電容補償,建立細胞貼附式記錄,在此基礎上繼續(xù)施加負壓或用1.5V 5-lOms的短時脈沖擊破細胞膜,即形成全細胞記錄。在給予酸性細胞外液(PH6. 0)后,可記錄到ASIC電流,在酸性胞外液中加入濃度為10μΜ的P13多肽,發(fā)現(xiàn)該多肽對海馬神經(jīng)元本身的ASIC電流也有刺激作用(n = 3),當換回酸性胞外液時,可見電流恢復,表明這種增強作用是可逆的,見圖6。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細的描述,本領域技術人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導,可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換,這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種具有酸感受離子通道Ia結(jié)合活性的多肽,其為選自SEQID N0:l_10中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽,其為SEQID NO :9所示的多肽。
3.一種融合肽,其可操作地連接有一個或幾個SEQ ID NO :1-10中所示的肽,所述肽可以相同或不相同。
4.一種融合蛋白,其可操作地連接有一個或幾個SEQ ID NO :1-10中所示的肽,所述肽可以相同或不相同,以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白,其中起靶向作用的蛋白是指靶向于特異器官或細胞亞結(jié)構(gòu)的分子,方便純化的蛋白是指谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和多聚組氨酸。
6.一種DNA或RNA序列,其編碼權(quán)利要求1_4所述的多肽或蛋白。
7.一種載體,其含有權(quán)利要求6中所述的DNA或RNA序列。
8.權(quán)利要求1-4中所述多肽或蛋白在制備酸感受離子通道Ia靶向治療藥物中的用途。
9.權(quán)利要求2所述的多肽作為酸感受離子通道Ia激動劑的用途。
10.一種藥物組合物,其含有權(quán)利要求1-4中所述多肽或蛋白,以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組與酸感受離子通道1a(ASIC1a)亞基具有特異性結(jié)合能力及生物學活性的多肽類分子的序列。使用細胞電生理技術證明,其中一個多肽P13能明顯增加胞外pH值下降誘發(fā)的ASIC1a同聚體電流。本發(fā)明還涉及編碼這些多肽的基因序列以及含有多肽的融合蛋白。本發(fā)明還涉及這些多肽在制備酸感受離子通道1a靶向治療藥物中的用途以及多肽P13作為酸感受離子通道1a激動劑的用途。這些多肽在探索ASIC1a離子通道的生物學功能、研究ASIC1a相關疾病的病理機制及其治療方面具有潛在的應用價值。
文檔編號C07K19/00GK102234316SQ20101017000
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者于金梅, 劉曉燕, 吳寶紅, 張樹卓, 李昕, 鄭建全, 閆海濤, 馬曉蕓, 魏曉莉 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所
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