專利名稱：阿魏總萜酯及其醫(yī)藥用途和制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從全裂葉阿魏(Ferula dissecta(Ledeb. ) Ledeb.)中分離的具有醫(yī)藥用途的萜酯類化合物及全裂葉阿魏總萜酯提取物，特別是涉及從全裂葉阿魏中 分離的阿魏總萜酯及其制備工藝、醫(yī)藥用途和分析方法。
背景技術：
阿魏屬隸屬于傘形科，全世界約有150余種，我國約有26種1變種分布在我國東 北、山西、西藏、云南、江蘇和新疆等地，其中，產(chǎn)于新疆的有20種，主要分布在伊寧、阜康、 托里、塔城、烏恰等地。《中華人民共和國藥典》(2005年版)收載新疆阿魏和阜康阿魏兩種 作為藥用阿魏的原植物，以代替進口阿魏。在我國，阿魏是維、蒙、藏等少數(shù)民族傳統(tǒng)的民族 藥及中藥阿魏的唯一來源，有其它多種阿魏屬植物在民間習用，如維吾爾醫(yī)中，主要以新 疆阿魏、阜康阿魏、全裂葉阿魏、大果阿魏和圓錐莖阿魏作為藥用。該屬有多種藥用植物， 唐代《新修本草》最早記載用其樹脂作為藥物。阿魏在諸家本草所述，其功用主要是截瘧止 痢、解毒、除臭、殺蟲、消積、祛痰、疏風、活血和神經(jīng)功能，現(xiàn)代研究表明其具有抗生育、抗凝 血、免疫抑制、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等廣泛的藥理活性，在臨床上阿魏常用于治療胃腸道疾病， 腦血栓、慢性腎小球類疾病，急慢性痢疾、腸炎；預防麻疹等病癥。阿魏屬植物化學成分多種 多樣，以倍半萜香豆素(sesquiterpenecoumarin)、多硫化合物(polysulfanes)及倍半萜 化合物(sesquiterpenes)為其化學特征，倍半萜化合物多以酯、內(nèi)酯的形式存在，其中有 不少活性成分。阿魏具有抗凝血的活性，試驗證明阿魏中含有的阿魏酸具有抑制血小板凝 集和3H-SHT從血小板中釋放的作用。魏酸鈉對動物實驗性心肌缺血一再灌注損傷有保護 作用，作用機理與抗氧化作用有關。阿魏水浸出液靜脈注射于犬及大鼠，或于體外均具有抗 凝血作用。伊朗學者用通過體外豚鼠回腸自發(fā)性收縮實驗和測定給藥后麻醉大鼠平均動脈 壓，得出阿魏膠提取物具有抗痙攣和降血壓的作用。本課題基于以上調(diào)查研究，本發(fā)明首先實地考察了全裂葉阿魏Ferula dissecta (Ledeb.) Ledeb.的生長狀況，收集藥材，采集標本，進行藥物的鑒定和生藥學的研 究；通過硅膠柱色譜、薄層色譜、大孔吸附樹脂柱色譜、反相硅膠柱色譜、HPLC等分離方法， 從全裂葉阿魏干燥根的95%醇提物中分離單體18個；對阿魏屬中的一種民間習用的民族 中藥全裂葉阿魏，進行系統(tǒng)地化學成分研究及其抗凝血活性的研究，發(fā)現(xiàn)了全裂葉阿魏的 主要活性成分，尋找出了新結構類型的化合物，該萜酯類成分可以有望成為抗凝血、保護胃 粘膜等創(chuàng)新藥物研究的先導化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供從全裂葉阿魏中提取分離得到的結構如表1所示的化合物。表1全裂葉阿魏化學成分的結構和鑒定方法 提供含有表1所示任一化合物的藥物組合物，提供一種全裂葉阿魏總萜酯類提取物，其特征為含有對羥基苯甲酸單萜或倍單 萜酯和3-甲氧基-4-羥基苯甲酸單萜或倍單萜酯類化合物，并含有表1所示任一化合物。本發(fā)明還包括本發(fā)明表1所示任一化合物和全裂葉阿魏總萜酯類提取物的制備 方法，其特征在于，步驟如下它可以采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合進行 制備⑴溶劑萃取法；⑵大孔吸附樹脂法；⑶液-液逆流分配色譜法；⑷柱色譜法。其 中優(yōu)選方法為大孔吸附樹脂法和/或反相C18柱色譜法、溶劑萃取法和/或葡聚糖凝膠柱 色譜法。在使用這些方法進行制備時，包括以下幾個步驟(1)提取所用溶劑可以是水或任意一種醇類、酮類及酯類溶劑，或由這些溶劑按 一定比例配成的混合溶劑，或由這些溶劑與酸、堿配成的酸性或堿性溶劑，其中優(yōu)選結果為 50 95%乙醇。提取方法可以是加熱回流、浸漬滲漉、超聲提取、微波提取或高壓提取等；(2)過濾包括離心、抽濾、壓濾、超濾幾個步驟，使用以下任一種澄清劑或其組合 物醇沉劑、明膠、活性炭、硅藻土、高嶺土、各種樹脂、聚乙二醇、聚乙三醇、殼聚糖以及天然 澄清劑成品；(3)濃縮包括常壓或減壓條件下的薄膜蒸發(fā)、旋轉蒸發(fā)及煎煮濃縮等；(4)干燥包括真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等方法。當采用溶劑萃取法時，是先將提取物混懸于水中，接著用石油醚、正己烷、環(huán)己烷、 乙酸乙酯、氯仿，或這些溶劑的組合物，萃取獲得中藥活性成分組合物全裂葉阿魏總萜酯， 其中優(yōu)選的是乙酸乙酯。