專利名稱：微波促進固相合成苦瓜mc-jj0102多肽類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MC-JJ0102多肽類似物及其微波促進固相合成方法。
技術(shù)背景 糖尿病是當今危害人類健康的重要疾病，目前全世界約有5% -7%的人受糖尿病 困擾，被認為是繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后，導(dǎo)致人類傷殘、死亡的第三大殺手。糖尿病分為I型和II型，I型糖尿病是一種自身免疫疾病，患者的存活需要注射 胰島素。II型糖尿病占眾多糖尿病患者總數(shù)的95%左右。II型糖尿病的原因是胰島細胞 代謝發(fā)生障礙，胰島素分泌不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗，是以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌 相對不足，或者以胰島素分泌相對不足為主伴胰島素抵抗導(dǎo)致的代謝性疾病。胰島素分泌 不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗都可造成血液中葡萄糖過量，當血糖含量超過腎閾時，葡萄糖就 轉(zhuǎn)移到尿中排出，從而產(chǎn)生葡萄糖尿。苦瓜(Momordica charantia)是一種人類有長期安全食用歷史的蔬菜。近二十年 來，人們在苦瓜的果實中發(fā)現(xiàn)了許多具有降血糖活性的成分，其中的多肽成分逐漸得到人 們的認識并得到一些運用，但是由于苦瓜多肽的提取分離過于復(fù)雜，成本較高又難于得到 純的多肽，現(xiàn)在我們運用現(xiàn)代多肽合成技術(shù)能夠解決這一問題。多肽可以通過基因工程的方法或者化學合成的方法得到?；蚬こ痰姆椒ㄔ讷@取 長肽(氨基酸殘基長度大于50)或蛋白質(zhì)上比化學方法有優(yōu)勢，但是多肽的化學合成方法 尤其是在固相合成策略出現(xiàn)后，在制備氨基酸殘基長度小于40的多肽或小肽上有基因工 程方法難以比擬的靈活性、多樣性和高效性等。1963年Merrifield創(chuàng)立并開發(fā)了固相合成 多肽的方法。固相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護固相合成策略和Fmoc/ tBu正交保護固相合成策略，Merrifield創(chuàng)立的固相合成法即為Boc/Bzl正交保護固相合 成策略。但是，Boc/Bzl正交保護固相合成策略中存在一些缺點，如副反應(yīng)多、條件苛刻以及 在延長肽鏈的過程中多肽鏈會從固相上丟失等。而隨后出現(xiàn)的Fmoc/tBu正交保護固相合 成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當近年來微波技術(shù)運用于多肽的固相合成中后，使多肽的合 成技術(shù)產(chǎn)生了一個飛躍。微波促進化學反應(yīng)是由于其使極性分子在微波場中快速旋轉(zhuǎn)，使 得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到1000倍，而且產(chǎn)率大大提高。1986年Gedye等人 首次報道了將微波應(yīng)用于有機合成中，微波可以促進許多化學反應(yīng)，如Diels-Alder反應(yīng)， 皂化反應(yīng)等，可以顯著地加快反應(yīng)速率并提高收率。在1992年，Hui-ming Yu等首先報道 了將微波應(yīng)用于多肽固相合成領(lǐng)域中，他們完成了?；d體蛋白片斷十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。如何高效的合成長肽，在世界上仍然是一個挑戰(zhàn)，因為多肽隨著肽鏈的增加，其合 成難度成倍增加。用傳統(tǒng)的固相方法合成長肽，其收率往往很低雜質(zhì)較多純化困難，從而從 實用的角度上說失去了合成的意義。其次合成周期長，在中間不出現(xiàn)困難肽序的情況下10 肽一般需要近一個星期時間才能完成合成周期，如果出現(xiàn)困難肽序，往往就無法合成得到 目標多肽。而使用微波促進固相合成多肽，可以克服困難肽序，合成傳統(tǒng)固相方法無法得到的多肽，而且合成時間大大縮短，且顯著提高多肽粗品純度及收率，使得產(chǎn)品的純化大大方 便，只要經(jīng)過一次制備型HPLC就能得到純度較高的產(chǎn)品；此外還可以非常方便的用D型氨 基酸及非天然氨基酸等對多肽進行定點修飾，去尋找活性更高、生物半衰期更長的多肽，這 更是基因工程技術(shù)無法做到的。因此，我們在苦瓜降血糖(MC-JJ0102)多肽類似物的合成 中采用此種方法快速高效的合成得到MC-JJ0102系列類似物
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明有兩個目的第一個目的是從具降血糖活性的藥食同源植物苦瓜中得到多 肽進行修飾得到降血糖活性更高的MC-JJ0102多肽類似物。本發(fā)明的第二個目的是提供了 MC-JJ0102衍生物的固相制備方法，本發(fā)明采用微 波促進Fmoc/tBu正交保護固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ0102類似物。其特征在于采用微波促進Fmoc/tBu正交保護固相合成策略，于固相載體上先合 成得到載有第一個Fmoc保護氨基酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護基得到 載有第一個氨基酸殘基的樹脂；再進入下一個偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護氨 基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護的步驟，依次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹 月旨，最后用裂解劑將多肽從樹脂上切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級高效液相色譜純 化，凍干得多肽純品。載有第一個Fmoc保護氨基酸的樹脂的制備方法，其特征是通過在微波照射條件 下Fmoc保護氨基酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入1-羥基_苯并 三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有機堿中和反應(yīng)的酸性。載有第一個Fmoc保護 氨基酸的樹脂所使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂?；罨瘎?是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、N, N"-羰基二咪唑(⑶I)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或使用的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(H0SU)、1_羥 基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-1，2，3-苯并三嗪_4 (3H)-酮(HOOBT)。