專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬新基因BCL-G_L多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種豬新基因BCL-&多克隆抗體的 制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡(apoptosis)也稱(chēng)為“程序性細(xì)胞死亡”或“細(xì)胞自殺”，近年來(lái)大量的研 究工作揭示細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖和分化具有同樣重要的意義。對(duì)免疫系統(tǒng)而言，細(xì)胞凋亡 不僅是免疫系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)，而且是免疫系統(tǒng)行使功能的一種方式。 越來(lái)越多的研究資料表明，細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、病毒感染細(xì)胞的清除等有密切關(guān)系，因而 對(duì)細(xì)胞凋亡的研究對(duì)腫瘤、病毒病等疾病的治療也有很大意義。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和調(diào)控涉 及到多個(gè)基因家族，其中BCL2基因家族就是一個(gè)與凋亡密切相關(guān)的基因家族，該家族成員 對(duì)細(xì)胞凋亡與否起關(guān)鍵作用，已知BCL-G是近年來(lái)在人類(lèi)、小鼠和牛等物種發(fā)現(xiàn)的BCL2家 族的成員之一，其可變剪接體BCL-Gs和BCL-Q均為促細(xì)胞凋亡因子。而在豬體內(nèi)是否含 有類(lèi)似的基因，還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種豬新基因BCL-Q多克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種豬新基因BCL-G^多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟A1 豬BCL-G^基因 的克??；A2 原核表達(dá)載體pET32a-BCL-GL的構(gòu)建；A3 真核表達(dá)載體PEGFP-BCL_Gl的構(gòu)建； A4 =BCL-G^蛋白的原核表達(dá)；A5 =BCL-G^蛋白的純化和豚鼠抗BCL-G^多克隆抗體的制備。所 述的方法，所述Al具體執(zhí)行以下操作以人BCL-G^基因cDNA序列為種子序列，在GenBank 中對(duì)豬的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)拼接，得到豬的BCL-G^基因的cDNA序列；以所述cDNA 序列為參照，設(shè)計(jì)上游克隆引物Pl :SEQ ID N0:1，下游克隆引物P2 :SEQ IDNO 2 ；取1日齡大約克夏豬脾臟組織，采用TRIzoI法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA ；以所述總cDNA為模板，進(jìn)行PCR，同時(shí)用豬β -actin作為PCR內(nèi)參；擴(kuò) 增得到目的序列；回收所述目的序列，連接到PMD19-T載體得到重組質(zhì)粒PMD19-BCL-Q，轉(zhuǎn) 化到DH5ci感受態(tài)細(xì)胞；通過(guò)藍(lán)白斑篩選，選出陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定后送 測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。所述的制備方法，所述25μ L PCR反應(yīng)體系為Premix Taq酶12. 5 μ L，cDNA 1. 25 μ L，引物 ΡΙΟ. 5 μ L，引物 P20. 5 μ L，ddH20 10. 25 μ L ；所述 PCR 參數(shù)為 95°C 5min，然后 94°C lmin，53°C lmin，72°C 1.5min，共 30 個(gè)循環(huán)，然后 72°C延伸 IOmin0所述的制備方法，所述步驟A2執(zhí)行以下操作根據(jù)所述PMD19-BCL-&載體測(cè)序結(jié) 果，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，上游原核表達(dá)引物P3 =SEQ ID NO :3，下游原核表達(dá)引物P4 =SEQID NO :4 ；以所述總cDNA為模板，用上、下游原核表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列；將所 述目的序列和pET32-a載體進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切3h ；進(jìn)行電泳檢測(cè)和凝膠回收；將回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞； 經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒命名為 pET32a-BCL-GL ；然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定后，由測(cè)序公 司進(jìn)行測(cè)序。所述的制備方法，所述25yLPCR反應(yīng)體系包括Premix Taq酶12. 5 μ L，模板 1. 25μ L，引物 Ρ30. 5μ L，引物 Ρ40. 5μ L，ddH20 10. 25 μ L ；所述 PCR 反應(yīng)參數(shù)為 95°C 5min, 然后 94°C lmin,60°C lmin,72°C 1. 5min，共 30 個(gè)循環(huán)，然后 72°C延伸 lOmin。所述的制備方法，所述步驟A3中真核表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中，上游引物P5 SEQ IDN0:5，下游引物P6 :SEQ ID NO :6 ；所用表達(dá)載體為pEGFP-Cl，重組質(zhì)粒命名為 PEGFP-BCL-Gl ο 所述的制備方法，步驟A4中，所述BCL-q蛋白的原核表達(dá)方法為將轉(zhuǎn)化有重組 表達(dá)質(zhì)粒pET32a-BCL-G[的BL21菌，接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)過(guò)夜；次日，以1 %的接種量接種到5mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大 培養(yǎng)2h后，用終濃度為0. 