專利名稱：雙甲胺草磷(h-9201)的多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙甲胺草磷(H-9201)多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙甲胺草磷(H-9201)是由我國自主研發(fā)的，具有獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的一種新型農(nóng)用 除草劑，該化合物是利用活性與構(gòu)效關(guān)系(QSAR)預(yù)測了其活性，并合成的新化合物，其化 學(xué)名稱為0_甲基-0-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-N-異丙基硫代磷酰胺酯，分子量為 318. 5，是一種硫化磷酰胺酯類化合物，商品名為雙甲胺草磷。該化合物是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型 選擇性土壤處理水旱兩用除草劑，可用于大豆、水稻、小麥、玉米、蔬菜等作物，防除多種一 年生單、雙子葉雜草，殺草譜廣，且可與多種除草劑品種復(fù)配，田間藥效試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)對后茬 作物生長的影響，是一種具有廣泛應(yīng)用價值的新型除草劑品種。目前對雙甲胺草磷(H-9201)殘留檢測的研究報(bào)道僅見氣相色譜法(參見張存政， 張志勇，劉媛，王冬蘭，劉賢進(jìn).新型除草劑雙甲胺草磷(H-9201)在胡蘿卜和土壤中的殘留 動態(tài)研究.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23 (3) :337-339.)，有關(guān)雙甲胺草磷(H-9201)的抗體制備 以及免疫分析法及其在殘留檢測中的應(yīng)用，國內(nèi)外均未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前雙甲胺草磷(H-9201)抗體匱乏，提供一種半抗原為 設(shè)計(jì)合成的結(jié)構(gòu)為分子式(4)的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的雙甲胺草磷(H-9201)的 多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體，由半抗原 與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于半抗原是 由的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物引入羧基制備，所述雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物為分 子結(jié)構(gòu)式⑷，
(4)化學(xué)名稱為0_甲基-0-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)_氨基硫代磷酰胺酯，分 子量為276. 249。在雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體中，適合動物免疫的半抗原_載體蛋白偶聯(lián) 物的結(jié)構(gòu)為分子式(1)，
其中，R為 BSA 或 OVA。它是以設(shè)計(jì)合成的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物為半抗原，以琥珀酸酐為橋梁，
使一個羧基與半抗原的氨基聯(lián)結(jié)，繼爾以活性酯法使之與載體蛋白偶聯(lián)后獲得的 上述設(shè)計(jì)合成的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的合成具體步驟如下(1)分子結(jié)構(gòu)式(6)的甲氧基硫代磷酰二氯的合成三氯硫磷預(yù)冷后，緩慢滴加甲醇，溶液溫度控制在_5°C以下，三氯硫磷甲醇的克 分子比1 5。甲醇滴加完畢后，持續(xù)攪拌15min。冰水洗滌溶液。分層后，取下層，獲得甲 氧基硫代磷酰二氯，-20°C保存，分子結(jié)構(gòu)式(6)。(2)分子結(jié)構(gòu)式(5)化合物的合成將30ml甲氧基硫代磷酰二氯、DMNT的丙酮混合液預(yù)冷至5 10°C，滴加三乙胺催 化反應(yīng)，監(jiān)測PH約為6 ；將20%氫氧化鈉水溶液，滴加到反應(yīng)液當(dāng)中，滴加完后pH約為12 ； 反應(yīng)體系中甲氧基硫代磷酰二氯DMNT NaOH的克分子比為1 1 1. 1。反應(yīng)溶液抽 濾除去鹽酸鹽后保存濾液，獲得含有結(jié)構(gòu)為分子式(5)化合物的丙酮溶液。(3)分子結(jié)構(gòu)式⑷的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的合成將含有為分子結(jié)構(gòu)式(5)化合物的丙酮溶液預(yù)冷至5 10°C，向其中滴加氨水。 氨水滴加完后PH約為8，滴加40%的氫氧化鈉水溶液至PH為10，脫去丙酮，加入30mL乙醚 分兩次萃取，水洗滌乙醚層，經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，脫去乙醚。柱層析分離，取中間的組分， 脫去溶劑，獲得雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物，為分子結(jié)構(gòu)式(4)。上述雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備，其特征在于用活性酯法使半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)，合成免疫抗原，再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得雙甲胺 草磷(H-9201)的多克隆抗體。在雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備中活性酯法合成免疫抗原的步驟 是0. 5mM的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物與0. 8mM的琥珀酸酐乙腈溶液共IOml充 分混勻，滴加0. 5mM DMAP乙腈溶液，50°C攪拌反應(yīng)2小時；終止反應(yīng)后加入50ml蒸餾水， 用二氯甲烷萃取，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂除水后，脫去有機(jī)溶劑，獲得分子結(jié)構(gòu)式(3)的化合 物，形成半抗原；向0. 3mM分子結(jié)構(gòu)式(3)化合物的二氯甲烷溶液中加入DMF溶解的0. 23mM 的NHS，0. 33mM的DCC，0. 033mM的DMAP，0°C攪拌反應(yīng)過夜；次日IOOOOg離心lOmin，棄去沉 淀，脫去溶劑，以DMF溶解所得活化酯，分子結(jié)構(gòu)式(2)，將活化酯溶液緩慢加入到5mL預(yù)冷 的含有40mg牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液的pH為9. 0，4°C反應(yīng)過 夜；將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4°C透析3天，每8小時換水一次，透析 結(jié)束后獲得適合動物免疫的免疫抗原，如分子結(jié)構(gòu)式(1)，將它們分裝_20°C保存中備用；
將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得雙甲胺草磷的多克隆抗體。上述雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于將所述多克隆抗體 采用間接競爭性ELISA法對水體中雙甲胺草磷(H-9201)的殘留進(jìn)行檢測，檢測中使用的包 被抗原為半抗原通過活性酯法與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)物。在雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的應(yīng)用中活性酯法合成包被抗原的步驟 同前述與免疫抗原的BSA的合成過程，其區(qū)別僅在于在磷酸鹽緩沖液中用卵清蛋白OVA替 代牛血清白蛋白BSA;在雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的應(yīng)用中多克隆抗體采用間接競爭性 ELISA法對水體中雙甲胺草磷(H-9201)的殘留進(jìn)行檢測是指將被測樣品提取、凈化后制 備得到ELISA待測液，然后利用間接競爭性ELISA法進(jìn)行檢測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待 測樣品中的雙甲胺草磷(H-9201)含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備方法簡單，可以用 于對樣本中的雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測，適合大量樣品快速篩查檢測。


圖1是雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的核磁共振圖(NMR)；圖2是圖1的局部放大圖；圖3是雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的液相色譜-質(zhì)譜圖(LC/MS)，其中a是化合 物總離子流圖，b是該化合物的多級質(zhì)譜圖；圖4是分子結(jié)構(gòu)式(3)的化合物的液相色譜/質(zhì)譜圖(LC/MS)；圖5是雙甲胺草磷(H-9201)半抗原(hapten)、BSA及偶聯(lián)物(hap-bsa)的紫外掃 描圖譜；圖6是雙甲胺草磷(H-9201)半抗原(hapten)、OVA及偶聯(lián)物(hap-ova)的紫外掃 描圖譜；圖7是間接競爭ELISA法建立的雙甲胺草磷(H-9201)檢測標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
具體實(shí)施例方式通過下述實(shí)施實(shí)例結(jié)合附圖有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1.雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物的制備以三氯硫磷與甲醇為原料，溶液溫度控制在_5°C以下進(jìn)行反應(yīng)，冰水洗滌溶液留 取下層，得到甲氧基硫代磷酰二氯。在5 10°C丙酮溶液溫控條件下，以三乙胺為催化劑，甲氧基硫代磷酰)與2， 4-二甲基-6-硝基苯酚(DMNT)，氫氧化鈉(NaOH)反應(yīng)獲得含有分子結(jié)構(gòu)式(5)化合物的 丙酮溶液。將含有分子結(jié)構(gòu)式(5)的化合物溶液預(yù)冷至5 10°C，向其中滴加氨水。氨水滴 加完后PH約為8，滴加40 %的氫氧化鈉水溶液至PH為10，脫去丙酮，加入30mL乙醚分兩 次萃取，水洗滌乙醚層，經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，脫去乙醚。柱層析分離，取中間的組分，脫去 溶劑，獲得雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物；TLC監(jiān)控反應(yīng)出現(xiàn)新的產(chǎn)物斑點(diǎn)(展開劑石油 醚乙酸乙酯=4 1)；經(jīng)NMR，LC/MS鑒定結(jié)構(gòu)與分子量正確，產(chǎn)率為78%。