專利名稱：淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淫羊藿苷單克隆抗體，尤其是涉及一種淫羊藿苷單克隆抗體及其 制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淫羊藿是一味常用的補(bǔ)腎壯陽傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究表明， 淫羊藿具有強(qiáng)身健骨、保護(hù)心血管、抗氧化衰老、抗腫瘤等藥理作用。淫羊藿苷(Icariin， ICA)是淫羊藿的主要藥理活性成分，屬于黃酮醇苷類化合物，藥理作用廣泛，是一種很有開 發(fā)前景的新型藥物([10]郭寶林，斐利寬，肖培根.淫羊藿屬植物黃酮類化合物的分類學(xué)意 義再探.植物分類學(xué)報，2008，46 (6) :874-885)。淫羊藿苷也是淫羊藿藥材及含淫羊藿苷 中成藥的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。目前，已有多種檢測方法，但主要是高效液相色譜(HPLC)方 法，并且是中國藥典目前推薦方法。然而HPLC方法也有不利之處，如儀器昂貴，因而投入較 大(動輒數(shù)十萬元人民幣)，樣品預(yù)處理的提取溶液較大，耗時較多，尤其是當(dāng)待測成分的 含量很低且樣品數(shù)很大時。近年來，國內(nèi)外研究者將免疫分析技術(shù)引入到藥用植物活性成分的分析研究中， 并取得了若干成果([21]徐金森MALDI-T0F-MS法測定芍藥苷-人血清白蛋白復(fù)合物的半 抗原數(shù).廈門大學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，45(增刊):54-56)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟1)合成人工抗原ICA-BSA(1)將ICA溶于80% MeOH溶液，將NaIO4溶于50% MeOH溶液，把ICA溶液加入到 NaIO4溶液中，混勻，遮光攪拌；(2)將BSA溶于0. 05mol/L CB緩沖液，然后加入到ICA-NaIO4反應(yīng)溶液中，混勻， 用NaHCO3溶液將pH調(diào)節(jié)至9. 0，遮光攪拌6h ；(3)加入NaBH4,遮光攪拌；(4)將反應(yīng)溶液經(jīng)O.Olmol/L PBS緩沖液透析，再用蒸餾水透析后，凍干，制得合 成產(chǎn)物即為人工抗原ICA-BSA ；2)小鼠免疫初次免疫使用弗氏完全佐劑與免疫人工抗原混合乳化，每只小鼠注射IOOyL,之 后每隔2周繼續(xù)加強(qiáng)免疫小鼠，加強(qiáng)免疫4 5次，待小鼠血清的抗體效價合適，則行脾臟 注射進(jìn)行沖擊免疫方式，且3天后進(jìn)行對小鼠斷頸處死、取脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合操作；3)細(xì)胞融合與雜交瘤篩選使用PEG 1450介導(dǎo)免疫脾細(xì)胞與SP2/0融合，骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的數(shù)目比例為 1 (5 10)，置0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用有限稀釋法篩選、分離目標(biāo)單克隆雜交瘤，通過添加含HAT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，將陽性單克隆孔的雜交瘤依次轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和IOcm培養(yǎng)皿，同時以ELISA方法鑒別、確保擴(kuò)增的雜交瘤能夠持續(xù)分 泌抗體；將陽性孔雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞板培養(yǎng)，使用添加HAT的RPMI 1640完全培 養(yǎng)液，恢復(fù)雜交瘤細(xì)胞的快速增殖能力，挑取陽性孔重復(fù)有限稀釋培養(yǎng)，最終獲得具備穩(wěn)定 增殖能力，大量分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。4)雜交瘤細(xì)胞的量產(chǎn)、純化及其鑒定采用腹水制備的方法，生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和目的抗體，采用6 8周齡 的Bulb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟(0. 5mL/只)后一周注射1. OmL/只雜交瘤細(xì)胞懸 浮液(平均 1. 5xl06cell/mL)；再引頸處死小鼠，收集腹水，離心0. 