5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于24°C在180r/min搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)7h ；取 菌液進(jìn)行超聲波裂解，離心后分別取上清和沉淀制備蛋白電泳樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。所述的制備方法，所述步驟A5中BCL-G^蛋白的純化和豚鼠抗BCL-G^多克隆抗 體的制備方法為收集所述誘導(dǎo)后的菌體，用his-標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，經(jīng) SDS-PAGE分析鑒定純度及大小后，-20°C保存?zhèn)溆?；使用時(shí)將所述純化蛋白用生理鹽水稀 釋?zhuān)贿x取雄性豚鼠進(jìn)行多克隆抗體制備。所述的制備方法，所述選用雄性豚鼠制備多克隆抗體的方法為選取質(zhì)量200g左 右的雄性豚鼠6只進(jìn)行多克隆抗體制備；初次免疫前，先各抽取ImL血液，制備血清，-20°C 保存?zhèn)溆茫怀醮蚊庖?，將稀釋的純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮下免 疫200 μ g ；初免后14d進(jìn)行2次免疫，與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮下加 強(qiáng)免疫150 μ g ；23d后進(jìn)行3次免疫，與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮內(nèi) 加強(qiáng)免疫100 μ g ；31d后進(jìn)行4次免疫，每只豚鼠皮內(nèi)加強(qiáng)免疫100 μ g ；4次免疫后6d采 血，制備血清，用雙向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定抗體效價(jià)；40d后5次免疫，每只豚鼠在 大腿外側(cè)肌肉注射100 μ g ；5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL，制備血清，分裝后-20°C保存 備用。本發(fā)明根據(jù)人類(lèi)BCL-&基因序列，克隆、表達(dá)該基因，并制備多克隆抗體，利用該 多克隆抗體能夠檢測(cè)到該目的蛋白的表達(dá)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定位，實(shí)現(xiàn)了在蛋白水平對(duì)該 基因表達(dá)情況的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究揭示該基因在真核細(xì)胞以及動(dòng)物機(jī)體中的功能奠定基 石出。


圖1是BCL-GlcDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，M 2 OOObp marker ； 1 β -actin ；2 :BCL_Gl 基因的 PCR 產(chǎn)物；圖 2 是原核表達(dá)載體 pET32a-BCL-GL 的酶切鑒定，M 15 OOObp DNA marker ；1 pET32a-BCL-GL/BamH I +Hind III ；圖 3 是原核表達(dá)載體 pET32a-BCL"GL 的酶切鑒定，M 15 OOObp DNA marker ；1 pET32a-BCL-GL/BamH I +Hind III ；
圖 4 是真核表達(dá)載體 PEGFP-BCL-Gl 的酶切鑒定，M :15 OOObp DNA marker ； 1 pEGFP-BCL-GL/Hind III +BamH I。圖5是BCL-Gl原核表達(dá)的SDS-PAGE分析，M 蛋白marker ；1 重組載體 pET32a-BCL-GL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體裂解的上清；2 重組載體 pET32a-BCL-GL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體裂解的沉淀；3 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 的重組載體pET32a-BCL-GL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 ；4 空載體pET_32a轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；5 未轉(zhuǎn)化任何載體的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；圖6是用多克隆抗體對(duì)豬EC細(xì)胞中BCL-Gl過(guò)表達(dá)的Western blot檢測(cè)，M 蛋白 marker ； 1 =GFP-BCL-Gl蛋白。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。