見圖1 圖 3。產(chǎn)物的NMR 數(shù)據(jù)2. 77 (t，J = 7. 2，3H，0CH2CH3)，2. 04 (s，3H，C0CH3)，2. 34 (s， 3H, PhCH3)，2. 44 (s, 3H, PhCH3)，3. 70 (bd, 3H, NH2) ,3. 77, 3. 80 (ss, 3H, 0CH3)，4. 09 (q, J = 7. 1，2H，0CH2CH3)，7. 27 (s, 1H, PhH)，7. 51 (s，1H，PhH)實(shí)施例2.分子結(jié)構(gòu)式(3)的化合物的制備0. 5mM的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物與0. 8mM的琥珀酸酐乙腈溶液共10ml充 分混勻，滴加0. 5mM DMAP乙腈溶液，50°C攪拌反應(yīng)2小時；終止反應(yīng)后加入50ml蒸餾水， 用二氯甲烷萃取，有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂除水后，脫去有機(jī)溶劑，獲得分子結(jié)構(gòu)式(3)的化合 物。其液相色譜/質(zhì)譜鑒定圖(LC/MS)見圖4。實(shí)施例3.抗原的合成向含有0. 3mM分子結(jié)構(gòu)式(3)化合物的二氯甲烷溶液中加入0. 23mM的NHS， 0. 33mM的DCC，0. 033mM的DMAP，0°C攪拌反應(yīng)過夜；次日10000g離心lOmin，棄去沉淀，脫 去溶劑，以DMF溶解所得活化酯，將活化酯溶液緩慢加入到5mL預(yù)冷的含有40mg牛血清白 蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液的pH為9. 0，4°C反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4°C透析3天，每8小時換 水一次，透析結(jié)束后獲得分子結(jié)構(gòu)式(1)的免疫抗原，分裝并保存于-20°C冰箱中備用。如 圖5圖6所示的紫外掃描圖譜可見，半抗原(hapten)、載體蛋白(BSA或0VA)的最大吸收峰 分別為260nm和278nm，而偶聯(lián)物(hap-bsa或hap-ova)的最大吸收峰介于260nm 278nm 之間，初步證明偶聯(lián)成功。在圖5中，由上至下分別為半抗原，BSA，偶聯(lián)物；在圖6中，由從 上至下分別為半抗原，偶聯(lián)物，0VA。實(shí)施例4.雙甲胺草磷(H-9201)多克隆抗體的制備用合成的偶聯(lián)物作為免疫抗原Hapten-BSA，選取2只1. 5 2. 0kg的純種新西蘭 大白兔作為試驗(yàn)動物，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，試驗(yàn)前一周采集陰性血清。首次免疫采用 lmg免疫原與弗氏完全佐劑等體積混和，背部皮下多點(diǎn)注射。三周后用同樣劑量免疫原與等體積不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每兩周加強(qiáng)1次，共加強(qiáng)4次。最后一次免疫用2mg免 疫原與等體積的生理鹽水混合，耳緣靜脈注射。七天后心臟采血，血液4°C放置過夜，凝結(jié)后 吸取清，40%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清，沉淀用PH7. 4的磷酸緩沖液溶解，超濾管 脫鹽純化血清后，即得多克隆抗體。實(shí)施例5間接非競爭ELISA法測定抗體的滴度及工作濃度(1)工作濃度的確定方陣滴定法確定抗體及包被抗原的工作濃度。選擇0D值為1. 0時的抗原抗體稀 釋濃度作為包被抗原抗原、抗體工作濃度，最終選擇的包被抗原稀釋倍數(shù)為1/512(以蛋白 計(jì)，包被抗原實(shí)際濃度為2. 3 u g/mL)，抗體的工作濃度為1/18，000。具體操作步驟如下①包被CBS包被緩沖液將包被抗原倍比稀釋2n(n = 7，8，9，10) 4組，分別加于96 孔酶標(biāo)微孔板的A和B、C和D、E和F、G和H的四組八行中，100 ii L/孔，4°C過夜。②封閉每孔加1 % OVA封閉液200 u L，37°C孵育lh。③加樣將倍比稀釋的六組抗體分別加于酶標(biāo)板的1和2、3和4、5和6、7和8、9 和10、11和12的六組十二列孔中，100 u L/孔，以陰性血清作對照，PBS溶液為空白，37°C孵 育2h。④加酶標(biāo)二抗用含1 % OVA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100 u L/孔加 入酶標(biāo)板，37°C孵育lh。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100 u L/孔，37°C顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2M H2S04快速加到96孔中，50y L/孔，450nm讀取光吸收值。(2)效價的測定用方陣滴定法確定的包被原工作濃度包被96孔酶標(biāo)微孔板，將抗血清(陽性血 清)和陰性血清進(jìn)行倍比稀釋，以PBS溶液作為空白對照，用間接非競爭ELISA法測定抗體 效價，具體步驟按照以下步驟進(jìn)行。以A陽/A陰> 2. 1的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的最終效 價?？贵w計(jì)算獲得的最終效價為1/102，400。具體操作步驟如下①包被CBS包被緩沖液將2 u g/ml包被原倍加入96孔酶標(biāo)微孔板中，100 u L/ 孔，4°C過夜。②封閉每孔加1 % OVA封閉液200 u L，37°C孵育lh。③加樣將倍比稀釋1000X2n(n = 7,8,9,10，11，12)的六組抗體分別加于酶標(biāo)板 的1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12的六組十二列孔中，100 u L/孔，以陰性血清 作對照，PBS溶液為空白，37 °C孵育2h。