專利名稱：一種丹參花中三萜類化合物及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種丹參花中三萜類化合物及其提取方 法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丹參為多年生直立草本植物，其干燥根及根莖，也就是我們常說(shuō)的中藥“丹參”，是 一種主治心血管系統(tǒng)疾病的常用中藥。研究表明，中藥丹參主要有兩類活性成分一種為脂 溶性的二萜類化合物，另一種為水溶性的多聚酚酸類成分。丹參花為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的花。丹參為 無(wú)限性開花植物，一年生即可開花。丹參一般四月份開花，持續(xù)到10月下旬植株幾近枯萎 時(shí)。丹參植株地上部分生長(zhǎng)旺盛，分枝較多，持續(xù)開花，為無(wú)限花序，花序軸一般為腋生，從 地上部分生長(zhǎng)觀察來(lái)看，地上莖分枝越多，腋生花序相應(yīng)的也較多，特別是在7-8月份地上 生長(zhǎng)旺盛時(shí)期。丹參花中三萜類化合物的發(fā)現(xiàn)以及提取一直是研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種丹參花中三萜類化合物，所述的三萜類化合物具有一 定細(xì)胞毒作用，具有較強(qiáng)抗腫瘤作用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種丹參花中三萜類化合物，所述的三萜類化合物分子式為C3tlH5tlO2,結(jié)構(gòu)式為I 或II所示 兩個(gè)新化合物的名稱分別為:01ean-12-ene-3a，23-diol (SMBF-1)(式I化合 物)，中文名丹參二醇A ；Urs-12-ene-3 α，23-diol (SMBF-2)，中文名丹參二醇B (式II化合 物)，分子量都是442。新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是通過(guò)各種有機(jī)波譜分析(1H NMR 13C NMR DEPT2D-NMR1H-1H COSY, HSQC，HMBC, N0ESY)以及與類似化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較而獲得其未知化合物的結(jié) 構(gòu)。
化合物SMBF-I的波譜數(shù)據(jù)如下白色粉末·[ ]25 = +8.6 (C 0.74, MeOH). IR(KBr) =3404,2930,1635，1459， 1384，1258，1045. 1H-Wr(CdcI3JOOMHz) δ 5. 21 (1Η, t，3. 5，H-12)，3. 72 (1H，brs, H_3)， 3. 44,3. 58 (each 1H, d, 11. 3，H—23)，0· 72,0. 84,0. 87,0. 88,0. 98,0. 99，1. 17 (each 3H, s，)· 13C-WR(CDCl3,125MHz) : δ (Cl 30) :32· 8,26. 3,76. 6,40. 2,42. 7，18. 0,32. 2,40. 0， 47. 5,36. 7,23. 5，121. 6，145. 3,41. 8,27. 0,26. 1,32. 5,47. 3,46. 8,31. 1,34. 8,37. 2,71. 4， 17. 9，16. 8，15. 6,26. 2,28. 4,33. 3,23. 7。HR-ESI—MS :442· 3802 ([M+Na]+，C30H50O2Na+ ； calc. 442. 3788)?；衔颯MBF-2的波譜數(shù)據(jù)如下白色粉末.[α]25= +10.1 (C 0.67, MeOH). IR(KBr) =3406,2931,1640, 1461，1384，1258，1040. 1H-Wr(CdcI3JOOMHz) δ 5. 16 (1Η, t，3. 6，H-12) ,3. 72 (1H，brs, H-3)，3· 44,3. 58 (each 1H, d，11. 3，H-23)，0. 72,0. 81 (3H, d，6. 5) ,0. 83，0. 93 (3H, d, 6. 4)，0. 97，0. 98，1. 13 (each 3H, s). 13C-NMR (CDCl3,125MHz) δ (Cl 30) 32. 4,26. 4, 76. 7,40. 2,42. 7，18. 1,33. 1,40. 2,47. 5,36. 7,23. 3，124. 3，139. 7,42. 2,28. 1,26. 6,33. 8， 59. 1,39. 6,39. 6,31. 3,41. 6,71. 4，18. 0，16. 9，15. 8,23. 4,28. 8，17. 5,21. 4。 HR-ESI-MS 442. 3784 ([M+Na]+，C30H50O2Na+ ；calc. 442. 3788)?