材料1日齡健康大約克夏豬；TRIzoI試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄 試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；Premix Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶以及T4 DNA連接酶均 購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自Bioteke公司；質(zhì)粒提取試 劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；蛋白純化試劑盒購(gòu)自Promega公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑購(gòu) 自Sigma公司；成年實(shí)驗(yàn)用豚鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠二抗 和ECL發(fā)光液購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；6孔、 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Costar公司；Western blot所用聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride, PVDF)為美國(guó) Millipore 生產(chǎn)；pEGFP-Cl 載體，pET_32a 載體，大腸桿菌 DH5 α， BL21均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC細(xì)胞)為 申請(qǐng)人:構(gòu)建(參考資料，永生化豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征分析[D]； 作者洪海霞；陜西西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，2007)。實(shí)施例1豬BCL-Gl基因的克隆以人BCL-Gl基因cDNA序列(登錄號(hào)NM_138722)為種子序列，在GenBank中對(duì)豬 的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)拼接，得到豬的BCL-Q基因的cDNA序列。以此序列為參照， 設(shè)計(jì)上游克隆引物(SEQ ID NO :1)P1 :5，-TCCTTACTGCCACCTGAC_3，，下游克隆引物(SEQ ID NO :2)P2 5' -ATGCTGCCACATCCTATG-3，。取1日齡大約克夏豬脾臟組織，采用TRIzoI法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn) 錄得到總cDNA。以此為模板，進(jìn)行PCR，同時(shí)用豬β-actin作為PCR內(nèi)參。25yL反應(yīng) 體系包括Premix Taq 酶 12. 5 μ L，cDNA 1. 25 μ L，引物 Pl 0. 5 μ L，引物 Ρ20. 5 μ L，ddH20 10. 25 μ L0 PCR 參數(shù)為 95°C 5min,然后 94°C lmin, 53°C lmin, 72°C 1. 5min,共 30 個(gè)循環(huán)，然 后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增得到目的序列?；厥漳康男蛄?，連接到pMD19_T載體得到重組質(zhì) 粒pMD19-BCL-Gy轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)白斑篩選，選出陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng) 過(guò)雙酶切鑒定后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例2原核表達(dá)載體pET32a-BCL_GL的構(gòu)建根據(jù)PMD19-BCL_Gl載體測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物。上游引物(SEQ ID NO 3) P3 5，-AAGGATCCATGTGCACCACCAGC-3 ’，下游引 物(SEQID NO 4)P4 :5，-CCAAGCTTTCAGTCTACTTCTTCATGGG-3，。以總 cDNA 為模板，用上下 游原核表達(dá)引物進(jìn)行PCR，25y L反應(yīng)體系包括Premix Taq酶12. 5μ L，模板1. 25 μ L， 引物 Ρ30. 5yL，引物 Ρ40. 5yL，ddH20 10. 25 μ L。PCR 參數(shù)為 95°C 5min，然后 94°C lmin, 60 °C lmin, 72 °C 1. 5min，共30個(gè)循環(huán)，然后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增得到目的序列。將目的 序列和pET32-a載體進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切3h。進(jìn)行電泳檢測(cè)和凝膠回收。將 回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng) 藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒命名為 pET32a-BCL-Gp然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定后，由北京奧 科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例3真核表達(dá)載體pEGFP-BCL-G^的構(gòu)建真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法與實(shí)施例2中基本相同，上游引物(SEQ ID NO :5)P5 :5，-CAAAGCTTATATGTGCACCACCAGCACC-3，，下游引物(SEQ ID NO :6)P6 :5，-CCGGATCCTCAGTCTACTTCTTCATGGG-3，；所用表達(dá)載體為 pEGFP-Cl。重組質(zhì) 粒命名為pEGFP-BCL-Gp實(shí)施例4BCL-Gl蛋白的原核表達(dá)將轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a_BCL_GL的BL21菌，接種 到含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日，以1 %的接種量接種到 5mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)2h后，用終濃度為0. 5mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于24°C在180r/min搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)7h。