專利名稱：一種含凝血酶片段融合肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508。本發(fā)明還涉及含有所述S-TP508的藥物組合物。本發(fā)明還涉及所述S-TP508用于制備治療皮膚組織損傷與角膜損傷藥物的用途。本發(fā)明還涉及利用所述S-TP508治療皮膚組織損傷與角膜損傷的疾病的方法。二.
背景技術(shù)：
凝血酶是由凝血酶原(Porthormbin)轉(zhuǎn)化而來(lái)的一種絲氨酸蛋白酶，在體內(nèi)的主要作用是催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，誘導(dǎo)血小板粘附、聚集和釋放等反應(yīng)，是血小板的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，因而在血液凝固中起重要作用。現(xiàn)已證明，凝血酶除了其血液凝固作用外，還可刺激成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞增生等，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面也起重要作用。TP508 (凝血酶受體激活肽)是取自人凝血酶原分子序列第508 530個(gè)氨基酸殘基的片段，研究發(fā)現(xiàn)具有可特異性激活細(xì)胞表面的高親合性凝血酶受體，刺激細(xì)胞分裂和趨化，參與組織修復(fù)，刺激細(xì)胞增生和促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功能。由于TP508是只有23個(gè)氨基酸組成的短肽(見序列為SEQ ID NO :1中12-34位氨基酸序列)，所以半衰期短，穩(wěn)定性差。因而我們?cè)赥P508的N端加上了一段穩(wěn)定肽(見序列為SEQID NO 1中1-11位氨基酸序列)，這段穩(wěn)定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸組成。 加入穩(wěn)定肽的該融合蛋白較之TP508延長(zhǎng)了半衰期，提高了穩(wěn)定性。作為運(yùn)用于人體的藥物，克服了 TP508易被酸解的弱點(diǎn)，具有提高藥效、降低病人服藥量、延長(zhǎng)有效期、減少成本等顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。TP508分子量非常小，半衰期很短。本專利通過(guò)將一段具有穩(wěn)定功能的短肽序列加到TP508的N端，顯著的提高了半衰期，穩(wěn)定性也大幅的提高。本專利對(duì)TP508進(jìn)行改造主要有以下理由(一)TP508分子量比較小，半衰期短可以較好地解決此處肽鍵酸解斷裂的問(wèn)題。(二)通過(guò)對(duì)融合肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬及根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道，發(fā)現(xiàn)加上了穩(wěn)定肽不會(huì)影響TP508其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，即保證改造后TP508生物活性的穩(wěn)定。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種凝血酶片段融合肽，其為SEQ ID N0:1所示的 S-TP508。作為本發(fā)明中的融合蛋白，是一類自然界沒(méi)有的人工蛋白，其特征為穩(wěn)定肽和 TP508組成的融合蛋白，可以使用一種具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用對(duì)序列表 SEQ IDNOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修飾，如插入，缺失，突變某個(gè)或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。換句話說(shuō)，也可以使用采用其氨基酸序列大體上與序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的變體或其功能性片段。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述S-TP508可以通過(guò)基因重組表達(dá)的方法或者化學(xué)合成的方法制備。在本發(fā)明中，所述S-TP508是通過(guò)基因工程重組表達(dá)的方法獲得的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)如下方法獲得S-TP508，包括如下步驟1)表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)已知S-TP508氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成目的基因序列，同時(shí)在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位點(diǎn)，得到S-TP508的核酸序列。再分別將如上述制備的目的基因序列以及篩選質(zhì)粒pBSK 用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng)計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選成功的重組子。用限制性酶切下目的基因，再將該基因與用限制性酶處理好的本研究所質(zhì)粒 PGM (該質(zhì)粒為卡那霉素抗性篩選標(biāo)記，能大量表達(dá)GST類融合蛋白，為本研究所構(gòu)建)連接，經(jīng)篩選得到正確地重組子。2)目的蛋白的表達(dá)及分離純化將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵，得到目的蛋白高表達(dá)的工程菌。高壓均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)菌并離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，洗脫目的前體蛋白并用蛋白酶酶切后，再將樣品通過(guò)陰離子柱進(jìn)一步純化，使得最終蛋白純度大于98%的終產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的S-TP508，以及任選的藥物上可接受的載體。在本發(fā)明知，術(shù)語(yǔ)“藥物上可接受的”意味著制藥領(lǐng)域公認(rèn)的可用于動(dòng)物，更特別的是可用于人的。術(shù)語(yǔ)“載體”指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、或用于容納或施用治療劑的介質(zhì)。這些藥用載體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動(dòng)物、植物、或合成的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內(nèi)施用藥用組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此類。如果需要， 組合物還可以包含較少數(shù)量的潤(rùn)濕或乳化劑如透明質(zhì)酸鈉，或是PH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊粉劑、緩釋配方、諸如此類的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為凍干注射劑形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的S-TP508，以及5%的甘露醇，以及藥物上可接受的載體。將本發(fā)明的藥用組合物配制成與其意向施用路徑相容。