專(zhuān)利名稱(chēng)：一種糖肽富集分離材料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖肽富集分離材料及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖肽是肽鏈上以共價(jià)鍵形式連有糖鏈的肽段，是糖蛋白質(zhì)酶切的產(chǎn)物。由于糖肽與非糖肽的物理化學(xué)性質(zhì)存在巨大的差異，在利用質(zhì)譜鑒定糖肽時(shí)非糖肽對(duì)糖肽有著嚴(yán)重抑制作用，以致利用常規(guī)的蛋白質(zhì)鑒定方法難以對(duì)糖肽進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。糖蛋白質(zhì)中糖鏈結(jié)構(gòu)的變化與疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在著密切的關(guān)系，糖鏈結(jié)構(gòu)的變化將是預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程的重要標(biāo)志物，對(duì)糖肽進(jìn)行富集分離是開(kāi)展糖鏈結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵一步。利用凝集素能夠特異結(jié)合糖鏈的特性可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白質(zhì)的富集，但該方法的缺點(diǎn)是每種凝集素只針對(duì)一種類(lèi)型的糖鏈，在研究糖鏈組成和結(jié)構(gòu)時(shí)仍然需要對(duì)糖肽進(jìn)行富集，且該方法費(fèi)用昂貴；基于糖肽分子量遠(yuǎn)大于非糖肽的特點(diǎn)，可以利用體積排阻色譜法富集分離糖肽，但該技術(shù)的分離效率較低；胼解法是目前分離糖肽高特異的方法之一，該方法的不足之處是在糖肽富集過(guò)程中糖鏈的組成可能被破壞，得到的糖鏈信息不完整；親水性色譜法可以富集親水性的糖肽，同時(shí)也可以富集親水性的非糖肽，其方法獲得的糖肽純度較低；功能性磁珠(包括硼酸功能化的磁珠及大孔徑硅膠等)也被用來(lái)富集糖肽，這類(lèi)技術(shù)方法需要一些化學(xué)反應(yīng)，這增加了富集過(guò)程的復(fù)雜度，限制了該方法的廣泛應(yīng)用，且不能實(shí)現(xiàn)高通量的糖肽富集；親水性相互作用液相色譜和離子色譜也可用來(lái)從糖蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物中富集分離糖肽，但存在明顯的偏好性，并在富集糖肽過(guò)程中引入了大量無(wú)機(jī)鹽離子，增加了后續(xù)糖鏈鑒定的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)、高效、無(wú)偏好的糖肽富集分離材料及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的糖肽富集分離材料，為質(zhì)量比為1 1的石墨碳和活性碳的混合物，石墨碳粒度(顆粒直徑)范圍為5-8 μ m?；钚蕴剂６?顆粒直徑)范圍為3-5 μ m。以上述糖肽富集分離材料為填料的層析柱系統(tǒng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。本發(fā)明還提供上述的糖肽富集分離材料在富集分離糖肽中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是利用上述的糖肽富集分離材料作為層析柱的填料，富集分離糖肽；富集分離包括下述步驟1)用平衡液平衡層析柱；2)將待分離的樣品溶液過(guò)層析柱；3)用去離子水沖洗層析柱；4)用洗脫液洗脫，收集洗脫液；所述平衡液的pH值為3. 0 ；所述樣品溶液的pH值為3. 0 ；所述洗脫液的pH值為 4. 0。所述平衡液為pH3. 0，體積百分濃度為0. 2%的甲酸溶液；所述樣品溶液為含待測(cè)樣品，pH3. 0，體積百分濃度為0. 2%的甲酸溶液，所述洗脫液為pH4. 0，含有0. 2%甲酸的30%的乙腈溶液；所述百分濃度為體積百分濃度。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的糖肽富集分離材料對(duì)糖肽有很好的富集效果，富集產(chǎn)物純度高于90%，回收率高于85%，比較其他比例的石墨碳和活性炭的混合物，本發(fā)明的材料對(duì)糖肽表現(xiàn)出來(lái)的特異性不是二者物理化學(xué)性質(zhì)的簡(jiǎn)單加和作用，而是二者高度協(xié)同作用的結(jié)果。本發(fā)明利用惰性無(wú)機(jī)材料與適當(dāng)?shù)南疵撘?有機(jī)緩沖液)結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的高效和無(wú)偏好富集分離。


