專利名稱：滴滴涕代謝物dda的多抗血清制備及快速檢測(cè)方法建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種利用蛋白偶聯(lián)合成抗原，制備抗有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的多克隆抗血清，并涉及利用多克隆抗體與DDA抗原結(jié)合，而分析檢測(cè)環(huán)境樣品中的DDA含量的快速方便檢測(cè)試劑盒的制法。
背景技術(shù)：
DDT作為廣譜殺蟲劑曾經(jīng)在20世紀(jì)50年代被大量使用。這一類含氯原子的有機(jī)合成殺蟲劑，具有極高的脂溶性和穩(wěn)定性，可在生物體內(nèi)富集很高的濃度，在環(huán)境中降解緩慢，屬于持久性有機(jī)污染物。DDT在沉積物中的兩種主要分解物是2，2-雙(4-氯苯基)-1， 1-二氯乙烯(DDE)和2，2-雙(4-氯苯基)-1，1_ 二氯乙烷(DDD) ；DDT在動(dòng)物組織內(nèi)可以緩慢降解為2，2_雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)。DDA本身并不積累，而是作為人或動(dòng)物與DDT 暴露接觸的指標(biāo)，已報(bào)道尿液中DDA的含量可以用作人或其他哺乳動(dòng)物暴露接觸DDT的靈敏指標(biāo)。DDT及其代謝產(chǎn)物DDD、DDE等屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，損害動(dòng)物的神經(jīng)和生殖系統(tǒng)，長(zhǎng)期暴露對(duì)肝臟有損害，因此70年代已被發(fā)達(dá)國(guó)家禁止使用，但由于其價(jià)格低廉、殺滅蚊蟲效果顯著，至今在一些發(fā)展中國(guó)家，包括我國(guó)的個(gè)別地區(qū)仍在使用；DDT的羥基同系物三氯殺螨醇(Dicofol)作為農(nóng)業(yè)殺蟲劑尚未被禁用，它含有不低于5%的DDT;因此在食品、環(huán)境樣品中甚至南北極仍能檢出DDT和它的代謝物。目前有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕DDT及其代謝物的常規(guī)分析方法主要有氣相色譜結(jié)合質(zhì)譜或電子捕獲檢測(cè)器方法(GC/MS、GC/FLD)， 該方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的分析人員，而且樣品的前處理過(guò)程繁瑣復(fù)雜，不易滿足大批量樣品的檢測(cè)分析需要，也不適用于現(xiàn)場(chǎng)分析。近年來(lái)得到快速發(fā)展的免疫分析技術(shù)，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)污染物的分析。免疫化學(xué)方法是通過(guò)免疫動(dòng)物制得特異性抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)，利用抗體對(duì)待檢測(cè)抗原的結(jié)合反應(yīng)，按照酶聯(lián)免疫分析方法制成檢測(cè)試劑盒， 用于DDT及其代謝物的分析檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)便、快速，可同時(shí)分析大批量樣品。建立有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物的快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品，對(duì)了解有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕的殘留，特別是對(duì)于保障食品安全具有十分重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述DDT及其代謝物檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種特異、敏感和簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)DDT代謝物之一 DDA的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；為了解決DDA的現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的分析問題，本技術(shù)發(fā)明提供一種抗2，2_雙(4-氯苯基)乙酸的多克隆抗血清的制備，并利用抗DDA的多克隆抗體研制的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析2，2-雙(4-氯苯基)乙酸的試劑盒，簡(jiǎn)單易操作，適于現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的檢測(cè)。本技術(shù)發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是用水溶性碳二亞胺方法，按一定反應(yīng)比例將2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)偶聯(lián)到牛血清蛋白(BSA)上，經(jīng)透析提純偶聯(lián)物，分裝后低溫冷凍保存。