施用路徑的實(shí)例包括但不限于腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔、鼻內(nèi)(例如吸入)、經(jīng)皮(例如局部)、經(jīng)粘膜、 和直腸施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，依照常規(guī)流程將組合物配制成適合靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、或局部施用于人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑諸如麥角胺以減輕注射部位的疼痛。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物為滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的 S-TP508,以及選自氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及藥物上可接受的載體；在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述組合物為滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，適量的透明質(zhì)酸鈉，以及藥物上可接受的載體；在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述組合物為滴眼液，其中含有50-500 μ g/ml的S-TP508，適量的透明質(zhì)酸鈉，氯霉素或氧氟沙星，以及藥物上可接受的載體。若要局部施用本發(fā)明的組合物，則可以將組合物配制成軟膏、乳膏、皮膚貼、洗劑、凝膠、洗發(fā)劑、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液的形式或是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它形式。參閱例如《雷明頓氏藥物科學(xué)和藥物劑型導(dǎo)論》(Remington' s Pharmaceutical Sciences andlntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms),第 19版,Mack出版公司， 伊斯頓，賓夕法尼亞，1995年。對(duì)于非可噴霧局部劑量形式，通常采用包含與局部應(yīng)用相容的載體或一種或多種賦形劑且具有優(yōu)選大于水的動(dòng)態(tài)粘滯度的粘性至半固體或固體形式。合適的配方包括但不限于溶液、懸浮液、乳狀液、乳膏、軟膏、粉劑、搽劑、藥膏、諸如此類，如果需要，是無(wú)菌的或與輔助試劑(例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑緩沖劑、或鹽)混和以改變各種特性，諸如例如滲透壓。其它合適的局部劑量形式包括可噴霧氣霧劑制劑，其中優(yōu)選聯(lián)合固相或液相惰性載體的活性成分包裝在含有增壓揮發(fā)物(例如壓縮氣體，諸如氟利昂)的混合物或是擠瓶中。 如果需要，還可以向藥物組合物和劑量形式中添加增濕劑或濕潤(rùn)劑。這些額外成分的實(shí)例在本領(lǐng)域是眾所周知的。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述藥物組合物為軟膏形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的S-TP508，和藥物上可接受的賦形劑如凡士林。若本發(fā)明的方法包括組合物的鼻內(nèi)施用，則組合物可以配制成氣霧劑、噴霧劑、輕霧劑、或滴劑的形式。具體而言，依照本發(fā)明使用的預(yù)防性或治療性試劑可以使用合適的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯單氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合適其它)以氣霧劑噴霧呈現(xiàn)的形式由增壓包裝或噴霧器進(jìn)行方便的投遞。在增壓氣霧劑的情況中，可以通過(guò)提供閥門來(lái)確定劑量單位，以投遞計(jì)量數(shù)量。吸入器或吹入器中所使用的膠囊和藥筒(由例如明膠構(gòu)成)可以配制成含有化合物及合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述藥物組合物為噴劑，其中含有5-500yg/ml的 S-TP508,以及0. 003%的尼泊金乙酯，和藥物上可接受的載體。若本發(fā)明的方法包括口服施用，則組合物可以配制成片劑、膠囊、藥包、軟膠囊、溶液、懸浮液、諸如此類的形式?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)手段用藥用可接受賦形劑諸如粘合劑(例如預(yù)膠凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖、微晶纖維素、或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、或硅石)；分解質(zhì)(例如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如月桂醇硫酸鈉)片劑或膠囊。可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法包被片劑。用于口腔施用的液體制劑可以采取但不限于溶液、糖漿、或懸浮液的形式，或者它們可以以干燥產(chǎn)品的形式存在，使用前用水或其它合適介質(zhì)溶解?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)手段用藥用可接受添加劑，諸如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物、或氫化食用脂肪)；乳化劑 (例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性介質(zhì)(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或分餾植物油)；以及防腐劑(例如甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)制備這些液體制劑。制劑還可以適當(dāng)包含緩沖鹽、芳香劑、著色劑、和甜味劑。可以適當(dāng)配制用于口腔施用的制劑以緩慢釋放、受控釋放、或持續(xù)釋放預(yù)防性或治療性試劑。本發(fā)明的方法還包括配制用于通過(guò)注射(例如通過(guò)推注或連續(xù)輸液)腸胃外施用的組合物的施用。用于注射的配方可以以含有額外防腐劑的單位劑量形式(例如在安瓿中或在多劑量容器中)存在。組合物可以采取諸如油性或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或乳狀液等形式，而且可以含有配制劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合適介質(zhì)(例如無(wú)菌、無(wú)熱原水)溶解?？捎糜谔峁┍景l(fā)明腸胃外劑量形式的合適介質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。在某些實(shí)施方案中，適于腸胃外劑量形式的介質(zhì)包括但不限于注射用水USP ；水性介質(zhì)包括但不限于氯化鈉注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介質(zhì)包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇； 以及非水性介質(zhì)包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、和苯甲酸苯甲酯。實(shí)例一重組融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建和工程菌的獲得以設(shè)計(jì)好的SEQ ID NOl氨基酸序列為模板，根據(jù)中心法測(cè)，選擇大腸桿菌偏好的密碼子，得到融合蛋白的所對(duì)應(yīng)的核酸序列，再使用全基因合成技術(shù)得到上述目的基因片段。