其中包括應用石油醚、正己烷、環(huán)己烷、汽油等低極性溶劑和/或 以上低極性溶劑與氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、甲醇等的不同比例混合物先萃取除去 部分低極性雜質(zhì)。當采用大孔吸附樹脂法時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也 可以是經(jīng)過乙醇沉淀或上述溶劑萃取法初步純化后的產(chǎn)物，所用大孔吸附樹脂可以是非極 性、弱極性、中等極性，弱酸性和弱堿性任何一種類型，所用樹脂型號由于生產(chǎn)廠家不同而 不同，其中優(yōu)選的是非極性苯乙烯型大孔吸附樹脂，所用的洗脫劑是水及含水的乙醇、甲 醇、丙酮，其中優(yōu)選的是0 100%的乙醇。
當采用液_液逆流分配色譜法時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也可以是經(jīng)過上述溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法初步純化后的產(chǎn)物，是先將提取物混懸 于水中，接著用石油醚、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇、異丙醇、氯仿，或這些溶劑的組 合物，萃取獲得中藥活性成分組合物全裂葉阿魏總萜酯，其中優(yōu)選的是乙酸乙酯，當采用柱色譜法時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的產(chǎn)物，也可以是 經(jīng)過上述溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、液_液逆流分配色譜法初步純化后的產(chǎn)物，所用固 定相可以是硅膠、氧化鋁、聚酰胺、葡聚糖凝膠G-10、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH-20、 C8、0DS、活性炭、纖維素，及非極性、弱極性、中等極性，弱酸性和弱堿性大孔吸附樹脂等；所 用的洗脫溶媒因固定相不同而不同，一般是水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，或這些溶劑按一定 比例配成的混合溶劑。其中固定相優(yōu)選的是非極性大孔吸附樹脂、硅膠、ODS和葡聚糖凝膠 LH-20。優(yōu)選的本發(fā)明的化合物的制備方法如下全裂葉阿魏根部95%乙醇提取，回收溶劑，得浸膏。將浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油 醚-乙酸乙酯梯度洗脫。各流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用硅膠柱色 譜，葡聚糖凝膠色譜，大孔樹脂進行再次的分離純化等步驟，分別可得到化合物1-10。其中 化合物1-7為新化合物。優(yōu)選的本發(fā)明的全裂葉阿魏總萜酯的提取制備全裂葉阿魏用95%乙醇提取，減壓回收乙醇，得糖漿狀浸膏。用適量水混懸、溶解， 經(jīng)大孔樹脂PDlOl柱色譜依次以水、20%乙醇、95%乙醇洗脫，分別得到水洗脫部分、20% 乙醇洗脫部分、95%乙醇洗脫部分。其中，95%乙醇洗脫部分富含阿魏萜酯類成分，總萜酯 含量達到85%以上。20%乙醇洗脫部分也含有阿魏萜酯類成分，其含量稍低，但其組成和比 例與95%乙醇洗脫部分不同，因此，以上提取物方法均可用于全裂葉阿魏總萜酯的制備。本發(fā)明最優(yōu)選的制備方法為全裂葉阿魏用95%乙醇提取，減壓回收乙醇，得糖漿 狀浸膏。用適量水混懸、溶解，經(jīng)大孔樹脂PDlOl柱色譜依次以水、20%乙醇、95%乙醇洗 脫，分別得到水洗脫部分、20%乙醇洗脫部分、95%乙醇洗脫部分。其中，95%乙醇洗脫部分 為本發(fā)明的最優(yōu)選提取物。另外，本發(fā)明還提供利用含有本發(fā)明化合物的全裂葉阿魏粗提取物、有機醇、酸酰 化反應，制備本發(fā)明全裂葉阿魏萜酯類化合物和提取物的方法，其中?；磻盟徇x自 有機酸如硫酸、鹽酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、對羥基苯甲酸單萜、3-甲氧基-4-羥基苯甲 酸、苯乙酸、對羥基苯乙酸等，醇選自龍腦、異龍腦、相應的倍半萜。本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物和全裂葉阿魏總萜酯類提取物在制備抗凝血、保護 胃粘膜、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機體免疫力、改善心腦血管供血不足、 抑制腫瘤細胞生長、去膩醒酒、護膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三 月旨、改善血液粘稠度和微循環(huán)、擴張血管、清除自由基、增強人體免疫力、抗腫瘤、抗癌等食 品、功能食品和藥物中的應用。本發(fā)明還包括全裂葉阿魏總萜酯類提取物的檢測方法如HPLC分析，以質(zhì)譜 (MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢測、蒸發(fā)光散射檢測器等為檢測器。對照品溶液的配置取阿魏萜酯1-阿魏萜酯7等阿魏萜酯類化合物的化學對照 品，精密稱取適量，用甲醇配制成適量的對照品溶液。