取菌液進(jìn)行超聲波裂解，離心后分別取上 清和沉淀制備蛋白電泳樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。實(shí)施例5BCL-Q蛋白的純化和豚鼠抗BCL-Q多克隆抗體的制備收集誘導(dǎo)后的菌體，用 his-標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定純度及大小后，-20°C保存 備用。使用時(shí)將純化蛋白用生理鹽水稀釋。選取質(zhì)量200g左右的雄性豚鼠6只進(jìn)行多克 隆抗體制備。初次免疫前，先各抽取ImL血液，制備血清，-20°C保存?zhèn)溆?。初次免疫，將?釋的純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮下免疫200 μ g;初免后14d進(jìn) 行2次免疫，與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮下加強(qiáng)免疫150 μ g ；23d后進(jìn) 行3次免疫，與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，每只豚鼠皮內(nèi)加強(qiáng)免疫100 μ g。31d后 進(jìn)行4次免疫，每只豚鼠皮內(nèi)加強(qiáng)免疫100 μ g。4次免疫后6d采血，制備血清，用雙向瓊脂 糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定抗體效價(jià)，基本方法在干凈玻璃板上用18g/L的瓊脂糖制備凝 膠板，厚度約1mm，冷凝后打孔(中心1孔，周?chē)?孔)，孔距為4mm，中心孔加抗原50 μ L，將 抗血清按二倍稀釋法稀釋為1 2-1 64，在周?chē)?孔各加50yL，待孔內(nèi)液體滲入凝膠后 放于濕盒中37°C下孵育24h，觀察有無(wú)沉淀線(xiàn)產(chǎn)生。40d后5次免疫，每只豚鼠在大腿外側(cè) 肌肉注射100 μ g。5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL，制備血清，分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例6豚鼠抗BCL-Q蛋白抗體的特性鑒定(1)抗體效價(jià)測(cè)定雙向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí) 驗(yàn)和間接ELISA法測(cè)定。雙向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例5中相同。間接ELISA基 本方法包被抗原，用包被緩沖液稀釋His-BCL-G^融合蛋白至10mg/L，每孔加0. lmL，4°C過(guò)夜；洗滌，去除包被液，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5min (以下洗滌方法相同，簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌)； 包被一抗，抗血清稀釋度為1 50-1 800，每孔加入0. 2mL，37°C孵育Ih ；洗滌；包被二抗， HRP-羊抗豚鼠IgG，稀釋度為1 2 500，每孔加入0. lmL，37°C孵育Ih ；洗滌；顯色，每孔力口 入0. ImL新配制的TMB底物液，37°C孵育IOmin ；終止反應(yīng)，每孔加入2mol/L的硫酸50 μ L ； 酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光值。(2)抗體特異性鑒定Western blot檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染有 真核重組表達(dá)載體pEGFP-BCL-Q的豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC細(xì)胞)裂解，提取上清；進(jìn) 行SDS-PAGE電泳；將凝聚中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；封閉液封閉；結(jié)合一抗，1 500的豚 鼠抗BCL-G^抗血清，37°C孵育Ih;結(jié)合二抗，1 3 000的羊抗豚鼠的HRP標(biāo)記二抗，37°C 孵育Ih ；ECL發(fā)光液顯色；暗室中進(jìn)行顯影，定影。鑒定結(jié)果 豬BCL-Q基因cDNA的獲得及瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取豬脾臟組織總RNA，以 RT-PCR擴(kuò)增得到的總cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 251bp的BCL-GfDNA序列(如圖 1)。將cDNA序列連接到pMD19-T載體得到重組載體PMD19-BCL_Gl，送北京奧科生物技術(shù)有 限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果的ORF區(qū)域與電子克隆得到的contig序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)相 似度為99%。運(yùn)用NCBI中的BLAST工具將該新基因與其他已知物種的同源基因進(jìn)行比較 發(fā)現(xiàn)，與人類(lèi)、牛類(lèi)和食蟹猴等物種的同源基因相似度分別81%、82%和81%。原核表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定根據(jù)BCL-GfDNA序列測(cè)序結(jié)果，在ORF兩端設(shè)計(jì)一對(duì)帶有BamH I和Hind III酶切 位點(diǎn)的引物，以反轉(zhuǎn)錄總cDNA為模板進(jìn)行PCR得到1 006bp的序列(如圖2)。將PCR所得 序列重組到原核表達(dá)載體pET32-a后，對(duì)重組載體進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切鑒定，質(zhì)粒 條帶和目的基因條帶大小均正確(如圖3)。