有機堿 為三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)；微波促進條件是微波頻率 2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時間為5 15min。Fmoc保護基的脫除是通過使用含有0. lmol. L—1的1_羥基-苯并三氮唑(HOBT)的 六氫吡啶溶液在微波促進下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基 吡咯烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑。微波促進條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C， 反應(yīng)時間為1 IOmin。本發(fā)明的優(yōu)點在于1.提出的一種MC-JJ0102類似物可以在保留降糖活性的基礎(chǔ)上，提高MC-JJ0102 的穩(wěn)定性，延長作用時間。2.微波促進固相合成MC-JJ0102類似物大大的提高了偶合反應(yīng)速率，常規(guī)固相合 成方法充分偶合一個氨基酸到樹脂上去，往往需要2小時到20小時不等，甚至更長。而微 波促進則平均只需要10分鐘左右；常規(guī)固相合成方法脫Fmoc保護基，往往需要30分鐘到 1小時不等，而微波促進則平均只需要5分鐘左右，這極大的提高了多肽合成的效率，縮短了合成周期。3.微波促進固相合成MC-JJ0102類似物合成得到的粗品的純度大于85%，較常規(guī) 固相合成方法大大提高，這方便了后續(xù)的純化工作，只需要經(jīng)過一次制備液相純化，凍干即 可得到目標純品。4.微波促進固相方法合成MC-JJ0102類似物，其成本低，由于偶合效率較高，所需 要保護氨基酸平均只需要2倍過量，較常規(guī)固相合成方法需要4到5倍過量大為降低。5.微波促進固相合成MC-JJ0102類似物方法易于實現(xiàn)自動化、大規(guī)?；?，這使其 更適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此用本發(fā)明提供的微波促進固相合成技術(shù)制備的MC-JJ0102多肽類似物，收率 高、合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動化生產(chǎn)。制備得到的MC-JJ0102 多肽類似物，適合作為治療糖尿病藥物的活性成分。
具體實施方式
在本說明書全文中采用以下縮寫Et3N 三乙胺；NMM =N-甲基嗎啉；DIEA :N，N，- 二異丙基乙胺；DMF 二甲基甲酰胺； DM SO 二甲亞砜；DCM 二氯甲烷；Fmoc :N_9芴甲氧羰基；DIC =N, N’ -二異丙基碳二亞胺； CDI :N，N，-羰基二咪唑；DMAP :4_ 二甲氨基吡啶；HOSU :N_羥基琥珀酰亞胺；EDC. HCl 1-乙 基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；HATU 2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N，，N，-四 甲基脲六氟磷酸酯；HBTU 苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU :6_氯苯 并三氮唑_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT 羥基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT 羥 基-苯并三氮唑；PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC 高效液相色 譜；ESI-MS 電噴霧質(zhì)譜；Gly 甘氨酸；Ser 絲氨酸；Ala 丙氨酸；Thr 蘇氨酸；Val 纈氨 酸；Ile 異亮氨酸；Leu 亮氨酸；Tyr 酪氨酸；Phe 苯丙氨酸；His 組氨酸；Pro 脯氨酸； Asp 天門冬氨酸；Met 蛋氨酸；Glu 谷氨酸；Trp 色氨酸；Lys 賴氨酸；Arg 精氨酸。Asn 天冬酰胺；Gln 谷氨酰胺。本發(fā)明是通過下列實施列來進行說明的，但這些實施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。實施例1Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Ser-Ala-Ser (SEQ. ID NO 2)的微波促進固相合 成(1)樹脂的溶脹稱取Fmoc-rink amide-MBHA Resin 50mg (取代量 0. 4mmol/g)，經(jīng) 7mL DCM 溶脹 30min，抽濾去DCM，再用IOmL NMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM, NMP 7mL沖洗干凈。(2)微波促進Fmoc保護基的脫除將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0. IM HOBT的25%哌啶/NMP (V/V)溶 液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在50°C以內(nèi)，使用空氣壓縮 機壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含0. IM HOBT的25%哌啶/NMP (V/V)溶 液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓 縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護基的樹脂。(3)微波促進 Fmoc-Ser-rink amide-MBHA Resin 的合成將Fmoc-Ser-OH (0. 04mmol)，HBTU (0. 04mmol)，HOBT (0. 04mmol)禾口 DIPEA(0. 08mmol)溶于IOmL NMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng) 7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后 濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。