免疫時(shí)取30-100 μ g加佐劑充分乳化，皮下多點(diǎn)肌肉注射免疫新西蘭白兔，加強(qiáng)免疫數(shù)次后，由心臟取得免疫兔的血，離心制得抗DDA多克隆抗血清(含特異性抗DDA多克隆抗體)；用合成的DDA-卵清蛋白(DDA-OVA)包被96孔酶標(biāo)板，加入DDA 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入稀釋的DDA多克隆抗體Pab-DDA，包被抗原DDA與自由的DDA競(jìng)爭(zhēng)抗體Pab-DDA，自由的DDA和抗體復(fù)合物被洗去，與包被抗原DDA結(jié)合的抗體Pab-DDA再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，經(jīng)底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值(OD)， OD值越大，樣品中自由的DDA含量越少，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品回歸的方程或曲線，計(jì)算樣品中DDA的含量。本技術(shù)發(fā)明的有益效果是利用制得的含特異性抗DDA多克隆抗體的抗血清，所研制的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，該試劑盒的檢出限小于21ng/ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥DDT代謝物DDA的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高(可達(dá)21ng/mL)，檢測(cè)快速，前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單易掌握等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (制備實(shí)施例)特異性抗DDA多克隆抗體的抗血清制備方法1、DDA-載體蛋白偶聯(lián)物的制備將2，2_雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)溶于二甲基亞砜中，加入水溶性碳化二亞胺 (EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，25°C反應(yīng)2小時(shí)后，加入溶于含有KCL的50mM碳酸鹽緩沖液中(PH 9.6)的牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，25°C反應(yīng)攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物用PBS透析3d，40C，每1 換液1次。透析物分裝后，_20°C保存。制備得到DDA-BSA和 DDA-OVA偶聯(lián)物備用。2、抗DDA多克隆抗血清的制備利用制備的2，2_雙(4-氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物(DDA-BSA)作為免疫原，免疫新西蘭大白兔。首次免疫采用400yL DDA-BSA與等體積完全弗氏佐劑，經(jīng)乳化后， 采取耳、背及腋下多點(diǎn)注射法免疫。此后，分別在第3、5、7、9周取同樣劑量的DDA-BSA與等體積不完全弗氏佐劑乳化后進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫。取兔耳血進(jìn)行多克隆抗體效價(jià)測(cè)定。效價(jià)達(dá)到要求值后，取同劑量的DDA-BSA皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫，3d后經(jīng)由兔子心臟取血，放置沉降，離心，取上層血清，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 (應(yīng)用實(shí)施例)檢測(cè)2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的酶聯(lián)免疫試劑盒使用方法1、貝類等樣品的預(yù)處理稱取貝類勻漿20g，加水5ml (視其水分含量加水，使總水量約20ml)，加丙酮40ml， 振蕩30min，加氯化鈣6g，搖勻。加石油醚30ml，再振蕩30min，靜置分層。取上清液35ml經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，以石油醚定容至5ml，加濃硫酸0. 5ml凈化， 振搖0. 5min,于3000r/min離心15min，再次于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，用5ml PBS完全溶解提取物后，取上清液進(jìn)行分析。2、檢測(cè)
將DDA-OVA偶聯(lián)物作為包被抗原，用碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6)稀釋后加入96孔酶標(biāo)版(10(^17孔)，濕盒中41過(guò)夜；棄去殘液，經(jīng)洗液(PBS-Tween20)清洗3次，拍干后，每孔加入含有PVA的PBS溶液300 μ L于37°C下孵育封閉池，封閉完后置于4°C冰箱中備用(可保存數(shù)周)。測(cè)定時(shí)，棄去封閉液，洗板3次，拍干，加入50 μ L系列稀釋的DDA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液或貝類樣品萃取液，再加入50 μ L適當(dāng)稀釋的特異性抗DDA多抗血清，振搖混勻， 37°C孵育Ih ；洗板、拍干，加入適當(dāng)稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔第二抗體，每孔100 μ L，37°C孵育40min ；洗板、拍干，每孔加底物溶液100 μ L，37°C顯色12min,以2mol/L H2SO4中止反應(yīng) (5(^17每孔)，45011111波長(zhǎng)測(cè)量吸光度值(OD)。