樣品溶液的配置精密稱取全裂葉阿魏、全裂葉阿魏提取物或者全裂葉阿魏總萜 酯樣品各適量，用IOOml氯仿(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及 其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán) 己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS的SPE小色譜柱預處理，95%乙 腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)洗 滌，合并洗脫液，甲醇定容，過濾，即得。
測試方法進行HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢 測、蒸發(fā)光散射檢測器等為檢測器。以樣品中各化合物的色譜峰面積，與標準對照樣品相應 色譜峰面積，按照標準曲線法(或外標1點法、外標2點法等)，進行定量分析，計算，即得。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的化合物和全裂葉阿魏總萜酯類提取物的藥物組合物。所述組合物可以是本發(fā)明全裂葉阿魏提取物、全裂葉阿魏總萜酯、阿魏萜酯1-阿 魏萜酯7和藥物可接受的載體混合制備成的藥物制劑。這些制劑包括通用的藥物劑型如片劑，膠囊，顆粒，口服液，注射劑等。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每 次1-20劑，如1-20袋或?；蚱?，每劑lmg-1000mg。以下為本發(fā)明化合物的功效測定實驗試驗表明，本發(fā)明化合物和全裂葉阿魏總萜酯類提取物具有抗凝血活性和提高機 體免疫力等活性，提示其可用于抗凝血、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機體免 疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細胞生長、去膩醒酒、護膚美容以及活血脈、抗衰 老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和微循環(huán)、擴張血管、清除自由基、增強 人體免疫力、抗腫瘤、抗癌等藥物、功能食品和食品的應用。以下實驗用于說明本發(fā)明提取物比現(xiàn)有類似物更加優(yōu)越。毒性試驗藥品本發(fā)明實施例2方法制備的提取物(95%乙醇洗脫部位)，表1化合物本發(fā)明的小鼠口服一次給與最大給藥濃度10g/Kg體重，均未見毒副反應，血液生 化指標均正常，研究結果本發(fā)明本發(fā)明實施例2方法制備的提取物(95%乙醇洗脫部位)和表 1化合物的小鼠口服一次給與最大給藥濃度I0g/Kg體重，解剖尸體見肝臟紅腫，肝功能異
巾O因此說明本發(fā)明藥物毒性小于對照組。藥效試驗藥品本發(fā)明實施例2方法制備的提取物(95%乙醇洗脫部位)，表1化合物抗疲勞試驗對照品人參總皂苷延長小鼠負重(體重5% )游泳時間試驗結果表明本發(fā)明實施例2方法制備的 提取物(95 %乙醇洗脫部位)，表1化合物在10mg/Kg體重即可與人參總皂苷的抗疲勞活性 相當，說明其活性非常強。
與模型組比較*ρ < 0. 05，**p < 0.01耐缺氧試驗對照品人參總皂苷小鼠常壓密閉耐缺氧時間結果表明本發(fā)明實施例2方法制備的提取物(95%乙 醇洗脫部位)，表1化合物在10mg/Kg體重即可與人參總皂苷的耐缺氧活性相當，說明其活性非常強。 抗腫瘤試驗對照品環(huán)磷酰胺對Hela荷瘤小鼠瘤體生長的影響結果表明本發(fā)明實施例2方法制備的提取物 (95%乙醇洗脫部位)，表1化合物在10mg/Kg體重即可與環(huán)磷酰胺的抗腫瘤活性相當，說明
其活性非常強。
血液學試驗全裂葉阿魏總萜酯大鼠體內(nèi)抗凝血的測定1)準備樣品