圖1.石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集分離卵清蛋白質(zhì)雙酶切前后的質(zhì)譜圖。a:富集前雙酶切的卵清蛋白質(zhì)譜圖；b 富集后質(zhì)譜圖，星號(hào)所標(biāo)注的為糖肽峰。圖2.胎球蛋白質(zhì)雙酶切后經(jīng)石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集分離前后的質(zhì)譜圖。a:富集前雙酶切胎球蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖；b:富集后的質(zhì)譜圖，星號(hào)標(biāo)注的為糖肽峰。圖3.觸珠蛋白β鏈雙酶切后經(jīng)石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集前后的質(zhì)譜圖。a:富集前雙酶切觸珠蛋白β鏈的質(zhì)譜圖；b:富集后的質(zhì)譜圖，星號(hào)標(biāo)注為糖肽峰；c :m/z 2554. 2離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。圖4.石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集卵清蛋白質(zhì)糖肽的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5.石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集胎球蛋白質(zhì)糖肽的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6.石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集觸珠蛋白β鏈糖肽的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7.石墨碳與活性碳不同混合比例對(duì)富集卵清蛋白質(zhì)糖肽的影響(G 石墨碳； Α:活性炭)。石墨碳與活性炭質(zhì)量比(G /A) 3 0(a) ；2 1(b) ；1 1(c) ；1 2(d)； 0 3(e)圖8.石墨碳與活性碳不同混合比例對(duì)富集胎球蛋白質(zhì)糖肽的影響(G 石墨碳； Α:活性炭)。石墨碳與活性炭質(zhì)量比(G /A) 3 0(a) ；2 1(b) ；1 1(c) ；1 2(d)； 0 3(e)圖9.石墨碳與活性碳不同混合比例對(duì)富集觸珠蛋白β鏈糖肽的影響(G 石墨碳；Α:活性炭)。石墨碳與活性炭質(zhì)量比(G:/A) 3 0(a) ；2 1(b) ；1 1(c) ；1 2(d)； 0 3(e)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、糖肽富集分離材料的制備及其效果驗(yàn)證一、糖肽富集分離材料及其應(yīng)用方法1、糖肽富集分離材料本發(fā)明的發(fā)明人在長(zhǎng)期試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)以石墨碳和活性碳(1 1，質(zhì)量比)的混合物作為分離固定相，可以高效、無(wú)偏好地富集分離來(lái)自各種類(lèi)型糖蛋白質(zhì)的糖肽。以下述試驗(yàn)為例說(shuō)明本發(fā)明的使用方法和效果。2、應(yīng)用方法 利用該混合物(1 1，質(zhì)量比)可以制成各種分析型、制備型色譜柱以及微量樣本處理用的ZipTip柱等。二、糖肽富集分離材料及其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集分離糖肽的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以雞卵清蛋白質(zhì)(非唾液酸化糖蛋白質(zhì))、牛胎球蛋白質(zhì)(高唾液酸化糖蛋白質(zhì)) 和健康人血液中的觸珠蛋白β鏈(低唾液酸化糖蛋白)三種不同類(lèi)型的糖蛋白質(zhì)為驗(yàn)證對(duì)象。利用胰酶(Roche公司，貨號(hào)11418025001)分別將上述三種蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，之后分別再用蛋白酶K(Promega公司，貨號(hào)V302B 224258)酶切。雙酶切后肽段混合物用甲酸溶解調(diào)PH為3.0，用石墨碳和活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物為固定相填充Tip制成ZipTip 柱富集糖肽。具體過(guò)程為所用石墨碳粒度范圍為5-8 μ m，活性碳粒度范圍為3-5 μ m。稱(chēng)取相同質(zhì)量的石墨碳與活性碳，溶于80% (體積百分濃度)的乙腈溶液中制成等質(zhì)量比例混合的石墨碳與活性碳混合物，裝柱前充分混勻。然后進(jìn)行如下的糖肽富集分離過(guò)程1)裝柱取適量的石墨碳與活性碳混合物溶液，裝入Tip管內(nèi)，制成長(zhǎng)度5_8mm的 ZipTip柱，并用80% (體積百分濃度)的乙腈溶液沖洗備用。2)平衡加入30 μ L ρΗ3· 0,0.2% (體積百分濃度)的甲酸溶液，30g離心10分
