專利名稱：一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物化學與分子生物學領域，涉及一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的 方法。
背景技術(shù)：
包涵體粗蛋白是大腸桿菌在高效表達外源基因時形成的由膜包裹的高密度、不溶 性蛋白質(zhì)顆粒。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學活性，因此為了獲得 具有生物學活性的蛋白質(zhì)，應用于生物工程、食品工程等，必須將包涵體溶解，進行分離純 化，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進行蛋白質(zhì)的復性。包涵體的形成為分離純化提供了非常便利 的條件，其純化步驟一般包括裂解細胞及回收包涵體、包涵體粗提取、溶解包涵體及變性蛋 白質(zhì)的純化。在裂解細胞時常由于細胞內(nèi)各種蛋白酶的釋放導致目的蛋白的降解，而降低 目的蛋白的獲取效率；包涵體的粗提取尚無規(guī)范的操作，粗純化效率也很低。而目的蛋白的 獲取更多依賴于最后的純化，由于前期的雜蛋白處理較粗糙，大量的雜蛋白與目的蛋白混 雜，使得目的蛋白的純化難度加大，甚至根本不能得到目標蛋白的純品。本發(fā)明彌補了現(xiàn)有獲取基因重組包涵體粗蛋白存在的提純效率低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有獲取基因重組包涵體粗蛋白存在的提純效率低的問題，而 提供了一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法。本發(fā)明一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，包括以下步驟(1)獲取菌體沉淀將大腸桿菌表達外源基因后的培養(yǎng)液在4°C、6000_10000r/ min條件下離心15-30min，棄上清液，即獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達菌的菌體沉 淀；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 8-12重懸于裂解緩沖液 中，所述裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，IOOmmol/L的NaCl，lmmol/L的乙二胺 四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH值為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，超聲波功率為200-300W， 每次持續(xù)時間為l_5s，兩次超聲間隔時間為l_5s，超聲循環(huán)100-300次，然后以轉(zhuǎn)速為 10000-12000r/min，離心 8-lOmin，獲取沉淀；上述步驟重復1次，獲取沉淀；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 8-12重懸于3-5mol/L的尿素液 中，混懸5-10min，10000-12000r/min條件下離心8-lOmin，獲取沉淀；上述步驟重復2次，獲取沉淀；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 8-12重懸于3-5%的脫氧 膽酸納溶液中，混懸5-10min，7000-9000r/min條件下離心4_8min，獲取沉淀，即獲得包涵 體粗蛋白。本發(fā)明利用基因重組包涵體粗蛋白的抗剪切、屬于變性蛋白的特性，建立一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，使用該方法可大量減少其他非目的蛋白的混雜，包涵體 粗蛋白純度由25%左右升高到80%以上，為進一步目的蛋白的純化奠定基礎；本發(fā)明方法 操作簡便，成本低。


圖1為本發(fā)明一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法的操作流程圖；圖2為Kringle5包涵體粗蛋白(纖溶酶原第五餅環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)域)經(jīng)粗純化后 SDS-PAGE檢測效果圖；圖3為gAd包涵體粗蛋白(脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域)經(jīng)粗純化后SDS-PAGE檢測效果 圖。
具體實施例方式實施例1以pBV220-Kringle5質(zhì)粒載體(pBV220質(zhì)粒載體與纖溶酶原第五餅環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)域基 因體外基因重組獲得)在大腸桿菌JM109中表達后，獲取Kringle5包涵體粗蛋白的粗純化 步驟(1)獲取菌體沉淀大腸桿菌JM109在42°C表達Kringle5后的培養(yǎng)液在4°C、 10000r/min (也可以為6000r/min、8000r/min)條件下離心20min，棄上清獲取菌體沉淀；所得菌體沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第1泳道所示，Kringle5蛋白占菌體 總蛋白的18.6% ；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、 1 12)重懸于裂解緩沖液，裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，功率為 250ff(也可以是200W、300W)，每次持續(xù)時間為3s (也可以是ls、5s)，兩次超聲間隔時間為 3s (也可以是ls、5s)，超聲循環(huán)200次(也可以是100次、300次)，然后以轉(zhuǎn)速為IOOOOr/ min (也可以是 11000r/min、12000r/min)，離心 IOmin (也可以是 8min、9min)，獲取沉淀；上述步驟重復一次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第2泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的24. 3% ；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、1 12)重 懸于4mol/L (也可以是3mol/L、5mol/L)的尿素液中，混懸8min (也可以是5min、IOmin)， 在 12000r/min (也可以是 10000r/min、11000r/min)條件下離心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復2次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第3泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的43. 