以DDA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)孔和空白對(duì)照孔的吸光度值比較得出DDA的含量。實(shí)施例3 (應(yīng)用實(shí)施例)檢測(cè)2，2-雙氯苯基)乙酸的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用1、DDA特異性多抗血清效價(jià)及最適工作濃度實(shí)驗(yàn)免疫開始后，于第四、五、六、七周分別自兔耳部取血，采用直接ELISA方法測(cè)定血清滴度(效價(jià))。免疫4次后，效價(jià)可達(dá)120萬(wàn)以上。經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)，在直接ELISA法中， 根據(jù)不同倍數(shù)稀釋的多抗血清吸光度值，取吸光度值1. 0 1. 5范圍，得出包被抗原的最適稀釋比為1 2000;羊抗兔酶標(biāo)二抗的最適稀釋比為1 12000，通過(guò)直接ELISA方法測(cè)定血清最適稀釋比為1 10萬(wàn)，工作稀釋比為1 5萬(wàn)。2、回收率試驗(yàn)向樣品中分別添加DDA標(biāo)準(zhǔn)，使其最終提取后的濃度為20ng/ml、200ng/ml，每個(gè)濃度做3個(gè)平行測(cè)定，用建立的DDA間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法進(jìn)行DDA含量測(cè)定，與添加的 DDA量比較，計(jì)算得到回收率。在20 200ng/ml濃度范圍內(nèi)，DDA的回收率為90. 05% 106.38%。完全可以滿足定量分析檢測(cè)方法的要求。
權(quán)利要求
1.一種多克隆抗血清。
2.一種專門識(shí)別有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的多克隆抗體，它是由權(quán)利要求1所述的多克隆抗血清含有的。
3.含權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒是檢測(cè)2，2_雙(4-氯苯基) 乙酸的試劑盒。
4.一種快速檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括96孔酶標(biāo)板可拆板條、酶標(biāo)記二抗、含吐溫-20的緩沖鹽洗液、底物液和終止液，其特征是在96孔酶標(biāo)板可拆板條上已包被有合成的蛋白偶聯(lián)物的包被抗原。
5.權(quán)利要求4所述的一種快速檢測(cè)2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其步驟包括(1)將2，2-雙(4-氯苯基)乙酸與載體蛋白偶聯(lián)，制備得到2，2_雙(4-氯苯基)乙酸-載體蛋白偶聯(lián)物；(2)用2，2_雙(4-氯苯基)乙酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭白兔，得到抗2，2_雙 (4-氯苯基)乙酸的多克隆抗血清；(3)將2，2_雙(4-氯苯基)乙酸-卵清蛋白偶聯(lián)物，包被在96孔酶標(biāo)板上，封閉液封閉；(4)將生物樣品萃取液、空白緩沖液或DDA標(biāo)準(zhǔn)液加入到(3)制得的孔中，再加入(2) 制得的含特異性抗體的多克隆抗血清；(5)經(jīng)孵育反應(yīng)、酶標(biāo)二抗標(biāo)記、底物顯色反應(yīng)及終止方應(yīng)，得到所述的檢測(cè)2，2_雙 (4-氯苯基)乙酸DDA的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6.權(quán)利要求3-4任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)2，2-雙(4-氯苯基)乙酸DDA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種利用蛋白偶聯(lián)合成抗原，制備抗有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)的多克隆抗血清，并涉及利用多克隆抗體與DDA抗原結(jié)合，而分析環(huán)境樣品中DDA含量的快速檢測(cè)試劑盒的制法。一種快速檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕代謝物2，2-雙(4-氯苯基)乙酸的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括96孔酶標(biāo)板可拆板條、酶標(biāo)記二抗、含吐溫-20的緩沖鹽洗液、底物液和終止液，利用制得的含特異性抗DDA多克隆抗體的抗血清，在96孔酶標(biāo)板上包被有合成的蛋白偶聯(lián)物的包被抗原。本發(fā)明試劑盒具有前處理簡(jiǎn)單、易操作，適于現(xiàn)場(chǎng)、快速、大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，試劑盒成本低廉、價(jià)格便宜，該試劑盒的檢出限小于21ng/ml。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102234333SQ201010179560
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月8日
發(fā)明者劉仁沿, 梁玉波, 許道艷 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心