真核表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定根據(jù)BCL-GlcDNA序列測(cè)序結(jié)果，在ORF兩端設(shè)計(jì)一對(duì)帶有Hind III和BamH I酶切 位點(diǎn)的引物，以反轉(zhuǎn)錄總cDNA為模板進(jìn)行PCR得到1 OOSbp的序列。將PCR所得序列重組 到真核表達(dá)載體pEGFP-Cl，對(duì)重組pEGFP-BCL-Gl載體進(jìn)行Hind III和BamH I雙酶切鑒定， 質(zhì)粒條帶和目的基因條帶大小均正確(如圖4)。IPTG誘導(dǎo)的原核表達(dá)轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)陽(yáng)性克隆在經(jīng)測(cè)序鑒定讀碼框和序列均 正確后，用IPTG誘導(dǎo)陽(yáng)性菌落表達(dá)出His-BCL-G^融合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為 59200 (如圖5箭頭指出)，與預(yù)測(cè)值相符。并且經(jīng)裂解菌體分別制備上清和沉淀電泳檢測(cè) 發(fā)現(xiàn)，上清和沉淀中均有目的蛋白，但沉淀中的量大于上清中的量。另外未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 重組載體轉(zhuǎn)化菌體也有少量目的蛋白表達(dá)，而IPTG誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌體以及未轉(zhuǎn)化任 何載體的空菌體均沒(méi)有目的蛋白表達(dá)。豚鼠抗BCL-Gl多克隆抗體的特性鑒定(1)抗體效價(jià)測(cè)定雙向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散測(cè)定抗體效價(jià)為1 16，ELISA法測(cè)定 效價(jià)為1 800，說(shuō)明該多克隆抗體效價(jià)能夠滿(mǎn)足后續(xù)研究需要。(2)抗體特異性鑒定 在Westernblot檢測(cè)的曝光膠片上，發(fā)現(xiàn)單一目的條帶，并且與Western blot曝光蛋白 Marker比較，大小完全一致，說(shuō)明該多克隆抗體有較高的特異性(如圖6)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)BCL2家族成員研究較多，這是一類(lèi)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因。起初，對(duì)于該家族中的BCL-G基因的研究較少，僅證明它是促細(xì)胞凋亡因子。但是，近幾年 的研究報(bào)道指出，BCL-G基因不僅是定位于12pl2染色體上的腫瘤抑制因子，而且是促凋亡 因子P53新的作用靶點(diǎn)。另外，BCL-Gs蛋白還可以與JABl相互作用，加速線(xiàn)粒體途徑的細(xì) 胞凋亡，BCL-Q與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病關(guān)系密切。這些研究成果都提示我們對(duì)于BCL-G 的功能研究很有必要深入進(jìn)行。根據(jù)生物進(jìn)化論和基因存在論，通過(guò)電子克隆的方法，得到 豬的BCL-Q cDNA序列，從豬的脾臟組織中將其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室克隆，并成功進(jìn)行了原核表達(dá)。 由于該蛋白與其他物種的相似度約為75%，所以認(rèn)為它可能存在與其他物種不同的功能， 為了進(jìn)一步研究其在真核細(xì)胞中以及動(dòng)物體內(nèi)的功能和作用機(jī)制，制備了豚鼠抗豬BCL-& 的多克隆抗血清。并且，經(jīng)Western blot驗(yàn)證其對(duì)真核細(xì)胞中BCL-Gl蛋白的過(guò)表達(dá)檢測(cè) 具有明顯效果。
本發(fā)明中采用具有活性的原核表達(dá)產(chǎn)物BCL-Q去免疫豚鼠制備多克隆抗血清，用 于真核水平的蛋白表達(dá)檢測(cè)時(shí)，具有避免和真核細(xì)胞中的其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的效果， 因此具有較高的特異性。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種豬新基因BCL GL多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A1豬BCL GL基因的克?。籄2原核表達(dá)載體pET32a BCL GL的構(gòu)建；A3真核表達(dá)載體pEGFP BCL CL的構(gòu)建；A4BCL GL蛋白的原核表達(dá)；A5BCL GL蛋白的純化和豚鼠抗BCL GL多克隆抗體的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Al具體執(zhí)行以下操作以人BCL-Q 基因cDNA序列為種子序列，在GenBank中對(duì)豬的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)拼接，得到豬 的BCL-Gl基因的cDNA序列；以所述cDNA序列為參照，設(shè)計(jì)上游克隆引物Pl =SEQ ID NO :1， 下游克隆引物P2 =SEQ ID NO 2 ；取1日齡大約克夏豬脾臟組織，采用TRIzol法提取總RNA， 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA ；以所述總cDNA為模板，進(jìn)行PCR，同時(shí)用豬β -actin 作為PCR內(nèi)參；擴(kuò)增得到目的序列；回收所述目的序列，連接到PMD19-T載體得到重組質(zhì)粒 pMD19-BCL-Gy轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)細(xì)胞；通過(guò)藍(lán)白斑篩選，選出陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò) 雙酶切鑒定后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述25μ L PCR反應(yīng)體系為=Premix Taq 酶 12. 