全裂葉阿魏95 %醇提取物(EEF)混懸于0. 5 % CMC得到所需濃度。2) TT 的測定[8]選用Wistar大鼠56只，約220 260g，雌雄各半，隨機平均分為空白對照組，陰性對照組(lml ^0. 5% CMC)，陽性(西)藥物對照組法華林(0. 144mg/kg_l)，陽性(中)藥物 對照組銀杏葉(0. 125mg/kg-l)，待測藥物組高(108mg生藥/kg_l)、中(54mg生藥/kg_l)、 低(27mg生藥/kg-Ι)劑量組。按以上給藥劑量，同體積連續(xù)灌胃一星期，每天一次，末次給 藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 1)， 3000r/min，離心lOmin，分離血漿備用。吸取上清血漿0. Iml, 37水浴約3min后，迅速加入 TT試劑0，lml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果表明，華法林、銀杏葉和全裂葉阿 魏高、中、低劑量和各化合物組均顯著延長大鼠凝血酶時間(TT)。見表2。3) APTT 的測定[8]動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉 的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9:1)，3000r/min,離心IOmin,吸取上清血漿0. Iml 和37度預溫ATPPO. Iml (預溫不超過十五分鐘)，混勻，37溫浴約5min后，加入預溫好的鈣 離子試劑0. 1ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果表明，華法林、銀杏葉和多傘阿魏 高、中、低劑量和各化合物組均顯著延長大鼠活化部分凝血活酶時間(APTT)見表2。4) PT 的測定[8]動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉 的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 l)，3000r/min，離心lOmin，吸取上清血漿0. lml， 37水浴約3min后，迅速加入37度預溫好的PT試劑0. 2ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。 實驗結果表明，華法林、銀杏葉和多傘阿魏高、中、低劑量和各化合物組均顯著延長大鼠凝 血酶原時間(PT)。見表2。5) RT 的測定動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉 的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 l)，3000r/min，離心lOmin，吸取上清血漿0. lml， 37水浴約3min后，迅速加入鈣離子試劑0. 1ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果 表明，華法林和全裂葉阿魏中劑量和各化合物組能顯著延長大鼠血漿復鈣凝血時間(RT)。 見表2。表2阿魏對大鼠各項凝血指標的影響 和對照組比價:**Ρ< 0. 01，*Ρ < 0. 05


圖1提取流程2分離流程3大鼠抗凝血各個指標的測定結果圖4化合物1，2，8和9抗凝血活性測試
具體實施例方式1、從全裂葉阿魏中提取分離制備以上萜酯類化合物和全裂葉阿魏總萜酯的方法。 其關鍵技術為乙醇或含水有機溶劑提取，提取物應用硅膠、氧化鋁、大孔樹脂、離子交換樹 月旨、聚酰胺、葡聚糖凝膠、反相硅膠等色譜手段精制分離，先用水或低濃度有機溶劑洗脫除 去雜質(zhì)，再用高濃度有機溶劑洗脫得到產(chǎn)物，采用反復以上色譜分離精制純化，或重結晶純 化。其中，提取用有機溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮等。大孔樹脂、離子交換樹脂包括各種苯乙 烯型、丙烯酸型等高分子樹脂。2、利用含全裂葉阿魏萜酯類化合物的全裂葉阿魏提取物，發(fā)明了?；磻苽淙?裂葉阿魏萜酯類化合物的方法。所用酸包括各種濃度的礦酸和有機酸，礦酸如硫酸、鹽酸 等，有機酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸、對羥基苯甲酸單萜、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、苯乙酸、 對羥基苯乙酸等。
3、發(fā)現(xiàn)全裂葉阿魏萜酯的抗凝血、抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機 體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細胞生長、去膩醒酒、護膚美容以及活血脈、抗 衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和微循環(huán)、擴張血管、清除自由基、增強人體免疫力、抗腫瘤、抗癌等醫(yī)藥用途。4、建立了分析方法HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD) 檢測、蒸發(fā)光散射檢測器等為檢測器。對照品溶液的配置對照品溶液的配置取阿魏萜酯1-阿魏萜酯7等阿魏萜酯類 化合物的化學對照品，精密稱取適量，用甲醇配制成適量的對照品溶液。