專利名稱：截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物來源化合物的提取工藝，特別涉及截短側(cè)耳素的超臨界二氧化 碳萃取工藝。
背景技術(shù)：
截短側(cè)耳素(pleuromutilin)是一種三環(huán)二萜類廣譜抗生素，1951年首先由學(xué)者 Kavanagh ,^λ 〒胃 Pleurotus mutilis R P. passeckerianusΒ^ Ε Ι^ 菌綱斜蓋菇(Clitopilus)屬中11個(gè)真菌能產(chǎn)生此抗生素。截短側(cè)耳素主要作用于細(xì)菌 50S核糖體亞基，通過抑制肽基轉(zhuǎn)移酶的活性阻斷細(xì)菌蛋白合成，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制使其展 示出對耐藥菌的良好抗菌活性，同時(shí)還具有不易與其他藥物發(fā)生交叉耐藥的優(yōu)越性，但由 于其存在半衰期短、水溶性差等缺點(diǎn)，在應(yīng)用上受到很大限制。構(gòu)效關(guān)系研究表明，截短側(cè) 耳素C-14位側(cè)鏈的修飾可改變其水溶性和抗菌活性。由此，目前已成功開發(fā)出多種截短側(cè) 耳素衍生物，如新型獸用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)、沃尼妙林(Valnemulin)及新型人用 抗生素瑞他莫林(Retapamulin)，這些衍生物的水溶性和抑菌活性均較截短側(cè)耳素有較大 提高，尤其是瑞他莫林的開發(fā)實(shí)現(xiàn)了從獸用抗生素到人用抗生素的飛躍。此外，日本住友制 藥、Nabriva Therapeutics和GSK制藥公司開發(fā)的幾種新型截短側(cè)耳素衍生物目前已相繼 進(jìn)入臨床。這些皆預(yù)示著截短側(cè)耳素衍生物良好的開發(fā)應(yīng)用前景。截短側(cè)耳素是合成截短側(cè)耳素衍生物的重要中間體。目前有關(guān)其提取工藝的研究 報(bào)道較少。國內(nèi)生產(chǎn)廠家多采用溶劑提取工藝，即用板框壓濾法從截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌全發(fā) 酵液中分離出菌絲體，再用甲醇進(jìn)行浸提。但該工藝在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用過程中存在溶劑用量 大、提取時(shí)間長、溶劑回收能耗大、產(chǎn)品純度較差、生產(chǎn)成本高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝， 具有穩(wěn)定易行、溶劑用量小、提取時(shí)間短、產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝，包括以下步驟a、從截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌全發(fā)酵液中分離出菌絲體，干燥，粉碎過篩，烘焙至含水量 低于5%，得烘焙菌絲體，備用；b、將步驟a所得烘焙菌絲體置超臨界萃取釜中，在萃取壓力為12 24Mpa、萃取溫 度為35 55°C、二氧化碳流速為25kg/h的條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取，萃取時(shí)間為 60 100分鐘，收集萃取物，即得截短側(cè)耳素。進(jìn)一步，所述步驟b中還添加夾帶劑，所述夾帶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶 液，所述夾帶劑用量為每克烘焙菌絲體添加夾帶劑0. 5 1. 5毫升；進(jìn)一步，所述步驟b中萃取壓力為24Mpa、萃取溫度為35°C、萃取時(shí)間為80分鐘、 夾帶劑用量為每克烘焙菌絲體添加夾帶劑0. 5毫升。
本發(fā)明的有益效果在于首先，本發(fā)明改進(jìn)了提取前菌絲體的預(yù)處理方式，將菌絲 體經(jīng)粉碎、烘焙預(yù)處理，利于超臨界二氧化碳在菌絲體中的傳質(zhì)，利于與脂類或蛋白質(zhì)緊密 結(jié)合的截短側(cè)耳素的溶出，還利于減少提取過程中由于水分的存在對超臨界二氧化碳萃取 的干擾；其次，本發(fā)明對截短側(cè)耳素超臨界二氧化碳萃取工藝的條件如萃取壓力、萃取溫 度、萃取時(shí)間、是否添加夾帶劑及夾帶劑用量等進(jìn)行了考察和優(yōu)化，所得優(yōu)化工藝具有穩(wěn)定 易行、溶劑用量小、提取時(shí)間短、產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)應(yīng)用前景好。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn) 行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中使用的主要材料和儀器截短側(cè)耳素全發(fā)酵液按照文獻(xiàn)方法 (Hu C, et al. Effect of soybean oil on the production of mycelial biomass and pleuromutilin in the shake-flask culture of Pleurotus mutilis. World J Microb Biot，2009，25(10) :1705_1711)通過產(chǎn)生菌 Pleurotus mutilis-04 發(fā)酵制得；二氧化碳 購自重慶巴人氣體有限公司；95%乙醇(分析純)購自成都市科龍化工試劑廠；超臨界萃 取裝置(TC-SFE-50-0. 5-210S型)購自沈陽天誠超臨界萃取有限公司；高效液相色譜儀 (LC-20AT型)購自日本島津公司。實(shí)施例1 21、截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取方法采用板框過濾法從截短側(cè)耳素全發(fā)酵液中分離出菌絲體，自然風(fēng)干，粉碎過 16目篩，45°C烘焙8 10小時(shí)至含水量<5%，得烘焙菌絲體，采用高效液相色譜法(鄒 祥.高效液相色譜法測定發(fā)酵液中截短側(cè)耳素的含量.