④加酶標(biāo)二抗用含1 % OVA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100 u L/孔加 入酶標(biāo)板，37°C孵育lh。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100 u L/孔，37°C顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2M H2S04快速加到96孔中，50y L/孔，450nm讀取光吸收值。當(dāng)光吸收值低于0. 2時為陰性血清；當(dāng)光吸收值高于0. 2時為陽性血清。實(shí)施例6.間接競爭ELISA(IC-ELISA)的建立具體步驟如下
(1)抗體與標(biāo)樣(待測樣)預(yù)混用含有10% (ν/ν)甲醇的PBS緩沖液配置不同 濃度的雙甲胺草磷(Η-9201)標(biāo)樣，濃度分別為0. 05μ g/ml，0· 1 μ g/ml, 1 μ g/ml,5yg/ml, 10yg/ml,20yg/mL·用PBS將抗體稀釋9000倍(兩倍工作濃度)，再與等體積的標(biāo)樣(待 測樣品)室溫預(yù)混進(jìn)行前抑制，對照用PBS與抗體等體積預(yù)混，過夜。(2)包被CBS緩沖液將2ug/ml包被抗原，100 μ L/孔分別加入酶標(biāo)板，4°C過夜。(3)封閉每孔加封閉液200 μ L，37°C溫浴lh。(4)加樣品將預(yù)混液加入酶標(biāo)板，100 μ L/孔，以PBS為空白對照，37°C溫浴2h。(5)加酶標(biāo)二抗用含1 % OVA的PBS將酶標(biāo)二抗稀釋到工作濃度加入酶標(biāo)板， 100 μ L/ 孔，37°C溫浴 lh。(以上每一步結(jié)束都用洗滌液PBST洗3次)(6)顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100 μ L/孔，37°C顯色15min。(7)終止反應(yīng)50 μ L/孔2Μ H2SO4快速加到96孔酶標(biāo)板中，于450nm讀取光吸收值。將不同濃度雙甲胺草磷(H-9201)標(biāo)樣對應(yīng)的吸光值(OD)結(jié)果，按照公式抑制率 (I) = 100 [ (0D對照-OD標(biāo)樣)/OD對照]，計(jì)算抑制率(I)。以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度 (C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。建立雙甲胺草磷(H-9201)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(如圖5所 示)，并對線性范圍進(jìn)行回歸分析。計(jì)算得到，雙甲胺草磷(H-9201)對抗體的抑制中濃度 (I50)為1. 554μ g/mL，雙甲胺草磷(H-9201)最低檢測限I10為0. 0945 μ g/mL，線性檢測范 圍在 0. 1524 12. 4135 μ g/mL。見圖 8。實(shí)施例7.本發(fā)明對水體中雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥殘留的檢測具體操作如下(1)樣品提取采集田間無污染的水沉淀雜質(zhì)，過0. 45um微孔濾膜后備用，分別取 IOml水樣，添加雙甲胺草磷(H-9201)標(biāo)樣(用含有10%甲醇(ν/ν)的PBS溶液配置)，使 得樣品中雙甲胺草磷(Η-9201)的含量分別為lmg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg五 個水平，第六組添加甲醇作為空白對照，每組重得4次，室溫下放置2小時。水樣中加入2g NaCL, 3ml X 3正己烷提取，合并提取液后，氮?dú)鉂饪s至干，用PBST緩沖液稀釋至檢測濃度 范圍，進(jìn)行ELISA檢測。(2) ELISA 檢測方法用間接競爭性ELISA方法測定，將添加樣品的提取液與等體積抗體預(yù)混兩小時， 根據(jù)實(shí)施例6的步驟進(jìn)行間接競爭性ELISA測定，計(jì)算水體中雙甲胺草磷(H-9201)的殘留 量及添加回收率及變異系數(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)水體中雙甲胺草磷(H-9201)濃度在lmg/kg-20mg/kg的范圍內(nèi)，添加 回收率為 72. 5士5. 5% 85. 2士4. 3%。以上各實(shí)施例不是對本發(fā)明的具體限定。
權(quán)利要求
一種雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體，由半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于半抗原是由的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物引入羧基制備，所述雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物為分子結(jié)構(gòu)式(4)，其化學(xué)名稱為O-甲基-O-(2，4-二甲基-6-硝基苯氧基)-氨基硫代磷酰胺酯，分子量為276.249。