樣品溶液的配置精密稱取全裂葉阿魏、全裂葉阿魏提取物或者全裂葉阿魏總萜 酯樣品各適量，用IOOml氯仿(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及 其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán) 己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS的SPE小色譜柱預處理，95%乙 腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)洗 滌，合并洗脫液，甲醇定容，過濾，即得。測試方法進行HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢 測、蒸發(fā)光散射檢測器等為檢測器。以樣品中各化合物的色譜峰面積，與標準對照樣品相應 色譜峰面積，按照標準曲線法(或外標1點法、外標2點法等)，進行定量分析，計算，即得。實施例1 全裂葉阿魏萜酯類化合物的提取制備全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。各流 份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用硅膠柱色譜，葡聚糖凝膠色譜，大孔樹脂 進行再次的分離純化。分離方式見圖1和圖2實施例2 全裂葉阿魏總萜酯的提取制備全裂葉阿魏5kg，用95%乙醇50L回流提取3次。減壓回收乙醇，得糖漿狀浸膏。 用適量水混懸、溶解，經(jīng)大孔樹脂PDlOl柱色譜依次以水、20%乙醇、95%乙醇洗脫，分別得 到水洗脫部分、20%乙醇洗脫部分、95%乙醇洗脫部分。其中，95%乙醇洗脫部分富含阿魏 萜酯類成分，總萜酯含量達到85%以上。20%乙醇洗脫部分也含有阿魏萜酯類成分，其含量 稍低，但其組成和比例與95%乙醇洗脫部分不同，因此，以上提取物方法均可用于全裂葉阿 魏總萜酯的制備。制最佳備方法為95%乙醇洗脫方法。 實施例3 全裂葉阿魏總萜酯的HPLC-T0F-MS分析對照品溶液的配置阿魏萜酯1-阿魏萜酯7對照品精密稱取適量，用甲醇配制成 適量的對照品溶液。樣品溶液的配置精密稱取全裂葉阿魏總萜酯樣品各適量，用IOOml氯仿(或甲 醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收 提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及其不同濃度的 水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS的SPE小色譜柱預處理，95%乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯 仿、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑及其不同濃度的水溶液)洗滌，合并洗脫液，甲醇定容，過 濾，即得。測試方法進行HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測、紫外(UV)檢測、圓二色譜(CD)檢測、蒸發(fā)光散射檢測器等為檢測器。以樣品中各化合物的色譜峰面積，與標準對照樣品相應 色譜峰面積，按照標準曲線法(或外標1點法、外標2點法等)，進行定量分析，計算，即得。利用阿魏萜酯1-阿魏萜酯7的精確分子量，進行HPLC-T0F-MS等分析，定性、定量 地確定全裂葉阿魏總萜酯中的化學成分及其含量。實施例4 全裂葉阿魏總萜酯大鼠體內(nèi)抗凝血的測定1)準備樣品全裂葉阿魏95 %醇提取物(EEF)混懸于0. 5 % CMC得到所需濃度。2) TT 的測定[8]選用Wistar大鼠56只，約220 260g，雌雄各半，隨機平均分為空白對照組，陰性 對照組(lml ^0. 5% CMC)，陽性(西)藥物對照組法華林(0. 144mg/kg_l)，陽性(中)藥物 對照組銀杏葉(0. 125mg/kg-l)，待測藥物組高(108mg生藥/kg_l)、中(54mg生藥/kg_l)、 低(27mg生藥/kg-Ι)劑量組。按以上給藥劑量，同體積連續(xù)灌胃一星期，每天一次，末次給 藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 1)， 3000r/min，離心lOmin，分離血漿備用。吸取上清血漿0. Iml, 37水浴約3min后，迅速加入 TT試劑0，lml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果表明，華法林、銀杏葉和全裂葉阿 魏高、中、低劑量均顯著延長大鼠凝血酶時間(TT)。見表2。