；衔颯MBF-I和SMBF-2的晶體數(shù)據(jù) 從丹參花中提取的三萜類化合物，除了上述兩個(gè)新的化合物外，還有6個(gè)已知的 化合物，這六個(gè)已知的化合物分別為齊墩果酸(oleanolic acid，記作SMBF-3)，C30H48O3 ； 熊果酸(ursolic acid,記作 SMBF-4)，C30H48O6 ；2α-羥基烏蘇酸(corosolic acid,記作 SMBF-5)，C30H48O4 ；2 α-羥基齊敦果酸(2 α -ursolic acid,記作 SMBF-6)，C30H48O4 ；3 β， 23- 二羥基-12-烯-28-齊墩果酸(hederagenin,記作 SMBF-7)，C30H48O4 ；2 α，3 β，23-三羥 基-12-烯-28-齊墩果酸(arjunolic acid,記作SMBF-8)，C30H48O50它們的結(jié)構(gòu)式如下 本發(fā)明還提供了一種所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，包括下列步驟1)將丹參花用體積濃度為60-95%的乙醇水溶液回流提取，減壓濃縮得到浸膏狀 物；2)將浸膏狀物與蒸餾水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚層減壓 濃縮得石油醚提取物；水層用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物；3)石油醚提取物用硅膠柱層析分離，先以石油醚-乙酸乙酯溶劑進(jìn)行梯度洗脫， 石油醚與乙酸乙酯的體積比從8 1逐漸遞減至1 1;之后以乙酸乙酯-甲醇溶液進(jìn)行 梯度洗脫，乙酸乙酯與甲醇的體積比從100%乙酸乙酯、19 1逐漸遞減到100%甲醇；對(duì) 上述柱層析餾分純化分離得三萜類化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4。較為具體的，步驟1)中丹參花先用重量為其8-10倍的60-95%的乙醇水溶液回流 提取3-5小時(shí)，過(guò)濾后濾渣用重量為丹參花6-8倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取兩次， 每次提取3-5小時(shí)，合并三次提取液減壓濃縮得到浸膏狀物。步驟2)中分液后，水層再用石油醚萃取1-2次，萃取液與石油醚層合并后再減壓 濃縮。步驟3)中石油醚與乙酸乙酯的體積比的遞減按照8 1、6 1、5 1、4 1、 3 1、2 1、1 1進(jìn)行，每個(gè)梯度的洗脫體積為1.5BV;乙酸乙酯與甲醇的體積比的遞減按 照100%乙酸乙酯、19 UlO 1、5 1、100%甲醇進(jìn)行，每個(gè)梯度的洗脫體積為1.5BV。具體的，所述的分離純化為部分餾分采用凝膠柱層析脫色，用氯仿_甲醇體積比 為2-3 1的溶劑進(jìn)行重結(jié)晶得到式I、II化合物，凝膠柱可選擇TOyOpearlHW-40C ；后續(xù) 重結(jié)晶采用乙酸乙酯-石油醚溶劑。部分餾分采用硅膠柱層析、凝膠柱層析、高效液相色譜 分離得到化合物SMBF-3、SMBF-4。所述的分離純化并不僅限于上述方法，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)手 段即可，是本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)，此次不再贅述?；衔颯MBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 提取步驟如下將步驟2)中的乙酸乙酯提取物用硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯溶劑進(jìn) 行洗脫，石油醚與乙酸乙酯的體積比從4 1逐漸遞減至1 4;之后以乙酸乙酯-甲醇溶 劑進(jìn)行洗脫，乙酸乙酯與甲醇的體積比從100%乙酸乙酯、10 1逐漸遞減到100%甲醇； 然后薄層色譜分析合并相似餾分，對(duì)餾分進(jìn)行分離純化獲得三萜類化合物SMBF-5、SMBF-6、 SMBF-7、SMBF-8。具體的，石油醚-乙酸乙酯溶劑按照4 1、3 1、2 1、1 1、1 2、1 3、
61 4的梯度遞減，每個(gè)梯度的洗脫體積為1.5BV;乙酸乙酯-甲醇溶劑按照100%乙酸乙 酯、10 1、5 1、3 1、100%甲醇進(jìn)行梯度遞減，每個(gè)梯度的洗脫體積為1.5BV。所述的丹參花中三萜類化合物具有一定的細(xì)胞毒活性，在制備抗腫瘤藥物中有很 好的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，有以下優(yōu)點(diǎn)從丹參花中提取分離得到新的三萜類化合物，并經(jīng)藥理試驗(yàn)證明這些三萜類化合 物具有一定的細(xì)胞毒作用可以抑制腫瘤細(xì)胞，其制備過(guò)程快速、簡(jiǎn)便。