FSA00000137985400011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體，其特征在于所述的雙 甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物是這樣合成的1)以三氯硫磷與甲醇為原料，溶液溫度控制在_5°C以下進(jìn)行反應(yīng)，冰水洗滌溶液留取 下層，得到甲氧基硫代磷酰二氯，為分子結(jié)構(gòu)式(6) 2)在5 10°C丙酮溶液溫控條件下，以三乙胺為催化劑，甲氧基硫代磷酰二氯與2， 4-二甲基-6-硝基苯酚(DMNT)，氫氧化鈉(NaOH)反應(yīng)獲得含有分子結(jié)構(gòu)式(5)化合物的 丙酮溶液， 3)在5 10°C溶液溫控條件下，向預(yù)冷的含有分子結(jié)構(gòu)式(5)化合物的丙酮溶液中滴 加氨水，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液PH為10進(jìn)行反應(yīng)，得到雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物，分子 結(jié)構(gòu)式⑷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體，其特征在于適合 動物免疫的半抗原_載體蛋白偶聯(lián)物，如分子結(jié)構(gòu)式(1)， 其中，R為BSA或OVA
4. 一種如權(quán)利要求1所述雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備方法，其特征在于a)以4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，使所述分子結(jié)構(gòu)式⑷的雙甲胺草磷過渡態(tài) 類似化合物與琥珀酸酐(Succinic anhydride)在50°C溫控乙腈溶液中反應(yīng)，獲得分子結(jié) 構(gòu)式(3)的化合物，形成半抗原， b)在溫控為0°C的除水的二氯甲烷溶液中，以DMAP為催化劑的條件下，分子結(jié)構(gòu)式(3) 的化合物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)反應(yīng)過夜，獲得溶 有分子結(jié)構(gòu)式(2)的化合物活化酯， (2) ；c)以pH為9的溶有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液與溶有分子結(jié)構(gòu)式(2)的化合物活 化酯的DMF溶液在4°C溫度條件下反應(yīng)過夜，獲得含有分子結(jié)構(gòu)式⑴的半抗原-載體蛋白 偶聯(lián)物的反應(yīng)混合液；d)將含有半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4°C透 析3天，每8小時換水一次，透析結(jié)束后獲得免疫抗原；e)再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得雙甲胺草磷的多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備方法，其特征在 于免疫新西蘭大白兔前，d步驟獲得的免疫抗原應(yīng)該分裝保存于-20°C冰箱中備用。
6.一種如權(quán)利要求1所述雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于將 多克隆抗體建立的間接競爭性ELISA法對水樣中雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢 測，檢測中使用的包被抗原是這樣獲得的在權(quán)利要求4所述多克隆抗體的制備方法的a b步驟的基礎(chǔ)上，以pH為9的溶有卵 清蛋白OVA的磷酸鹽緩沖液，與溶有分子結(jié)構(gòu)式⑵的化合物活化酯的DMF溶液在4°C溫度 條件下反應(yīng)過夜，獲得含有分子結(jié)構(gòu)式(1)的半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的反應(yīng)混合液；將含有半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4°C透析3 天，每8小時換水一次，透析結(jié)束后獲得包被抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于多 克隆抗體采用間接競爭性ELISA法對水樣中雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測是 指將被測水樣經(jīng)簡單過濾凈化處理、提取后制備得到ELISA待測液，然后利用間接競爭性 ELISA法進(jìn)行檢測，計(jì)算得出待測樣品中的雙甲胺草磷(H-9201)含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，多克隆抗體是由半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于半抗原為設(shè)計(jì)合成的分子結(jié)構(gòu)式(4)的雙甲胺草磷過渡態(tài)類似化合物，并引入羧基制備半抗原；其次，采用活性酯法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原；經(jīng)動物免疫獲得多克隆抗體，建立了ELISA檢測方法，本發(fā)明可對水體樣本中雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測。其優(yōu)點(diǎn)是雙甲胺草磷(H-9201)的多克隆抗體的制備可以用于水體中的雙甲胺草磷(H-9201)農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速，大量樣本的篩查。
文檔編號C07F9/24GK101870731SQ20101017960
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者俞杰, 劉賢進(jìn), 張存政, 楊春龍, 陳敏 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院