3) APTT 的測定[8]動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9:1)，3000r/min,離心IOmin,吸取上清血漿0. Iml 和37度預溫ATPPO. Iml (預溫不超過十五分鐘)，混勻，37溫浴約5min后，加入預溫好的鈣 離子試劑0. 1ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果表明，華法林、銀杏葉和多傘阿魏 高、中、低劑量均顯著延長大鼠活化部分凝血活酶時間(APTT)見表2。4) PT 的測定[8]動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉 的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 l)，3000r/min，離心lOmin，吸取上清血漿0. lml， 37水浴約3min后，迅速加入37度預溫好的PT試劑0. 2ml,混勻，啟動秒表，記錄凝固時 間。實驗結果表明，華法林、銀杏葉和多傘阿魏高、中、低劑量均顯著延長大鼠凝血酶原時間 (PT)。見表 2。5) RT 的測定動物分組、灌胃給藥同2. 1. 1，末次給藥兩小時后眼眶取血于裝有3. 8%枸櫞酸鈉 的離心管中(血液與抗凝劑體積比為9 l)，3000r/min，離心lOmin，吸取上清血漿0. lml， 37水浴約3min后，迅速加入鈣離子試劑0. 1ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。實驗結果 表明，華法林和全裂葉阿魏中劑量能顯著延長大鼠血漿復鈣凝血時間(RT)。見表2。表2阿魏對大鼠各項凝血指標的影響 和對照組比價:**p< 0. 01，*P < 0. 05實施例5 阿魏萜酯類化合物體外抗凝血的測定吸取混合血漿80ul、樣品20ul和37度預溫ATPPO. Iml (預溫不超過十五分鐘)， 混勻，37溫浴約5min后，加入預溫好的鈣離子試劑0. 1ml，混勻，啟動秒表，記錄凝固時間。 實驗結果表明阿魏萜酯1(化合物1)、阿魏萜酯2 (化合物2)、Radiatinol (化合物8)、 SC0p0letin(化合物10)等四個樣品的APTT隨著濃度的逐漸加大而顯著延長。實施例6:?；磻謩e取IOOmg的龍腦和溶解于IOOml無水吡啶中，加入IOOmg對羥基苯甲酸， 100°c反應2h。CHC13萃取三次，CHCl3層用N2吹干，加甲醇，再用N2吹干，反復此過程直 至產(chǎn)物中不存在吡啶，即得。實施例7:化合物的鑒定阿魏萜酯1(1)白色油狀物；易溶于石油醚和乙酸乙酯，m.p. :84. 1-85. 2 (MeOH)，UV(MeOH) Xmax(Ioge) :226(3· 58)，276nm(2. 99) ；CD (MeOH) λ max ([ θ ] X 10_3) (deg ‘ cm2 ‘ dmoF1) 214(-12. 2) , 242 (-0. 15) , 278nm(-2. 9) ；IR(KBr)Vmax :3742，2934，2863，1703，1611， 1516，1457，1429，1370，1283，1219，1120，1037 , 768, 566cm_1 ；ESI-TOF-MS m/z 405. 2265 [M+H]+ (Calcd for C23H33O6,405. 2277, -3. Oppm) ；1H-和 13C-NMR.數(shù)據(jù)見表 3。阿魏萜酯2 (2)白色油狀物；易溶于石油醚和乙酸乙酯，UV(MeOH) Amax(Ioge) 226(3. 58), 276nm(2. 99) ；CD (MeOH) λ max ([ θ ] X 10_3) (deg · cm2 · dmoF1) :214(_12· 2)，242(_0· 15)， 278nm(-2. 9) ；IR(KBr)Vmax :3255，2934，2863，1675，1611，1516，1445，1366，1283，1160， 1124,1049,982,918,843, 772,697,621, 570cm_1 ；ESI-TOF-MS m/z 375. 2172 [M+H] + (Calcd for C22H31O5'375. 2171,0. 3ppm) ；1H-禾口 13C-NMR 數(shù)據(jù)見表 3。Table 3 化合物 1 禾Π 2 的 1H-NMR，13C-WR 數(shù)據(jù) 阿魏萜酯3 (3)