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006,32(03) 83-85)測得烘焙菌絲體中截短側(cè)耳素含量為15. 80% (w/w)；稱取烘焙菌絲體IOOg置超臨 界萃取釜中，不添加夾帶劑或添加夾帶劑(甲醇、95%乙醇、醋酸丁酯或醋酸乙酯)，在萃取 壓力為12 24Mpa、萃取溫度為35 55°C、二氧化碳流速為25kg/h的條件下進(jìn)行超臨界 二氧化碳萃取，萃取時(shí)間為60 100分鐘，收集萃取物，即得截短側(cè)耳素。將萃取后的菌絲 體于45°C干燥至恒重，按20mL/g的用量加入甲醇，超聲1小時(shí)，再空氣浴振蕩24小時(shí)，濾 過，取濾液，用高效液相色譜法測定萃取后菌絲體中截短側(cè)耳素殘余量，計(jì)算截短側(cè)耳素提 取率。具體工藝條件及結(jié)果見下表。附表截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝條件及結(jié)果 由實(shí)施例1 5可知，4種夾帶劑的截短側(cè)耳素提取率為77. 09 % 86. 85 %，最高 值與最低值之間僅相差10%，說明夾帶劑的種類對截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取效果 不具有顯著性影響，但與不添加夾帶劑相比，添加夾帶劑后能夠小幅改善截短側(cè)耳素的提 取率，因此優(yōu)選添加夾帶劑，其中夾帶劑優(yōu)選安全性好且價(jià)廉易得的95%乙醇。由實(shí)施例6 11可知，當(dāng)萃取時(shí)間為45分鐘時(shí)，截短側(cè)耳素提取率僅為31. 3% ； 當(dāng)萃取時(shí)間增加至60分鐘時(shí)，截短側(cè)耳素提取率大幅提高，達(dá)到82. 09% ；之后繼續(xù)增加萃 取時(shí)間，截短側(cè)耳素提取率的增幅變小；當(dāng)萃取時(shí)間超過105分鐘后，截短側(cè)耳素提取率基 本無變化；因此萃取時(shí)間優(yōu)選為60 105分鐘。由實(shí)施例12 21可知，萃取壓力對截短側(cè)耳素提取率的影響較顯著，當(dāng)萃取壓力 由12Mpa升高至24Mpa時(shí)，截短側(cè)耳素的提取率由54. 49%提高至89. 69%，提高了近30% ；推測其原因在于，壓力升高可以明顯改善超臨界二氧化碳對截短側(cè)耳素的選擇性，并顯著 提高截短側(cè)耳素在超臨界二氧化碳中的溶解度，從而提高了截短側(cè)耳素提取率。當(dāng)萃取壓 力一定時(shí)，截短側(cè)耳素的提取率隨著萃取溫度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢；推測其原因在于，溫 度升高雖然可以增加超臨界二氧化碳的擴(kuò)散性，提高其傳質(zhì)性能，但同時(shí)使超臨界二氧化 碳的密度降低，對截短側(cè)耳素的溶解能力降低，且此效應(yīng)強(qiáng)于擴(kuò)散效應(yīng)，從而降低了截短側(cè) 耳素的提取率。由于添加夾帶劑僅能小幅提高截短側(cè)耳素提取率，而萃取時(shí)間超過60分鐘 時(shí)截短側(cè)耳素提取已比較充分，故夾帶劑用量和萃取時(shí)間對截短側(cè)耳素提取率的影響不明 顯。最佳萃取工藝條件為萃取壓力為24Mpa、萃取溫度為35°C、萃取時(shí)間為80分鐘、夾帶 劑用量為0. 5mL/g。 最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝，其特征在于包括以下步驟a、從截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌全發(fā)酵液中分離出菌絲體，干燥，粉碎過篩，烘焙至含水量低于5％，得烘焙菌絲體，備用；b、將步驟a所得烘焙菌絲體置超臨界萃取釜中，在萃取壓力為12～24Mpa、萃取溫度為35～55℃、二氧化碳流速為25kg/h的條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取，萃取時(shí)間為60～100分鐘，收集萃取物，即得截短側(cè)耳素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝，其特征在于所述步 驟b中還添加夾帶劑，所述夾帶劑為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶液，所述夾帶劑用量為每 克烘焙菌絲體添加夾帶劑0. 5 1. 5毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝，其特征在于所述步 驟b中萃取壓力為24Mpa、萃取溫度為35°C、萃取時(shí)間為80分鐘、夾帶劑用量為每克烘焙菌 絲體添加夾帶劑0.5毫升。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物來源化合物的提取工藝，特別涉及截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝，包括以下步驟從截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌全發(fā)酵液中分離出菌絲體，干燥，粉碎過篩，烘焙至菌絲體總含水量低于5％，得烘焙菌絲體，備用；將所得烘焙菌絲體置超臨界萃取釜中，在萃取壓力為12～24MPa、萃取溫度為35～55℃、二氧化碳流速為25kg/h的條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取，萃取時(shí)間為60～100分鐘，收集萃取物，即得截短側(cè)耳素；該工藝具有穩(wěn)定易行，溶劑用量小，提取時(shí)間短，產(chǎn)物含雜質(zhì)少，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07C67/56GK101885681SQ20101021317
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉運(yùn)添, 周世荃, 張翔, 王鵬飛, 謝昌賢, 鄧維康 申請人:金河生物科技股份有限公司;重慶福美特科技開發(fā)有限公司