45 μ m微孔濾膜過濾，并采用Protein G親和 層析柱純化目的抗體，透析、凍干樣品；取凍干抗體樣品和未純化腹水跑SDS-PAGE凝膠電泳，測定純度及分子量，同時也 利用MALDI-T0F-MS法測定單抗的分子量，以互為應(yīng)證；5)單抗的性質(zhì)鑒定對獲得的淫羊藿單抗(ICA-MAb)的性質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)率、敏感度和親和力等的測 定；(1) ICA-MAb的交叉反應(yīng)率采用競爭ELISA法測定單抗的交叉反應(yīng)率，對若干與淫羊藿苷分子結(jié)構(gòu)類似的黃 酮類化合物葛根素(puerarin)，槲皮素(quercetin)，蘆丁(rutin)，大黃酸(rhein)，大豆 苷元(daidzein)，黃芩苷(baicalin)，黃芩素(baicalein)與淫羊藿苷的可能發(fā)生的交叉 反應(yīng)率進(jìn)行了測定并比較；(2) ICA-MAb的抗體敏感度繪制抑制率-ICA標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的ICA 濃度為單抗的靈敏度；(3) ICA-MAb的抗體親和力親和常數(shù)通過間接競爭ELISA法測定。本發(fā)明利用雜交瘤技術(shù)制備淫羊藿苷的單克隆抗體(一種能與淫羊藿苷發(fā)生特 異性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì))，建立淫羊藿苷的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA)，以便對淫羊藿 中藥及其中成藥內(nèi)的淫羊藿苷含量進(jìn)行檢測和評價。研究結(jié)果表明，利用所建立ICA的單 克隆抗體技術(shù)平臺測定淫羊藿中藥的ICA含量具有切實的技術(shù)可行性。此外，淫羊藿苷單 克隆抗體還可以應(yīng)用于淫羊藿苷的親和層析柱分離純化、中藥復(fù)方的藥理研究等方面。本發(fā)明在單克隆抗體基礎(chǔ)上建立ELISA法檢測技術(shù)，測定淫羊藿中藥及其中成藥 中ICA的含量，結(jié)果與HPLC法的結(jié)果高度一致。實驗結(jié)果表明，基于單克隆抗體技術(shù)建立 ICA的免疫分析法具有切實可行性。以制備的ICA單克隆抗體為基礎(chǔ)建立ELISA檢測技術(shù)，測定淫羊藿中藥及其中成 藥的ICA含量，與HPLC檢測結(jié)果基本一致，檢測下限約0. 01 μ g/mL，遠(yuǎn)小于HPLC的檢測下 限lyg/mL。ELISA檢測技術(shù)具有樣品處理簡單，靈敏度高，可同時測定大量樣品的優(yōu)點(diǎn)，在 中藥活性成分檢測方面具備有效的可行性和廣闊的前景。此外，可以將ICA單克隆抗體制備親和層析柱，用于中藥活性成分ICA的分離純化，以及對復(fù)方中藥的藥理進(jìn)行深入研究 等，具有拓展相關(guān)研究和應(yīng)用的重要價值。


圖1為BSA、ICA和ICA-BSA的紫外吸收掃描光譜。在圖1中，橫坐標(biāo)為波長 Wavelength (nm)，縱坐標(biāo)為吸光率 Absorbance ；曲線 I 為 BSA (0. 5mg/mL，0. Olmol/L PBS)； 曲線 II 為 ICA(0. 0625mg/mL, 10% MeOH)；曲線 III 為 ICA-BSA(0. 5mg/mL，0. Olmol/LPBS)。圖2為ICA-BSA的MALDI-TOF-MS掃描圖譜。在圖2中，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(m/Z)，縱 坐標(biāo)為絕對峰強(qiáng)(a. i.) ；ICA-BSA的[M+H]+峰值為75，526. 12。圖3為細(xì)胞融合(400X)。在圖3中，(a)為細(xì)胞融合，(b)為細(xì)胞融合后第4天 (IOOx)，(c)為細(xì)胞融合后第8天(IOOx)。圖4為單克隆雜交瘤生長形態(tài)圖(100X)。圖5為IF8A11E8F11培養(yǎng)液的競爭ELISA曲線。在圖5中，橫坐標(biāo)ICA濃度(μ g/ mL)，縱坐標(biāo)為A450nm。圖6為純化抗體的SDS-PAGE電泳圖。IF8A11E8F111 腹水2 純化抗體； DH10B4F4E93 腹水4 純化抗體。圖7為IF8A11E8F11純化抗體的MALDI-T0F-MS掃描檢測圖譜。在圖7中，橫坐標(biāo) 為質(zhì)荷比(m/z)，縱坐標(biāo)為絕對峰強(qiáng)(a. i.) ； IF8A11E8F11的分子量為14，1967. 72與IgG類 抗體分子量約為HOkDa相符。在20，000 160，OOOkDa的分子量掃描范圍內(nèi)，IgG的峰值 高，峰面積大，而其它雜峰很低，表明IgG的純度高。