具體實(shí)施例方式原料丹參花2Kg，于2007年4月采自河南省欒川縣豫西丹參GAP種植基地，由洛陽(yáng) 梓生科技開發(fā)有限公司王忠東教授鑒定。實(shí)施例1丹參花2Kg用18Kg體積濃度為95%的乙醇在50°C回流提取4小時(shí)，過(guò)濾，再用 15Kg的95%乙醇回流提取兩次，每次4小時(shí)，合并濾液，減壓濃縮得到浸膏狀物300g，將浸 膏狀物加水3L和石油醚2. 5L混旋，分離石油醚層，水層再用石油醚萃取4次，每次2L，合 并石油醚萃取液，濃縮至浸膏狀得石油醚萃取物58g ；采用同樣的方法，水層用乙酸乙酯萃 取，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物75g。1、將上述石油醚層萃取物50g用硅膠柱層析分離(IOOOg硅膠，層析柱 50X 1200mm)，以石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)(8 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1， 1 1)，然后用乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)(100%乙酸乙酯，19 1,10 1,5 1，100%甲醇) 各1500mL進(jìn)行梯度洗脫，得餾分20個(gè)(以SMBO101-SMB0120命名)。餾分SMB0106(2. 3g)采用凝膠柱色譜(HW-40C)層析，洗脫劑氯仿甲醇=2 1， 得5個(gè)組分(SMB0301-0305)，組分SMB0304經(jīng)乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得單體化合物 SMBF-I 和化合物 SMBF-2。餾分SMB0110(5. Ig)采用硅膠柱層析(硅膠700g，洗脫劑氯仿/甲醇= 99 19,7 3,95 5,9 1,8 2)進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)合并類似餾分，得10組分 (SMB0401-0410)。將餾分SMB0406(1. Ig)經(jīng)凝膠柱色譜層析(HW-40C，洗脫劑氯仿甲醇 =2 1，)分離，得5個(gè)組分(SMB0501-0505)，組分SMB0503經(jīng)反相高效液相色譜分離得 單體化合物SMBF-3和SMBF-4。乙酸乙酯萃取物(70g)用硅膠柱層析分離(1300g硅膠，層析柱50X 1200mm)，以 石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)(4 1,3 1,2 1,1 1,1 2,1 3,1 4)，然后用乙酸 乙酯-甲醇系統(tǒng)(100%乙酸乙酯，10 1,5 1,3 1，100%甲醇)各2000mL進(jìn)行梯度洗 脫，薄層色譜分析合并相似餾分，得餾分22個(gè)(以SMB1001-SMB1022命名)。餾分SMB1010 (8. 8g)經(jīng)硅膠柱層析(硅膠lOOOg，洗脫劑氯仿/甲醇= 95 5,9 1,8 2,7 3)進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)合并類似餾分，得12個(gè)組分 (SMB1301-SMB1312)，組分SMB1305采用凝膠柱色譜(HW-40C)層析，洗脫劑氯仿甲醇 =2 1，得5個(gè)組分(SMB1401-1405)，組分SMB1403經(jīng)反相高效液相色譜(0DS-A色譜 柱20\250讓，5 4!11，流動(dòng)相甲醇/水=8 2)，分離得單體化合物SMBF-5、SMBF-6和 SMBF-7。
餾分SMB1014(5. 7g)經(jīng)硅膠柱層析(硅膠700g，洗脫劑氯仿/甲醇=95 5， 9 1,8 2,7 3,6 4)進(jìn)行洗脫，薄層層析檢測(cè)合并類似餾分，得15個(gè)組分 (SMB1601-SMB1615)，組分SMB1607采用凝膠柱色譜(HW-40C，洗脫劑氯仿/甲醇=2 1) 層析，得6個(gè)組分(SMB1701-1706)，組分SMB1704經(jīng)反相高效液相色譜(0DS-A色譜柱 20 X 250mm, 5 μ m,流動(dòng)相甲醇/水=8 2)，分離得單體化合物SMBF-8。上述分離得到的化合物的細(xì)胞毒活性采用MTT法測(cè)試，試驗(yàn)具體操作步驟如下1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液 5 X IO4個(gè)/mL，將該懸液加到96孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 X IO4個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，加入受 試藥物，化學(xué)單體濃度分別為30 μ g/mL、10 μ g/mL。2.將平板在37°C，含5% CO2空氣及100%濕度的溫箱中孵育3天，去除培養(yǎng)液。3. MTT用無(wú)血清的RPM1640培養(yǎng)液配成lmg/mL溶液，每孔加100 μ L，37°C溫育4h， 使MTT還原為甲臢。4.吸出上層清液，加入150 μ L DMSO使甲臢溶解，于ELISA儀570nm處測(cè)OD值。表4分離化合物細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(η = 6) 以上只是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本發(fā)明保護(hù)范圍不限于此，凡是不違背本發(fā) 明的原理、精神……都在本發(fā)明的保護(hù)之列。
權(quán)利要求