鐘，重復(fù)3次。3)上樣雙酶切好的樣品，用甲酸溶液調(diào)樣本溶液pH值為3.0，然后用pH3.0， 0.2% (體積百分濃度)的甲酸溶液稀釋到30 μ L，加到平衡好的ZipTip柱內(nèi)，30g離心10 分鐘。4)沖洗:20 μ L去離子水，30g離心10分鐘，重復(fù)2次。5)洗脫10 μ L ρΗ4· 0，含有0· 2% (體積百分濃度)甲酸的30% (體積百分濃度) 乙腈溶液，30g離心5分鐘，重復(fù)3次，并收集，即富集分離得到的糖肽溶液。富集分離到的糖肽溶液冷凍抽干，-80°C保存以備質(zhì)譜檢測(cè)。上述三種糖蛋白質(zhì)的糖肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖1-3所示。結(jié)果表明1)雞卵清蛋白質(zhì)是由386氨基酸殘基組成的分泌性糖蛋白，其肽鏈上只有一個(gè)糖基化位點(diǎn)(第292位的天冬酰胺)。經(jīng)過(guò)雙酶切后，質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖Ia和Ib所示。圖Ib是富集后的質(zhì)譜圖，質(zhì)譜峰主要為卵清蛋白質(zhì)的糖肽信號(hào)。圖Ib中糖肽信號(hào)峰間的質(zhì)荷比(m/z)之差與單糖殘基質(zhì)量數(shù)一致(如162和203Da分別對(duì)應(yīng)己糖和 N-乙酰己糖)，糖肽峰成簇出現(xiàn)，表明糖蛋白質(zhì)的糖基化存在微觀不均一性。圖Ib中m/ zl750. 1,1912. 1，2157. 9，2359. 1和2522. 6對(duì)應(yīng)的肽段為YNLT，它們分別對(duì)應(yīng)的糖鏈為 (GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) ^ex1, (GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) ^ex2, (GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) 3Ηθχι; (GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) 4HeXl 及(GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) 4Hex2。由圖 lb 可知，石墨碳 / 活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物可以高效的富集卵清蛋白質(zhì)雙酶切后的糖肽。2)胎球蛋白質(zhì)有三個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第37、137及271位的天冬酰胺上，胎球蛋白質(zhì)是一高唾液酸化的糖蛋白，在其天線末端連接著唾液酸。圖2為用石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集雙酶切胎球蛋白質(zhì)前后的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)一系列的相差291Da的糖肽信號(hào)峰(圖2b)，291Da是唾液酸殘基的質(zhì)量數(shù)。圖2結(jié)果表明石墨碳與活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物柱對(duì)高唾液酸化的糖蛋白質(zhì)也有很好的富集效果。3)觸珠蛋白β鏈有四個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第184、207、211和241位的天冬酰胺上。觸珠蛋白β鏈上所連接的糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能包含雙天線、三天線和四天線的復(fù)雜或者雜合型的糖鏈，另外還存在唾液酸化和巖藻糖化。觸珠蛋白β鏈雙酶切后的混合肽段經(jīng)石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集分離后，其質(zhì)譜圖中是以質(zhì)荷比(m/z)相差291Da的質(zhì)譜峰為主的一簇糖肽峰(圖3b)。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖(圖3c)，可以得出質(zhì)荷比 (m/z)在 2554. 2 的糖肽所連的糖鏈?zhǔn)?GlcNAc) 2Man3 (HexNAc) 2Hex2。2、石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)柱的重現(xiàn)性考察為了驗(yàn)證石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集糖肽的重現(xiàn)性，以卵清蛋白質(zhì)、胎球蛋白質(zhì)及觸珠蛋白β鏈為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。方法如下所用石墨碳粒度范圍為5-8 μ m，活性碳粒度范圍為3-5 μ m。稱(chēng)取相同質(zhì)量的石墨碳與活性碳，溶于80%的(體積百分濃度)乙腈中制成等比例混合的石墨碳與活性碳混合物，裝柱前充分混勻。然后進(jìn)行如下的糖肽富集分離過(guò)程