圖8為IF8A11E8F11抗體的競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖8中，橫坐標(biāo)為ICA濃度 (μ g/mL)，縱坐標(biāo)為 OD 值(A450nm)。圖9為IF8A11E8F11抗體的抑制率-ICA濃度對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖9中，橫坐標(biāo)為 ICA濃度(μ g/mL)，縱坐標(biāo)為競爭抑制率(％ )。圖10為競爭性ELISA法檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖10中，橫坐標(biāo)為ICA濃度(μ g/ mL)，縱坐標(biāo)為OD值(A450nm)。圖11為ICA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。在圖11中，橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)為檢測 峰強(qiáng)度(mAu)；保留時間為8. 412min。圖12為ICA的HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖12中，橫坐標(biāo)為ICA濃度(μ g/mL)，縱 坐標(biāo)為峰面積。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。1)高碘酸鈉法合成人工抗原ICA-BSA及其鑒定(1)將ICA溶于80% MeOH溶液，將NaIO4溶于50% MeOH溶液，把ICA溶液逐滴加 入到NaIO4溶液中，邊加邊混勻，遮光攪拌Ih ；(2)將BSA溶于0. 05mol/L CB緩沖液(ρΗ9· 6)，然后逐滴加入到ICA-NaIO4反應(yīng) 溶液中，邊加邊混勻，用稀NaHCO3溶液將ρΗ調(diào)節(jié)至9. 0，遮光攪拌6h ；(3)加入 NaBH4 (4mg/mL)，4°C遮光攪拌 Ih ；
(4)最后將反應(yīng)溶液經(jīng)0. 01mol/L PBS (pH7. 4)緩沖液透析ld，蒸餾水透析2d，凍 干，制得合成產(chǎn)物即為人工抗原。根據(jù)收集凍干的人工抗原樣品，計算產(chǎn)率為56. 7% ；ICA-OVA產(chǎn)率為59. 3%。將純化后的人工抗原分別配制梯度濃度稀釋液，利用紫外分光光度計掃描檢測 (190nm 310nm)。同時利用MALDI-T0F-MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)法鑒 定人工抗原。測定所獲得的數(shù)據(jù)利用分析軟件GRAMS/386進(jìn)行分析。如圖1所示，人工抗原紫外吸收光譜相對于載體蛋白的吸收光譜，發(fā)生了顯著遷 移改變。BSA 的 Xmax = 280nm, ICA 的 Xmax = 270nm，而人工抗原 ICA-BSA 的 Xmax = 273nm。人工抗原在240 290nm段的吸收曲線高于原載體蛋白的吸收曲線，為偶聯(lián)后的載 體蛋白和ICA的吸收曲線疊加而成，表明人工抗原合成成功。圖 2 給出 ICA-BSA 的 MALDI-TOF-MS 掃描圖譜。ICA-BSA 的[M+H]+ 峰值為 75, 526. 12，而BSA的[M]+峰值為66,334. 19(未展示在此)，ICA的分子量為676.672， ICA-BSA的半抗原數(shù)為(ICA-BSA-BSA)/ICA 14。根據(jù)以往經(jīng)驗，該抗原數(shù)已經(jīng)達(dá)到免疫 小鼠的結(jié)合比要求。采用高碘酸鈉法合成人工抗原ICA-BSA，可參照文獻(xiàn)[23]的方法([23]Erlanger B. F. ,BeiserS. M. Antibodies specific for ribonucIeosides and ribonucleotides and their reaction with DNA. Proc. Natl. AcacL USA，1974，52 :68_74)。采用過碘酸鈉法合成人工抗原ICA-BSA，可參照文獻(xiàn)[24]的方法([24]洪孝莊，孫 曼霽.蛋白質(zhì)連接技術(shù).北京中國醫(yī)藥科技出版社，1993:11-14)。2.小鼠免疫制備雜交瘤的免疫動物為Balb/c小鼠3只，SPF級，雌性，6周齡。初次免疫使用弗氏完全佐劑與免疫人工抗原混合乳化。每只小鼠注射100 μ L。之 后每隔2周繼續(xù)加強(qiáng)免疫小鼠，加強(qiáng)免疫4 5次。待小鼠血清的抗體效價合適，則行脾臟 注射進(jìn)行沖擊免疫方式，且3天后進(jìn)行對小鼠斷頸處死、取脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合操作。3.