無色塊狀結晶，m.p. :176. 6-177. 4°C，不溶于水，溶于石油醚和乙酸乙酯。經(jīng)TLC 展開后，在紫外燈254nm下呈明顯暗斑，硫酸香草醛顯色為淡紫色斑點。UV(MeOH) 210nm 禾口 260nm ；IR(KBr) Vmax :3394，3180，2938，2855，2728，2685，2586，1679，1604，1508， 1449，1370，1283，1164，1041，966，851，772，750，673，562，SlOcnT1 ；ESI-TOF-MS m/z 358. 2142 [M+H]+ (Calcd fOrC22H30O4, 358. 2139,0. 8ppm) ；1H-和 13C-NMR 數(shù)據(jù)見表 4。表4化合物3的核磁數(shù)據(jù) 阿魏萜酯4 (4)黃色油狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯和甲醇，不易溶于乙腈，m. p. 79. 8-80. 9 (MeOH), 經(jīng)TLC展開后，在紫外燈254nm下呈明顯暗斑，365nm下有暗斑，硫酸香草醛顯色為淡紫色斑 點。UV (MeOH) Amax 218nm，263nm 和 294nm ； IR (KBr) Vmax 3437，3081，2950，2879，1877，1861， 1592，1516，1461，1421，1362，1283，1227，1188，1156，1112，1041，976，942，895，839，800， 760,724,609,570cm-1 ；ESI-TOF-MS m/z 304. 1775 [M+H] + (Calcd for C18H24O4, 304. 2171, 0. 8ppm) ；1H-和 13C-NMR 數(shù)據(jù)見表 5。阿魏萜酯5 (5)無色片狀結晶，m. p. :153. 2-154. 5Hz，易溶于氯仿、乙酸乙酯和甲醇，乙腈， UV(MeOH) Amax210nm 和 258nm ；IR(KBr) Vmax :3378，2954，1691，1592，1512，1461，1374，1310， 1279，1160，1128，1045，1013，970，891，847，811，764，689，621，582，554，503，459CHT1 ； ESI-TOF-MS m/z274. 1613 [M+H]+ (Calcd for C17H22O3, 274. 1615,0. 4ppm) ；1H-禾口 13C-NMR 數(shù) 據(jù)見表5。表5化合物4禾Π 5的1H-NMR, 13C-WR數(shù)據(jù)
s)阿魏萜酯6 (6)無色片狀結晶，m.p. :153. 2-154. 5Hz，易溶于氯仿、乙酸乙酯和甲醇，乙腈中溶解 度較小，UV(MeOH) λ max219nm、265nm 和 294nm ;ESI-T0F-MS m/z 304.1774，[M+H] + (Calcd fOr18H24O4, 304. 1776,0. 3ppm) ；1H-和 13C-NMR 數(shù)據(jù)見表 6。阿魏萜酯7 (7)黃色油狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯和甲醇，乙腈，m. p. :153. 8-154. 6 (MeoH)，經(jīng) TLC展開后，在紫外燈254nm下呈明顯暗斑，365nm下有暗斑，硫酸香草醛顯色為淡紫色 斑點。UV(MeOH)Xmax 206nm 和 260nm ;IR(KBr) Vmax :3366，2954，2875，1691，1611，1512， 1457，1366，1283，1227，1164，1097，1045，998，970，906，843，768，693，613，550，503CHT1 ； ESI-TOF-MS m/z 274. 1615[M+H] + (Calcd for C17H22O3, 274. 1618,0. 5ppm) ；1H-禾口 13C-NMR數(shù) 據(jù)見表6。表6化合物6禾Π 7的1H-NMR, 13C-WR數(shù)據(jù) 實施例8:化合物1的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 33)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 HPLC進行再次的分離純化，即得。實施例9:化合物2的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 33)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 HPLC進行再次的分離純化，重結晶，即得。實施例10 化合物3的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 6)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用硅 膠柱分離進行再次的分離純化，重結晶，即得。