(4)偶合效率的檢測用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進入下 一個偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、 KCN吡啶溶液(2ml 0. 00IMKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加 熱5分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。溴酚蘭法取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴的 溴酚藍二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。(5)肽鏈的延長按照Ala2-MC-JJO 102- (1 10) -NH2的序列，重復(fù)上述脫保護和偶合的步 驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進反應(yīng)時間5 20min不等。得到連有 Ala2-MC-JJ0102-(1 10)-NH2 的樹脂。(6)樹脂上多肽的裂解將上述得到的連有Ala2-MC-JJO 102-(1 10)_NH2的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂 解劑 Reagent K (TFA/苯甲硫醚 / 水 / 苯酚/EDT，82. 5 5 5 5 2. 5，V/V) 10mL，先在 0°C下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并 濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標多肽的粗品。最 終得至IJ Ala2-MC-JJO 102-(1 10)_NH2 粗品 63. 2mg，收率為 94. 3%0(7) Ala2-MC-JJ0102- (1 10) -NH2 粗品的純化將上面得到的Ala2-MC-JJO 102-(1 10)-NH2粗品，溶于少量的水中，用島津制備 型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340πιπιΧ28πιπι，5μπι)；流動相Α:0. 1% TFA/水(V/V)，流動相B 0. TFA/乙腈(V/V)；流動相梯度流動相B13% 15%,30min ； 流速為6mL/min ；檢測波長為214nm。收集的溶液凍干得純品，最終得到純品29. 7mg。理 論相對分子質(zhì)量 830. 9ESI-MSm/z found[M+3H]3+278. 0，[M+4H]4+208. 5，[M+5H]5+167. 2 ； calu [M+3H] 3+278. 0，[M+4H]4+208. 7，[M+5H] 5+167. 2根據(jù)實施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實施例2 41的多肽，通過 電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。實施例2Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Gly-Ser (SEQ. ID NO 3)理論相對分子質(zhì)量 858. 0ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+287. 0 , [M + 4H] 4+215. 5, [M + 5H] 5+172. 4 ； calu [M+3H] 3+287. 0，[Μ+4Η]4+215· 5，[Μ+5Η] 5+172. 6實施例3
Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Cys-Ser (SEQ. ID NO 4)理論相對分子質(zhì)量 904. OESI-MSm/z found [M + 3H] 3+302. 1 , [M + 4H] 4+2 2 7 · 1，[M + 5H] 5+181. 8 ； calu[M+3H]3+302. 3，[M+4H]4+227. 0，[M+5H] 5+181. 8實施例4 Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Arg-Ser (SEQ. ID NO 5)理論相對分子質(zhì)量 957. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+320. O , [Μ + 4Η] 4+240. 2, [Μ + 5Η] 5+192. 4 ； calu [Μ+3Η] 3+320. O [Μ+4Η] 4+240. 3.，[Μ+5Η] 5+192. 4實施例5Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-LYs-Ser (SEQ. ID NO 6)理論相對分子質(zhì)量 929. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+3 10. 7, [M + 4H] 4+2 3 3 · 5，[M + 5H] 5+1 86. 6 ； calu[M+3H]3+310. 7[M+4H]4+233. 3.，[M+5H] 5+186. 8實施例6Pro-Ala-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 7)理論相對分子質(zhì)量 1021. . 2ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+34 1. 5, [M + 4H] 4+2 5 6 · 3，[M + 5H] 5+2 O 5 · 4 ； calu [M+3H] 3+341. 4 [M+4H] 4+256. 2.，[M+5H] 5+205. 2實施例7Pro-Ala-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 8)理論相對分子質(zhì)量 1021. 2ESI-MSm/z :found [M + 3H] 3+341. 4，[M + 4H] 4+256. 3, [M + 5H] 5+205. 2 ； calu [M+3H] 3+341. 4，[M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2實施例8Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 9)理論相對分子質(zhì)量 1113. 2ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+372. 1 , [M + 4H] 4+279. 5, [M + 5H] 5+223. 6 ； calu [M+3H] 3+372. 1，[M+4H]4+279. 3，[M+5H] 5+223. 7實施例9Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser (SEQ. ID NO 10)理論相對分子質(zhì)量 1056.2ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+353. 1 , [M + 4H] 4+265. 2, [M + 5H] 5+212. 1 ； calu [M+3H] 3+353· 1，[M+4H]4+265. 0，[M+5H] 5+212. 2實施例10 Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser (SEQ. ID NO 11)理論相對分子質(zhì)量 1042. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+348. 5, [M + 4H] 4+26 1 · 4，[M + 5H] 5+209. 4 ； calu [M+3H] 3+348. 4，[M+4H]4+261. 5，[M+5H] 5+209. 4