細(xì)胞融合與雜交瘤篩選使用PEG 1450介導(dǎo)免疫脾細(xì)胞與SP2/0融合，骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的數(shù)目比例 為1 5 10，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如圖3所示。本實驗采用有限稀釋法篩選、分離目標(biāo) 單克隆雜交瘤。通過添加含HAT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液(4mL HAT稀釋溶液20mL FBS 76mL RPMI1640)。將陽性單克隆孔的雜交瘤依次轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 和IOcm培養(yǎng)皿，同時以ELISA方法鑒別、確保擴(kuò)增的雜交瘤能夠持續(xù)分泌抗體。將陽性孔雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞板培養(yǎng)，使用添加HAT的RPMI 1640完全培 養(yǎng)液，恢復(fù)雜交瘤細(xì)胞的快速增殖能力。經(jīng)約20天的檢測培養(yǎng)液，挑取陽性孔重復(fù)有限稀 釋培養(yǎng)。最終獲得具備穩(wěn)定增殖能力，大量分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。圖4給出有 限稀釋培養(yǎng)過程中的單克隆雜交瘤。采用競爭ELISA法檢測培養(yǎng)液中抗體的特異性。選擇到的單克隆細(xì)胞株 IF8A11E8F11培養(yǎng)液的效價達(dá)到16000。將該細(xì)胞株按照24孔板、6孔板及IOcm培養(yǎng)皿的 轉(zhuǎn)移次序逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，用以制備小鼠腹水抗體。圖5給出IF8A11E8F11單克隆細(xì)胞株培 養(yǎng)液競爭ELISA檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)高度相關(guān)性，表明培養(yǎng)液中抗體對ICA具有高度的特 異性結(jié)合能力。
4.雜交瘤細(xì)胞的量產(chǎn)、純化及其鑒定采用腹水制備的方法以大量生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和目的抗體。采用6 8周齡的Bulb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟(0. 5mL/只)后一周注射LOmL/只雜交瘤細(xì) 胞懸浮液(平均1. 5xl06cell/mL)。約經(jīng)7 10天后引頸處死小鼠，收集腹水，離心0. 45 μ m微孔濾膜過濾。并采用 Protein G親和層析柱純化目的抗體，透析、凍干樣品。經(jīng)間接ELISA檢測兩株雜交瘤腹水 效價的結(jié)果，腹水的效價達(dá)到256，000。最終獲得凍干抗體的質(zhì)量為10. 6mg，計算得知相應(yīng) 的腹水抗體含量為2. 12mg/mL。取凍干抗體樣品和未純化腹水跑SDS-PAGE凝膠電泳，測定純度及分子量。同時也 利用MALDI-T0F-MS法測定單抗的分子量，以互為應(yīng)證。圖6給出源于IF8A11E8F11和另一株雜交瘤細(xì)胞DH10B4F4E9的純化抗體的 SDS-PAGE電泳圖。電泳過程中，抗體變性，二硫鍵打開，重鏈和輕鏈分離，所以電泳時出現(xiàn) 兩條遷移條帶。電泳結(jié)果顯示純化抗體的重鏈約為50kDa，輕鏈約為25kDa，兩者之和約為 75kDa，而抗體的重鏈和輕鏈數(shù)均為2，所計算出的抗體分子量約150kDa。電泳無其它雜帶 顯示，表明純化的抗體純度高。圖7給出IF8A11E8F11純化抗體的MALDI-T0F-MS掃描檢測圖譜。IF8A11E8F11的 分子量為14，1967. 72與IgG類抗體分子量約為140kDa相符。在20，000 160，OOOkDa的 分子量掃描范圍內(nèi)，IgG的峰值高，峰面積大，而其它雜峰很低，表明IgG的純度高。5.單抗的性質(zhì)鑒定對于獲得的淫羊藿單抗(ICA-MAb)的性質(zhì)進(jìn)行了交叉反應(yīng)率、敏感度和親和力等 的測定。(1) ICA-MAb的交叉反應(yīng)率采用競爭ELISA法測定單抗的交叉反應(yīng)率。對若干與淫羊藿苷分子結(jié)構(gòu)類似的黃 酮類化合物葛根素(puerarin)，槲皮素(quercetin)，蘆丁(rutin)，大黃酸(rhein)，大豆 苷元(daidzein)，黃芩苷(baicalin)，黃芩素(baicalein)與淫羊藿苷的可能發(fā)生的交叉 反應(yīng)率進(jìn)行了測定并比較。其競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。