一種丹參花中三萜類化合物，其特征在于，所述的三萜類化合物分子式為C30H50O2，結(jié)構(gòu)式為I或II所示FSA00000190604900011.tif
2.丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，包括下列步驟1)將丹參花用體積濃度為60-95%的乙醇水溶液回流提取，減壓濃縮得到浸膏狀物；2)將浸膏狀物與蒸餾水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚層減壓濃縮 得石油醚提取物；水層用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物；3)石油醚提取物用硅膠柱層析分離，先以石油醚-乙酸乙酯溶劑進(jìn)行梯度洗脫，石油 醚與乙酸乙酯的體積比從8 1逐漸遞減至1 1;之后以乙酸乙酯-甲醇溶液進(jìn)行梯度 洗脫，乙酸乙酯與甲醇的體積比從100%乙酸乙酯、19 1逐漸遞減到100%甲醇；對(duì)上述 柱層析餾分純化分離得三萜類化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4 ；所述的SMBF-3、
3.如權(quán)利要求2所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，步驟1)中丹 參花先用重量為其8-10倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取3-5小時(shí)，過(guò)濾后濾渣用重量 為丹參花6-8倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取兩次，每次提取3-5小時(shí)，合并三次提取 液減壓濃縮得到浸膏狀物。
4.如權(quán)利要求2所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，步驟2)中分 液后，水層再用石油醚萃取1-2次，萃取液與石油醚層合并后再減壓濃縮。
5.如權(quán)利要求2所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，步驟3)中石 油醚與乙酸乙酯的體積比的遞減按照8 1、6 1、5 1、4 1、3 1、2 1、1 1進(jìn)行，每個(gè)梯度的洗脫體積為1. 5BV。
6.如權(quán)利要求2所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，步驟3)中乙 酸乙酯與甲醇的體積比的遞減按照100%乙酸乙酯、19 UlO 1、5 1、100%甲醇進(jìn)行， 每個(gè)梯度的洗脫體積為1. 5BV。
7.如權(quán)利要求2-6之一所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，分離 純化為采用凝膠柱層析，然后用乙酸乙酯_石油醚溶劑重結(jié)晶。
8.如權(quán)利要求2-6之一所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，將步 驟2)中的乙酸乙酯提取物用硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯溶劑進(jìn)行洗脫，石油醚 與乙酸乙酯的體積比從4 1逐漸遞減至1 4;之后以乙酸乙酯-甲醇溶劑進(jìn)行洗脫，乙 酸乙酯與甲醇的體積比從100%乙酸乙酯、10 1逐漸遞減到100%甲醇；然后薄層色譜分 析合并相似餾分，對(duì)餾分進(jìn)行分離純化獲得三萜類化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 ； 所述的 SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 如式 III 中所示。
9.如權(quán)利要求8所述的丹參花中三萜類化合物的提取方法，其特征在于，石油醚-乙酸 乙酯溶劑按照4 1、3 1、2 1、1 1、1 2、1 3、1 4的梯度遞減，每個(gè)梯度的洗 脫體積為1.5BV;乙酸乙酯-甲醇溶劑按照100%乙酸乙酯、10 1、5 1、3 1、100%甲 醇進(jìn)行梯度遞減，每個(gè)梯度的洗脫體積為1. 5BV。
10.丹參花中三萜類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要
一種丹參花中三萜類化合物，所述的三萜類化合物分子式為C30H50O2，結(jié)構(gòu)式為I或II所示；從丹參花中提取分離得到的三萜類化合物，經(jīng)藥理試驗(yàn)證明具有一定的細(xì)胞毒作用可以抑制腫瘤細(xì)胞，其制備過(guò)程快速、簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)C07J75/00GK101891792SQ20101021251
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉普, 孫鮮明, 尹衛(wèi)平, 柴元武, 梁菊, 段文錄, 鄧瑞雪 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)