實施例11Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Met-Ser (SEQ. ID NO 12)理論相對分子質(zhì)量 932. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+3 11. 8, [M + 4H] 4+234. O, [M + 5H] 5+187. 6 ； calu[M+3H]3+311. 7，[Μ+4Η]4+234· 0，[Μ+5Η] 5+187· 4實施例12Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ser-Ser (SEQ. ID NO 13)理論相對分子質(zhì)量 888. OESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+297. O , [Μ + 4Η] 4+223· 1，[Μ + 5Η] 5+178. 5 ； calu[M+3H]3+297. 0，[M+4H]4+223. 0，[M+5H] 5+178. 6實施例13Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 14)理論相對分子質(zhì)量 858. OESI-MSm/z found [M + 3H] 3+287. 1 , [M + 4H] 4+215. 4, [M + 5H] 5+172. 7 ； calu[M+3H]3+287. 0，[M+4H]4+215. 5，[M+5H] 5+172. 6實施例14Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Gly-Ser (SEQ. ID NO 15)理論相對分子質(zhì)量 890. OESI-MSm/z :found[M + 3H] 3 + 297. 5 [M + 4H] 4 + 223. 6， [M+5H]5+178. 9calu[M+3H]3+297. 7, [M+4H]4+223. 5，[M+5H]5+179. O實施例I5Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Cys-Ser (SEQ. ID NO 16)理論相對分子質(zhì)量 890. OESI-MSm/z :found[M + 3H] 3 + 297. 5 [M + 4H] 4 + 223. 5， [M+5H]5+178. 9calu[M+3H]3+297. 7, [M+4H]4+223. 5，[M+5H]5+179. O實施例I6Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Arg-Ser (SEQ. ID NO 17)理論相對分子質(zhì)量 943. 1ESI-MSm/z :found[M + 3H]3 + 315. 5 [M + 4H] 4 + 236. 9， [M+5H]5+189. 6calu[M+3H]3+315. 4，[M+4H]4+236. 8，[M+5H] 5+189. 6實施例17Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 18)理論相對分子質(zhì)量 915. OESI-MSm/z :found[M + 3H] 3 + 306. 1 [M + 4H] 4 + 229. 9， [Μ+5Η]5+184· Ocalu [M+3H] 3+306· O，[Μ+4Η]4+229· 8，[M+5H] 5+184. O實施例18Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Met-Ser (SEQ. ID NO 19))理論相對分子質(zhì) 量 918. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+307. O [M+4H]4+230. 5 [M+5H] 5+184· 6calu [M+3H] 3+307· 0，[Μ+4Η]4+230· 5，[Μ+5Η]5+184. 6實施例19Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ser-Ser (SEQ. ID NO 20)理論相對分子質(zhì)量 874. O
ESI-MSm/z found [M+3H] 3+292. 4[M+4H]4+219. 5 [M+5H] 5+175· 6calu [M+3H] 3+292· 3， [Μ+4Η]4+219· 5，[M+5H]S+175. 8實施例20Pro-Ser-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 21)理論相對分子質(zhì)量 888. OESI-MSm/z :found[M+3H] 3+297. 0[M+4H]4+223. 0[M+5H]5+178. 6calu[M+3H] 3+297. 0， [M+4H]4+223. O, [M+5H]5+178. 6實施例21Pro-Ser-Gly-Arg-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 22)理論相對分子質(zhì)量 973. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+325. 5 [M+4H]4+244. 3 [M+5H] 5+195. 6calu [M+3H] 3+325. 4， [M+4H]4+244. 3，[M+5H]S+165. 6實施例22Pro-Ser-Gly-Cys-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 23)理論相對分子質(zhì)量 920. OESI-MSm/z :found[M+3H]3+307. 7[M+4H]4+231. 0[M+5H]S+185. 2calu[M+3H]3+307. 7， [M+4H]4+231. 0，[M+5H]5+185. O實施例23Pro-Ser-Gly-Gly-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 24)理論相對分子質(zhì)量 874. OESI-MSm/z :found[M+3H] 3+292. 4[M+4H]4+219. 6[M+5H]S+175. 9calu[M+3H] 3+292. 3， [M+4H]4+219. 5，[M+5H]S+175. 8實施例24Pro-Ser-Gly-His-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 25)理論相對分子質(zhì)量 954. OESI-MSm/z found [M+3H] 3+319. 1 [M+4H]4+239. 6[M+5H]5+191. 9calu [M+3H] 3+319. 0， [M+4H]4+239. 5，[M+5H]5+191. 8實施例25Pro-Ser-Gly-Lys-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 26)理論相對分子質(zhì)量 945. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+316. 1 [M+4H]4+273. 1 [M+5H] 5+189. 9calu [M+3H] 3+316. 0， [M+4H]4+237. 3，[M+5H]5+190. O實施例26Pro-Ser-Gly-Met-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 27)理論相對分子質(zhì)量 948. 1