交叉反應(yīng)率公式為交叉 反應(yīng)率(％ ) = (ICA標(biāo)準(zhǔn)品IC5tl/類似物IC5tl) X 100%。交叉實驗結(jié)果顯示，ICA-MAb與各 種淫羊藿苷分子結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率非常低，均小于0. 1%，這表明所制備的ICA-MAb 對ICA結(jié)合的具有高度專一性。(2) ICA-MAb的抗體敏感度抗體的敏感度是指半抗原標(biāo)準(zhǔn)品與包被抗原競爭抗體的能力，當(dāng)抑制率達(dá)到50% 時所對應(yīng)的半抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度稱為抗體的敏感度。繪制抑制率-ICA標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)的標(biāo) 準(zhǔn)曲線，以抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的ICA濃度為單抗的靈敏度。競爭抑制率=[(陽性對 照孔A450nm值-阻斷孔的A450nm值)/陽性對照孔A450nm值]X 100%。ICA-MAb抗體的檢測結(jié)果如圖9所示。ICA-MAb抗體的抑制率-ICA濃度對數(shù)的回 歸方程為y = 92. 39914+17. 468604X lnx，相關(guān)系數(shù)r = 0. 992，顯示兩者呈高度相關(guān)。抑 制率達(dá)到50%時對應(yīng)的ICA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0. 088 μ g/mL。(3) ICA-MAb的抗體親和力親和力反映抗體與抗原的結(jié)合能力以親和常數(shù)來衡量。親和常數(shù)通過間接競爭ELISA法測定。將一系列倍比稀釋的ICA和一定濃度的MAb分別加入到已包被、封閉好酶 標(biāo)板中進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)，按照公式KJ (A0-A) = l+K/a0計算MAb的親和常數(shù)，并取其平 均值。其中A0為無競爭抗原時的OD值，A為不同濃度競爭抗原時的OD值，a0為抗原總量， K為親和常數(shù)。親和常數(shù)為10_12 10_7(mol/L)時，屬于高親和力抗體；親和常數(shù)為10_7 10-5(mol/L)時，屬于低親和力抗體。一般情況下，親和力愈高，靈敏度愈高，檢出下限越低， 越適于免疫測定。根據(jù)競爭ELISA法的檢測數(shù)值，依照上述公式計算ICA-MAb抗體的親和常數(shù)K， 結(jié)果如表1所示。將各組親和常數(shù)取平均值，計算得，IF8A11E8F11抗體的親和常數(shù)為 9. 81Xl(T9mol/L。表1雜交瘤細(xì)胞株IF8A11E8F11抗體親和力 以下給出中藥及中成藥中ICA含量的ELISA法測定。1)樣品的預(yù)處理將淫羊藿中藥和含淫羊藿的若干市售中成藥的藥片、藥丸及膠囊(去糖衣)研磨 成粉碎，置烘箱中90°C烘烤60min。各樣品分別稱取lg，置于50mL容量瓶中，加入70%甲 醇，超聲提取40min，冷卻后定容至50mL，搖勻，經(jīng)0. 22 μ m有機(jī)濾膜過濾待用。口服液則直 接以.22 μ m有機(jī)濾膜過濾。2) ELISA法測定中藥及中成藥中ICA的含量將各待檢測母液用10%甲醇稀釋一系列的濃度梯度，采用競爭ELISA法檢測，建 立相關(guān)回歸方程，計算其中的ICA含量，進(jìn)而得出淫羊藿中藥及其中成藥中ICA的含量。(1)競爭ELISA法檢測ICA的含量應(yīng)用來自IF8A11E8F11細(xì)胞株的ICA-MAb抗體，對淫羊藿中藥及其中成藥的樣品 進(jìn)行競爭ELISA法檢測，繪制A45tlnm-標(biāo)準(zhǔn)物濃度對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖10所示，其回歸方程 為y = -0. 19986-0. 20292X lnx，相關(guān)系數(shù)r = 0. 992。通過測定適當(dāng)稀釋的中藥樣品的競 爭A45tlnm值，依據(jù)線性方程計算出相應(yīng)的ICA含量，結(jié)果見表2。表2競爭ELISA法與HPLC法檢測ICA含量的結(jié)果 (2) HPLC法測定中藥及中成藥中ICA的含量HPLC法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥及中成藥的成分檢測和質(zhì)量控制，是我國藥典規(guī)定 或推薦的大多數(shù)藥物檢測分析所采用的技術(shù)方法，其結(jié)果為官方藥監(jiān)部門和研究者所公 認(rèn)。為驗證本ELISA法測定結(jié)果的可靠性，同時對樣品進(jìn)行了 HPLC分析。