實施例11 化合物4的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液，回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 0.5)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 硅膠柱分離進行再次的分離純化，重結晶，即得。實施例12 化合物5的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 1.5)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 硅膠柱分離，繼續(xù)采用HPLC進行再次的分離純化，重結晶，即得。實施例13 化合物6的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 1.5)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 硅膠柱分離，繼續(xù)采用HPLC進行再次的分離純化，重結晶，即得。實施例14:化合物7的詳細制備方法全裂葉阿魏根部切片1.45Kg，95%乙醇回流提取三次，每次3h，過濾，合并濾液， 回收溶劑，得浸膏240g。將200g浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。石油 醚-乙酸乙酯(100 1.5)洗脫部分流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用 HPLC進行再次的分離純化，重結晶，即得。
權利要求
從全裂葉阿魏中提取分離得到的結構如表1所示的化合物或其藥用鹽。表1
2.含有權利要求1表1中任一化合物的藥物組合物。
3.含有權利要求1表1中任一化合物的全裂葉阿魏總萜酯提取物，其特征在于，含有對 羥基苯甲酸單萜或倍單萜酯和3-甲氧基-4-羥基苯甲酸單萜或倍單萜酯類化合物。
4.權利要求1化合物或權利要求3提取物的制備方法，其特征在于，步驟如下提取， 分離，分離采用以下方法，(1)溶劑萃取法；(2)大孔吸附樹脂法；(3)液-液逆流分配色譜 法；⑷柱色譜法。
5.按權利要求4的制備方法，其特征在于，化合物的制備步驟如下全裂葉阿魏根部 95%乙醇提取，回收溶劑，得浸膏。將浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。各 流份經(jīng)硅膠薄層色譜檢查，合并相同流份。繼續(xù)采用硅膠柱色譜，葡聚糖凝膠色譜，大孔樹 脂進行再次的分離純化等步驟，分別可得到化合物1-7。
6.按權利要求4的制備方法，其特征在于，提取物的制備步驟如下全裂葉阿魏用95%乙醇提取，減壓回收乙醇，得糖漿狀浸膏。用適量水混懸、溶解，經(jīng)大 孔樹脂PDlOl柱色譜依次以水、20%乙醇、95%乙醇洗脫，分別得到水洗脫部分、20%乙醇 洗脫部分、95%乙醇洗脫部分，其中，95%乙醇洗脫部分為本發(fā)明的最優(yōu)選提取物。
7.權利要求1的化合物和權利要求3的阿魏總萜酯提取物的制備方法，其特征在于， 步驟如下利用含有權利要求1中全裂葉阿魏粗提取物、有機醇、酸等的?；磻苽浔景l(fā) 明全裂葉阿魏萜酯類化合物和提取物的方法，其中?；磻盟徇x自有機酸如硫酸、鹽 酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、對羥基苯甲酸單萜、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、苯乙酸、對羥基苯 乙酸等，醇選自龍腦、異龍腦、相應的倍半萜。
8.權利要求1的化合物和權利要求3的提取物在制備抗凝血、保護胃粘膜、抗疲勞、延 緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細胞生長、 去膩醒酒、護膚美容以及活血脈、抗衰老、降血脂、降膽固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度 和微循環(huán)、擴張血管、清除自由基、增強人體免疫力、抗腫瘤、抗癌藥物、功能食品和食品中 的應用。
9.含有權利要求1的化合物和權利要求3的阿魏總萜酯提取物的藥物組合物，其特征 在于，含有藥物可接受的載體，制備成任何可服用的藥物劑型如片劑，膠囊，顆粒，口服液， 注射劑。
10.權利要求9的藥物組合物，在使用時根據(jù)病人的情況，確定用法用量，可每日服三 次，每次1-20劑，如1-20袋或?；蚱?，每劑lmg-1000mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及阿魏總萜酯及其醫(yī)藥用途和制備方法，本發(fā)明從全裂葉阿魏中分離具有醫(yī)藥用途的萜酯類化合物及總萜酯提取物，含有對羥基苯甲酸單萜或倍單萜酯和3-甲氧基-4-羥基苯甲酸單萜或倍單萜酯類化合物，制備方法包括提取，分離，分離采用以下方法，(1)溶劑萃取法；(2)大孔吸附樹脂法；(3)液-液逆流分配色譜法；(4)柱色譜法。
文檔編號C07C69/92GK101838202SQ201010177539
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權日2010年5月20日
發(fā)明者盧立娜, 戴榮華, 李國玉, 李肖宇, 韓紅英, 魏秀巖 申請人:于非