ESI-MSm/z :found[M+3H] 3+317. 1 [M+4H]4+238. 1 [M+5H]5+190. 6calu[M+3H] 3+317. 0， [M+4H] 4+238. 0，[M+5H]5+190. 6實施例27Pro-Ser-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 28)理論相對分子質(zhì)量 980. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+327. 7 [M+4H]4+246. 1 [M+5H] 5+197. 2calu [M+3H] 3+327. 7， [M+4H] 4+246. 0，[M+5H]5+197. 0實施例28Pro-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 29)理論相對分子質(zhì)量 1072. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+358. 4[M+4H]4+269. 1 [M+5H] 5+215. 2calu [M+3H] 3+358. 4， [M+4H] 4+269. 0，[M+5H]S+215. 4實施例29Pro-Ser-Gly-Tyr-Ser-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 30)理論相對分子質(zhì)量 996. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+333. 1 [M+4H]4+250. 2 [M+5H] 5+200. 2calu [M+3H] 3+333. 0， [M+4H]4+250. O, [M+5H]5+200. 2實施例30Pro-Ser-Gly-Tyr-Gly-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser (SEQ. ID NO 31)理論相對分子質(zhì)量 966. OESI-MSm/z found [M+3H] 3+323. 1 [M+4H]4+242. 4 [M+5H] 5+194· 3calu [M+3H] 3+323· 0， [M+4H] 4+242. 5，[M+5H] 5+194. 2實施例31Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 32)理論相對分子 質(zhì)量1021. 2ESI-MSm/z found[M+3H] 3+341. 4[M+4H]4+256. 4[M+5H]5+205. Icalu[M+3H] 3+341. 4， [M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2實施例32Pro-(D-Ala)-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 33)理論相對分子 質(zhì)量1021. 2ESI-MSm/z found[M+3H] 3+341. 5 [M+4H]4+256. 2 [M+5H]5+205. Icalu[M+3H] 3+341. 4， [M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2實施例33Pro-(D-Ala)-Gly-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 34)理論相對 分子質(zhì)量1021. 2ESI-MSm/z found[M+3H] 3+341. 2 [M+4H]4+256. 3 [M+5H]5+205. Icalu[M+3H] 3+341. 4， [M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2實施例34 Pro-Ala-Gly-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 35)理論相對分子質(zhì)量1021. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+341. 3 [M+4H]4+256. 4 [M+5H] 5+205. 4calu [M+3H] 3+341. 4， [M+4H]4+256. 3，[M+5H] 5+205. 2實施例35
Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 36)理論相對分子 質(zhì)量1113. 3ESI-MSm/z found [M+3H] 3+372. 3 [M+4H]4+279. 4 [M+5H] 5+223. 7calu [M+3H] 3+372. 1， [M+4H] 4+279· 3，[M+5H] 5+223. 7實施例36Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser (SEQ. ID NO :37)理論相對分 子質(zhì)量1056. 2ESI-MSm/z :found[M+3H]3+353. 3[M+4H]4+265. 0[M+5H]5+212. 3calu[M+3H]3+353. 1， [M+4H]4+265. 0，[M+5H]5+212. 2實施例37Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser (SEQ. ID NO 38)理論相對分子 質(zhì)量1042. 1ESI-MSm/z found[M+3H] 3+348. 3 [M+4H] 4+261. 4 [M+5H] 5+209. 3. calu [M+3H] 3+348. 4，[M+4H]4+261. 5，[M+5H] 5+209. 4實施例38Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-(D-Ala)-Lys-Ser (SEQ. ID NO 39)理論相對 分子質(zhì)量1056. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+353. 3 [M+4H] 4+265. 0 [M+5H] 5+212. 