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的重組技術(shù)獲得重組基因載體PBSK-S-TP508，對(duì)插入載體的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定。驗(yàn)證其基因序列的正確性后，擴(kuò)增保存，從該載體上切取下目的基因片段，插入表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒命名為P S-TP508。然后用CaC12法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有抗生素的篩選平板培養(yǎng)基表面，挑選陽(yáng)性菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG 1. OmM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后10% SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條明顯的蛋白表達(dá)帶，表達(dá)量為40%。經(jīng)天然型PE的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)，再把重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌中，經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)，疏水層析和離子交換層析得到目的蛋白S-TP508，所獲得的高效表達(dá)融合蛋白的工程菌命名為 PS-TP508/BL21。實(shí)例二目的蛋白的表達(dá)1)搖瓶表達(dá)將如上述制備的基因工程菌ρ S-TP508/BL21，在LB培養(yǎng)基中搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)(37°C，200rpm)，再按體積比1 30接種至LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3小時(shí)后，加入 0. ImMIPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白(43KD)以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體總蛋白的40%。2)大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)a.培養(yǎng)基組成a)種子液培養(yǎng)基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升。b)上罐培養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉250克、磷酸二氫鉀110克、氯化鈉13.克、氯化銨30克、胰蛋白胨120克、硫酸鎂30克、葡萄糖450克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖。發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)i)種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、200 轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LB中，36°C、200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)過(guò)夜。ii)發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程
將培養(yǎng)好的種子液加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，37°C、150轉(zhuǎn)、溶氧100%，開始發(fā)酵；65 小時(shí)后開始以2. 5速流加2小時(shí)，約加入1000毫升補(bǔ)料，加入1克IPTG誘導(dǎo)(三小時(shí))。實(shí)例三目的蛋白純化重組蛋白表達(dá)由S-TP508/JM109工程菌來(lái)完成。發(fā)酵后發(fā)酵液離心收集菌體， 壓力勻漿破菌，收集上清上Glutathione kpharose層析柱，平衡后用含還原型谷胱甘肽 (GSH)的洗脫液洗下融合蛋白，加入凝血酶(5NIHU/mL)37°C酶切2小時(shí)，然后通過(guò)陽(yáng)離子交換層析(SP Sepharose Fast Flow)除去GST蛋白，獲得純度大于95%的重組S-TP508。實(shí)例四目的蛋白生物活性檢測(cè)材料與方法清潔級(jí)(二級(jí))成年雄性SD大鼠60只，體重250_300g，以異氟烷作為吸入劑并同時(shí)腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉后，備皮(在大鼠背部kmX7cm范圍內(nèi)用電動(dòng)剃毛器剃毛，并常規(guī)脫毛)，在背部胸段用眼科剪刀剪圓形傷口 2個(gè)，直徑2cm。與脊柱平行，對(duì)稱于兩側(cè)，深達(dá)皮下組織全層。分兩組進(jìn)行治療，融合蛋白治療組每只大鼠的左側(cè)傷口應(yīng)用0. 1 μ g融合蛋白；等滲鹽水對(duì)照組每只大鼠的右側(cè)傷口應(yīng)用40 μ 1等滲鹽水作為對(duì)照。手術(shù)完畢后大鼠單籠喂養(yǎng)，于術(shù)后觀察記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)術(shù)后3、7、10天，經(jīng)融合蛋白治療組(L組)處理的創(chuàng)面面積與等滲鹽水對(duì)照組(R組)進(jìn)行比較，創(chuàng)面面積明顯縮小，并隨時(shí)間的推移，創(chuàng)面愈合程度加速。表明融合蛋白促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果顯著。表一、融合蛋白治療組與等滲鹽水對(duì)照組術(shù)后創(chuàng)面面積比率
權(quán)利要求
1.一種含凝血酶片段的融合肽(S-TP508)，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1 :GPRKKRRQRR RAGYKPDEGK RGDACE⑶SG GPFV
2.一種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1所述的凝血酶片段融合肽。
3.—種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1所述的凝血酶片段融合肽，以及任選的藥物上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1中的融合肽，應(yīng)用基因工程的方法進(jìn)行表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的凝血酶片段融合肽S-TP508，在TP508的N端加上了一段穩(wěn)定肽(這段穩(wěn)定肽主要由谷氨酰胺和精氨酸組成)。加入穩(wěn)定肽的融合蛋白較之TP508延長(zhǎng)了半衰期，克服了TP508易被酶解的弱點(diǎn)，提高了穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及含有所述S-TP508的藥物組合物，其可用于制備治療皮膚組織損傷與角膜損傷的藥物的用途。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102250253SQ20101017337
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者李詠梅, 李樹民, 莘旭妮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所