色譜條件如下 Agilent 1100型高效液相色譜儀，Hypersil ODS (C18)反相色譜柱(4X 125mm，5 μ m)，柱溫 25°C，流動相為乙腈0. 2%冰乙酸(30% 70%)，流速l.OmL/min，檢測波長為276nm，參 比波長為360nm。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ L進(jìn)樣檢測。供試品溶液的制備各待測母液用已過膜的色譜級甲醇作倍比稀釋一系列濃度梯 度。將對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣檢測，根據(jù)對照品溶液系列的測定結(jié)果，以對照 品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程，計算淫羊藿中藥及各中成藥 中的ICA含量。將ICA標(biāo)準(zhǔn)品作一系列濃度稀釋，有5 μ g/mLUO μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/ mL、60y g/mL、80y g/mL和100 μ g/mL，進(jìn)樣20 μ L檢測，平行進(jìn)樣3次。圖11所示為40 μ g/ mL ICA的檢測峰圖譜，保留時間為8. 412min。以峰面積-ICA標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其 回歸方程為=Y = 23. 46523X-12. 44500，相關(guān)系數(shù)r = 0.99990，如圖12所示。檢測淫羊藿 及其中成藥樣品的出峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中ICA的含量，檢測結(jié)果見表2所示。(3)競爭ELISA法與HPLC法檢測結(jié)果的比較表2檢測結(jié)果的比較表明，競爭ELISA法與HPLC法檢測計算出的ICA含量基本一 致，建立ICA的ELISA檢測方法具備可行性。其中淫羊藿提取液中ICA的含量檢測結(jié)果分 別為295. 48 μ g/mL和291. 52μ g/mL，而依據(jù)Ig中藥樣品以50mL甲醇提取，計算出淫羊藿 中的ICA含量分別為1.48%和1.46%，符合國家藥典規(guī)定的ICA含量不得低于0. 50%的 要求。從表中結(jié)果可見，除了成藥“補(bǔ)腎強(qiáng)身片”的測定結(jié)果大于13%外，其余的誤差率均 在3%或以下。兩者保持了相當(dāng)大的一致性。ELISA法的檢測結(jié)果高于HPLC法的檢測結(jié) 果，原因可能與檢測樣品中存在其它的淫羊藿黃酮類物質(zhì)的交叉反應(yīng)有關(guān)。對ICA標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行HPLC法檢測，當(dāng)ICA濃度為5 μ g/mL時，峰高只有3. 22mAU,峰面積為107. 99mAU · s。 HPLC法的實際檢測下限約為1 μ g/mL,而ELISA法的實際檢測范圍為0. 01 1 μ g/mL,比 HPLC法更靈敏。此外，ELISA法具有樣品處理簡單、不需要微孔過濾、可同時檢測大量樣品、 操作簡便省時等的優(yōu)點(diǎn)。但是ELISA法也存在不足之處，一次只能檢測一種抗原物質(zhì)，不能像HPLC法可以同時檢測多種成分；ELISA法檢測易受各種操作條件影響，如人工抗原包被 濃度、HRP標(biāo)記二抗的濃度、排槍的精確度、顯色液底物的質(zhì)量等，檢測結(jié)果不如HPLC法穩(wěn) 定。在獲得高特異性單克隆抗體的前提條件下，經(jīng)多次檢測試驗，ELISA法仍然是一種操作 簡便、省時高效、準(zhǔn)確可靠的檢測方法，適合于待測成分含量低的樣品，或者大批量樣品的 快速檢測篩選，具有顯著的優(yōu)越性和可行性。
權(quán)利要求
淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)合成人工抗原ICA-BSA(1)將ICA溶于80％MeOH溶液，將NaIO4溶于50％MeOH溶液，把ICA溶液加入到NaIO4溶液中，混勻，遮光攪拌；(2)將BSA溶于0.05mol/L CB緩沖液，然后加入到ICA-NaIO4反應(yīng)溶液中，混勻，用NaHCO3溶液將pH調(diào)節(jié)至9.0，遮光攪拌6h；(3)加入NaBH4，遮光攪拌；(4)將反應(yīng)溶液經(jīng)0.01mol/L PBS緩沖液透析，再用蒸餾水透析后，凍干，制得合成產(chǎn)物即為人工抗原ICA-BSA；2)小鼠免疫初次免疫使用弗氏完全佐劑與免疫人工抗原混合乳化，每只小鼠注射100μL，之后每隔2周繼續(xù)加強(qiáng)免疫小鼠，加強(qiáng)免疫4～5次，待小鼠血清的抗體效價合適，則行脾臟注射進(jìn)行沖擊免疫方式，且3天后進(jìn)行對小鼠斷頸處死、取脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合操作；3)細(xì)胞融合與雜交瘤篩選使用PEG 