2. calu [M+3H] 3+353. 1，[M+4H] 4+265. 0，[M+5H] 5+212. 2實施例39Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser- (D-Ala) -Lys-Ser (SEQ. ID NO 40)理論相對分子 質(zhì)量1056. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+353. 1 [M+4H] 4+265. 2 [M+5H] 5+212. 2. calu [M+3H] 3+353. 1，[M+4H] 4+265. 0，[M+5H] 5+212. 2實施例40Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-(D-Ala) -Ser (SEQ. ID NO 41)理論相對分子 質(zhì)量1056. 2ESI-MSm/z :found[M+3H] 3+353. 0 [M+4H]4+265. 0 [M+5H]5+212. 1. calu[M+3H] 3+353. 1，[M+4H] 4+265. 0，[M+5H] 5+212. 2實施例41MC-JJO102及其類似物體內(nèi)降糖活性實驗取10周齡雄性昆明小鼠(體重18 22g)，隨機分組，每組6只。尾靜脈注射四氧嘧 啶給藥建模，給藥劑量為60mg/kg，72小時后，小鼠禁食5 6小時測血糖挑選血糖值范圍 在13 23的小鼠隨機分組，每組6只。成模后的小鼠連續(xù)IOd腹腔注射lmg/kg MC-JJ0102 多肽及其類似物。在0，30，60，90，120用血糖儀測定血糖值。
如表l所示，MC—dd0102多肽及其類似物的降血糖活性強于二甲雙胍。[ol62] 表1MC—ddo 102及其類似物降血糖的效應(yīng)
n一6，x±S．*P<0．05，**P<0．01，***P<0．001 VS saline
權(quán)利要求
一種具有降血糖活性的含有式I(SEQ.ID NO1)結(jié)構(gòu)的苦瓜MC-JJ0102多肽類似物，得到的苦瓜MC-JJ0102多肽類似物；其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式Pro-Xaa1-Gly-Xaa2-Xaa3-Ile-Ser-Xaa4-Xaa5-Ser(SEQ.ID NO1)Xaa1Ala，D-Ala，Gly或SerXaa2Ala，D-Ala，Arg，Cys，Gly，His，Lys，Met，Tyr或SerXaa3Ala，D-AlaGly，Tyr或SerXaa4Lys或SerXaa5Ala，D-Ala，Gly，Cys，Arg，Lys，Met或Ser
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列 Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Ser-Ala-Ser(SEQ. ID NO 2) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Gly-Ser(SEQ. ID NO 3) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Cys-Ser(SEQ. ID NO 4) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Arg-Ser(SEQ. ID NO 5) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 6) Pro-Ala-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 7) Pro-Ala-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 8) Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 9) Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ. ID NO 10) Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser(SEQ.ID NO 11) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Met-Ser(SEQ. ID NO 12) Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ser-Ser(SEQ. ID NO 13) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 14) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Gly-Ser(SEQ. ID NO 15) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Cys-Ser(SEQ. ID NO 16) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Arg-Ser(SEQ. ID NO 17) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 18) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Met-Ser(SEQ. ID NO 19) Pro-Gly-Gly-Ala-Ala-Ile-Ser-Lys-Ser-Ser(SEQ. ID NO 20) Pro-Ser-Gly-Ala-Alr-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 21) Pro-Ser-Gly-Arg-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 22) Pro-Ser-Gly-Cys-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 23) Pro-Ser-Gly-Gly-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 24) Pro-Ser-Gly-His-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 25) Pro-Ser-Gly-Lys-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 26) Pro-Ser-Gly-Met-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 27) Pro-Ser-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ.ID NO 28) Pro-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ. ID NO 