5μ L, cDNA 1. 25 μ L，引物 P10. 5 μ L，引物 P20. 5 μ L，ddH20 10. 25 μ L ；所述 PCR 參 數(shù)為 95°C 5min，然后 94°C lmin，53°C lmin，72°C 1. 5min，共 30 個(gè)循環(huán)，然后 72°C延伸 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟A2執(zhí)行以下操作根據(jù)所 述pMD19-BCL-G[載體測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，上游原核表達(dá)引物P3 =SEQ IDNO :3，下 游原核表達(dá)引物P4 =SEQ ID NO :4 ；以所述總cDNA為模板，用上、下游原核表達(dá)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到目的序列；將所述目的序列和pET32-a載體進(jìn)行BamH I和HindIII雙酶切3h ；進(jìn) 行電泳檢測(cè)和凝膠回收；將回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 DH5a感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和Hind III雙酶切鑒 定，重組質(zhì)粒命名為pET32a-BCL-G[；然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶 切鑒定后，由測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述25μLPCR反應(yīng)體系包括=Premix Taq 酶 12. 5 μ L，模板 1. 25 μ L，引物 Ρ30. 5 μ L，引物 Ρ40. 5 μ L, ddH2010. 25 μ L ；所述 PCR 反 應(yīng)參數(shù)為 95°C 5min，然后 94°C lmin,60°C lmin，72°C 1. 5min，共 30 個(gè)循環(huán)，然后 72°C延 伸 IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A3中真核表達(dá)載體的構(gòu)建 過(guò)程中，上游引物P5 =SEQ ID NO :5，下游引物P6 =SEQ ID NO 6 ；所用表達(dá)載體為pEGFP-Cl， 重組質(zhì)粒命名為pEGFP-BCL-Gl。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟A4中，所述BCL-&蛋白的原核 表達(dá)方法為將轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-BCL-G[的BL21菌，接種到含100mg/L氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；次日，以1 %的接種量接種到5mL含100mg/L氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)2h后，用終濃度為0. 5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于24°C在 180r/min搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)7h ；取菌液進(jìn)行超聲波裂解，離心后分別取上清和沉淀制備蛋白電泳樣 品，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A5中BCL-&蛋白的純化和 豚鼠抗BCL-Q多克隆抗體的制備方法為收集所述誘導(dǎo)后的菌體，用his-標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定純度及大小后，-20°C保存?zhèn)溆?；使用時(shí)將所述純 化蛋白用生理鹽水稀釋?zhuān)贿x取雄性豚鼠進(jìn)行多克隆抗體制備。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述選用雄性豚鼠制備多克隆抗體 的方法為選取質(zhì)量200g左右的雄性豚鼠6只進(jìn)行多克隆抗體制備；初次免疫前，先各抽 取ImL血液，制備血清，-20°C保存?zhèn)溆茫怀醮蚊庖?，將稀釋的純化蛋白與等體積弗氏完全佐 劑充分乳化，每只豚鼠皮下免疫200 μ g ；初免后14d進(jìn)行2次免疫，與等體積弗氏不完全佐 劑充分乳化，每只豚鼠皮下加強(qiáng)免疫150 μ g ;23d后進(jìn)行3次免疫，與等體積的弗氏不完全 佐劑充分乳化，每只豚鼠皮內(nèi)加強(qiáng)免疫100 μ g;31d后進(jìn)行4次免疫，每只豚鼠皮內(nèi)加強(qiáng)免 疫100 μ g ；4次免疫后6d采血，制備血清，用雙向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定抗體效價(jià)； 40d后5次免疫，每只豚鼠在大腿外側(cè)肌肉注射100 μ g ;5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL， 制備血清，分裝后-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬新基因BCL-GL多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟A1豬BCL-GL基因的克??；A2原核表達(dá)載體pET32a-BCL-GL的構(gòu)建；A3真核表達(dá)載體pEGFP-BCL-GL的構(gòu)建；A4BCL-GL蛋白的原核表達(dá)；A5BCL-GL蛋白的純化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗體的制備。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101962644SQ20101019834
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者張德禮, 蔣朋飛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)