1)裝柱取適量的石墨碳與活性碳混合物溶液，裝入Tip管內(nèi)，制成長(zhǎng)度5_8mm的 ZipTip柱，并用80% (體積百分濃度)的乙腈溶液沖洗備用。2)平衡加入30 μ L ρΗ3· 0,0.2% (體積百分濃度)的甲酸溶液，30g離心10分
鐘，重復(fù)3次。3)上樣雙酶切好的樣品，用甲酸溶液調(diào)樣本溶液pH值為3.0，然后用pH3.0， 0.2% (體積百分濃度)的甲酸溶液稀釋到30 μ L，加到平衡好的ZipTip柱內(nèi)，30g離心10 分鐘。4)沖洗:20 μ L去離子水，30g離心10分鐘，重復(fù)2次。5)洗脫10 μ L ρΗ4· 0，含有0· 2% (體積百分濃度)甲酸的30% (體積百分濃度) 乙腈溶液，30g離心5分鐘，重復(fù)3次，并收集，即富集分離得到的糖肽溶液。富集分離到的糖肽溶液冷凍抽干，-80°C保存以備質(zhì)譜檢測(cè)。其結(jié)果分別見(jiàn)圖4-6。每次富集到的糖肽的相對(duì)強(qiáng)度列于表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明石墨碳/活性碳(1 1， 質(zhì)量比)混合物用于糖肽的富集分離時(shí)具有較高的重現(xiàn)性。表1.石墨碳/活性碳(1 1，質(zhì)量比)混合物富集糖肽三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的糖肽峰相對(duì)強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種糖肽富集分離材料，為質(zhì)量比為1 1的石墨碳和活性炭的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖肽富集分離材料，其特征在于石墨碳粒度范圍為5-8μ m， 活性碳粒度范圍為3-5 μ m。
3.以權(quán)利要求1所述糖肽富集分離材料為填料的層析柱。
4.權(quán)利要求1所述的糖肽富集分離材料在富集分離糖肽中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是利用權(quán)利要求1所述的糖肽富集分離材料作為層析柱的填料，富集分離糖肽；富集分離包括下述步驟1)用平衡液平衡層析柱；2)將待分離的樣品溶液過(guò)層析柱；3)用去離子水沖洗層析柱；4)用洗脫液洗脫，收集洗脫液；所述平衡液的PH值為3. O ；所述樣品溶液的pH值為3. O ；所述洗脫液的pH值為4. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述洗脫液為pH4.0，含有0. 2%甲酸的 30%的乙腈溶液；所述百分濃度為體積百分濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述樣品溶液為含待測(cè)樣品，PH3.0，體積百分濃度為0. 2%的甲酸溶液；所述百分濃度為體積百分濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述平衡液為pH3.0，體積百分濃度為 0. 2%的甲酸溶液；所述百分濃度為體積百分濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種糖肽富集分離材料及其應(yīng)用。該糖肽富集分離材料，為質(zhì)量比為1∶1的石墨碳和活性炭的混合物。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的糖肽富集分離材料對(duì)糖肽有很好的富集效果，富集產(chǎn)物糖肽純度高于90％，回收率高于85％，比較其他比例的石墨碳和活性炭的混合物，本發(fā)明的材料對(duì)糖肽表現(xiàn)出來(lái)的特異性不是二者物理化學(xué)性質(zhì)的簡(jiǎn)單加和作用，而是二者高度協(xié)同作用的結(jié)果。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102268064SQ201010195689
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者張海婧, 李智立, 辛玲 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所