29) Pro-Ser-Gly-Tyr-Ser-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ.ID NO 30)Pro-Ser-Gly-Tyr-Gly-Ile-Ser-Lys-Ala-Ser(SEQ.ID NO 31)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Ala-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 32)Pro-(D-Ala)-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 33)Pro- (D-Ala)-Gly- (D-Ala)-Tyr-IIe-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 34) Pro-Ala-Gly-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 35)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 36)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ. ID NO 37)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser(SEQ. ID NO 38)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Tyr-IIe-Ser-(D-Ala)-Lys-Ser (SEQ. ID NO 39) Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-(D-Ala)-Lys-Ser(SEQ. ID NO 40)Pro-Ala-Gly-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-(D-Ala)-Ser(SEQ. ID NO 41)
3.—種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0102多肽類似物或 者其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
4.權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0102多肽類似物或者其藥學上可接受的鹽和藥學上可接 受的載體或稀釋劑在制備用于治療糖尿病的藥物中的運用。
5.權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0102多肽類似物的制備方法，其特征在于采用微波促 進Fmoc/tBu正交保護固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個Fmoc保護氨基 酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護基得到載有第一個氨基酸殘基的樹脂；再 進入下一個偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護的步驟，依 次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹脂，最后用裂解劑將多肽從樹脂上 切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級高效液相色譜純化，凍干得多肽純品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進固相合成MC-JJ0102多肽類似物方法，其特征是載 有第一個Fmoc保護氨基酸的樹脂的制備方法，是通過在微波照射條件下Fmoc保護氨基酸 先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)或其 衍生物抑制消旋，并使用有機堿中和反應(yīng)的酸性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載有第一個Fmoc保護氨基酸的樹脂的制備方法，其特征在 于使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂；使用的活化劑是二環(huán) 己基碳二亞胺(DCC)、N，N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、N，N"-羰基二咪唑(⑶I)、1_乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N' , N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或6-氯苯并三氮唑_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)；使用的1_羥基-苯并 三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)U-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT) 或3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮(HOOBT)；使用的有機堿為三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)；微波促進條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時間為5 15min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進固相合成MC-JJ0102多肽類似物合成方法，其特征 是Fmoc保護基的脫除是通過使用含有0. lmol. L—1的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的六氫 吡啶溶液在微波促進下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基吡咯烷 酮(NMP)為反應(yīng)溶劑；微波促進條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時間為1 IOmin.
全文摘要
本發(fā)明涉及新型高效降血糖苦瓜MC-JJ0102多肽類似物及其微波促進固相合成方法。通過對天然苦瓜多肽的2，4，5，8或9位點進行改造得到具有更長藥理作用時間的MC-JJ0102多肽類似物；其化學合成是通過微波促進固相合成方法而得以高效快速實現(xiàn)，粗品經(jīng)制備級高效液相純化，最后凍干得到MC-JJ0102多肽類似物。
文檔編號C07K1/20GK101838309SQ20101017799
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者張惠斌, 戴冬艷, 曹金明, 杜闊, 王敬杰, 金晶, 錢海, 陳巍, 黃文龍 申請人:中國藥科大學