1450介導(dǎo)免疫脾細(xì)胞與SP2/0融合，骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的數(shù)目比例為1∶(5～10)，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用有限稀釋法篩選、分離目標(biāo)單克隆雜交瘤，通過添加含HAT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，將陽性單克隆孔的雜交瘤依次轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和10cm培養(yǎng)皿，同時以ELISA方法鑒別、確保擴(kuò)增的雜交瘤能夠持續(xù)分泌抗體；將陽性孔雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞板培養(yǎng)，使用添加HAT的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，恢復(fù)雜交瘤細(xì)胞的快速增殖能力，挑取陽性孔重復(fù)有限稀釋培養(yǎng)，最終獲得具備穩(wěn)定增殖能力，大量分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株；4)雜交瘤細(xì)胞的量產(chǎn)、純化及其鑒定采用腹水制備的方法，生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和目的抗體，采用6～8周齡的Bulb/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟后一周注射1.0mL/只雜交瘤細(xì)胞懸浮液；再引頸處死小鼠，收集腹水，離心0.45μm微孔濾膜過濾，并采用Protein G親和層析柱純化目的抗體，透析、凍干樣品；取凍干抗體樣品和未純化腹水跑SDS-PAGE凝膠電泳，測定純度及分子量，同時也利用MALDI-TOF-MS法測定單抗的分子量，以互為應(yīng)證；5)單抗的性質(zhì)鑒定對獲得的淫羊藿單抗的性質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)率、敏感度和親和力等的測定；(1)ICA-MAb的交叉反應(yīng)率采用競爭ELISA法測定單抗的交叉反應(yīng)率，對若干與淫羊藿苷分子結(jié)構(gòu)類似的黃酮類化合物葛根素，槲皮素，蘆丁，大黃酸，大豆苷元，黃芩苷，黃芩素與淫羊藿苷的可能發(fā)生的交叉反應(yīng)率進(jìn)行了測定并比較；(2)ICA-MAb的抗體敏感度繪制抑制率-ICA標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抑制率達(dá)到50％時所對應(yīng)的ICA濃度為單抗的靈敏度；(3)ICA-MAb的抗體親和力親和常數(shù)通過間接競爭ELISA法測定。
2.如權(quán)利要求1所述的淫羊藿苷單克隆抗體的制備方法制備的淫羊藿苷單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的淫羊藿苷單克隆抗體在對淫羊藿中藥及其中成藥內(nèi)的淫羊藿 苷含量進(jìn)行檢測和評價中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的淫羊藿苷單克隆抗體在淫羊藿苷的親和層析柱分離純化、中藥 復(fù)方中的應(yīng)用。
全文摘要
淫羊藿苷單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種淫羊藿苷單克隆抗體。合成人工抗原ICA-BSA；小鼠免疫；細(xì)胞融合與雜交瘤篩選；雜交瘤細(xì)胞的量產(chǎn)、純化及其鑒定；單抗的性質(zhì)鑒定。利用雜交瘤技術(shù)制備淫羊藿苷的單克隆抗體，建立淫羊藿苷的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)，以便對淫羊藿中藥及其中成藥內(nèi)的淫羊藿苷含量進(jìn)行檢測和評價。研究結(jié)果表明，利用所建立ICA的單克隆抗體技術(shù)平臺測定淫羊藿中藥的ICA含量具有切實的技術(shù)可行性。此外，淫羊藿苷單克隆抗體還可以應(yīng)用于淫羊藿苷的親和層析柱分離純化、中藥復(fù)方的藥理研究等方面。
文檔編號C07H1/08GK101885773SQ20101020254
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者徐金森, 許方美 申請人:廈門大學(xué)