2% ；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 10(也可以是1 8、 1 12)重懸于3% (也可以是4%、5%)的脫氧膽酸納溶液中，混懸IOmin (也可以是5min、 8min)，8000r/min(也可以是 7000r/min、9000r/min)條件下離心 6min(也可以是 4min、8min)，獲取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第4泳道所示，Kringle5蛋白占菌體總蛋 白的81. 1%。實 施例2以pBV220_gAp質(zhì)粒載體(pBV220質(zhì)粒載體與脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域基因體外基因重 組獲得)在大腸桿菌JM109中獲得表達后，制備脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAp)包涵體粗蛋白的 操作步驟(1)獲取菌體沉淀大腸桿菌JM109在42°C表達pBV220_gAp后的培養(yǎng)液在4°C、 80000r/min (也可以為6000r/min、10000r/min)條件下離心20min，棄上清獲取菌體沉淀；所得菌體沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3的第1泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白 的 15. 3% ；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1 8(也可以是1 10、 1 12)重懸于裂解緩沖液，裂解緩沖液的組分為50mmol/L的TriS-Cl，100mmol/L的 NaCl，lmmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH為8. 0，然后在冰浴上超聲破菌，功率為 200W(也可以是250W、300W)，每次持續(xù)時間為5s (也可以是ls、3s)，兩次超聲間隔時間為 Is (也可以是3s、5s)，超聲循環(huán)100次(也可以是200次、300次)；然后以轉(zhuǎn)速為IlOOOr/ min (也可以是 10000r/min、12000r/min)，離心 9min (也可以是 8min、IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復一次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第2泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 33. 5% ；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1 8(也可以是1 10、1 12)重 懸于5mol/L (也可以是3mol/L、4mol/L)的尿素液中，混懸5min (也可以是8min、IOmin)， 在 11000r/min (也可以是 10000r/min、12000r/min)條件下離心 8min (也可以是 9min、 IOmin)，獲取沉淀；上述步驟重復2次，獲取沉淀；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第3泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 46. 8% ；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1 12也可以是1 8、1 10) 重懸于4% (也可以是3%、5%)的脫氧膽酸納溶液中，混懸8min (也可以是5min、10min)， 9000r/min (也可以是 7000r/min、8000r/min)條件下離心 6min (也可以是 4min、8min)，獲
取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白；所得沉淀SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2的第4泳道所示，gAp蛋白占菌體總蛋白的 95. 2%。
權(quán)利要求
一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，其特征是包括以下步驟(1)獲取菌體沉淀將大腸桿菌表達外源基因后的培養(yǎng)液在4℃、6000-10000r/min條件下離心15-30min，棄上清液，即獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達菌的菌體沉淀；(2)超聲、裂解緩沖液洗滌將菌體沉淀以體積比為1∶8-12重懸于裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液的組分為50mmol/L的Tris-Cl，100mmol/L的NaCl，1mmol/L的乙二胺四乙酸，調(diào)裂解緩沖液的PH值為8.0，然后在冰浴上超聲破菌，超聲波功率為200-300W，每次持續(xù)時間為1-5s，兩次超聲間隔時間為1-5s，超聲循環(huán)100-300次，然后以轉(zhuǎn)速為10000-12000r/min，離心8-10min，獲取沉淀；上述步驟重復1次，獲取沉淀；(3)尿素洗滌將上述所得沉淀以體積比為1∶8-12重懸于3-5mol/L的尿素液中，混懸5-10min，10000-12000r/min條件下離心8-10min，獲取沉淀；上述步驟重復2次，獲取沉淀；(4)脫氧膽酸納洗滌上述獲取的沉淀以體積比為1∶8-12重懸于3-5％的脫氧膽酸納溶液中，混懸5-10min，7000-9000r/min條件下離心4-8min，獲取沉淀，即獲得包涵體粗蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，屬于生物化學與分子生物學領域，是為了解決現(xiàn)有包涵體純化法存在的提純效率低的問題。包括獲取含有基因重組包涵體粗蛋白表達菌的菌體沉淀；超聲、裂解緩沖液洗滌；尿素洗滌；脫氧膽酸納洗滌。本發(fā)明利用基因重組包涵體粗蛋白的抗剪切、屬于變性蛋白的特性，建立一種獲取基因重組包涵體粗蛋白的方法，使用該方法可大量減少其他非目的蛋白的混雜，包涵體粗蛋白純度由25％左右升高到80％以上，為進一步目的蛋白的純化奠定基礎；本發(fā)明方法操作簡便，成本低。
文檔編號C07K1/14GK101880312SQ20101020220
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者張?zhí)旃? 牛勃, 解軍, 趙榮瑞, 陳顯久 申請人:山西醫(yī)科大學