專利名稱：一種丙型肝炎病毒特異性抗原及其在血清分型中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒血清型檢測(cè)技術(shù)，具體地說涉及一種丙型肝炎特異 性抗原以及采用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)丙型肝炎病毒血清型特異性抗體的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus，HCV)是引起輸血后病毒性非甲非乙型肝炎的 主要病原，主要通過輸血、靜脈吸毒傳播，也可通過密切接觸和母嬰傳播。目前全世界約有 1. 7億HCV感染者。一般地，15 20%左右的HCV感染者為自限性感染，超過80 85%的 感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中又有20%的可發(fā)展為肝纖維化，最終有4 5%的肝纖維 化患者發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，危害十分嚴(yán)重。!1(^基因組全長94001^，共編碼(』132、賂3、賂4、賂5等蛋白。目前，慢性丙型 肝炎主要治療方案是干擾素加利巴韋林聯(lián)合治療。治療前應(yīng)進(jìn)行HCV RNA基因分型(1型 和非1型)和血中HCV RNA定量，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量。因此，HCV 基因型的檢測(cè)在慢性丙型肝炎的治療中具有重要作用。由于HCV基因組具有極高的變異性，根據(jù)選擇的區(qū)段的不同，不同學(xué)者采用不同 的HCV分型方法，命名也不盡相同。一般說，國際上通常采用的分型方法有兩種，一種是 Simmonds基因分型法，主要是采用測(cè)序法分析NS5區(qū)222bp的變異情況，將HCV基因型分為 la、lb、lc、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a、6a等6個(gè)主要的基因型和11個(gè)亞型，伴隨大量新HCV基 因的克隆測(cè)序工作的進(jìn)行，目前，HCV已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有30多個(gè)亞型；另一種是Okamoto基因分型 法，主要采用型特異性引物擴(kuò)增C區(qū)基因，根據(jù)擴(kuò)增片斷的長度，將HCV分為I-IV四個(gè)主要 的基因型。不同分型方法之間有一定的關(guān)聯(lián)性，象Simmonds確定的Ib亞型相當(dāng)于Okamoto 分型的II型；而2a亞型相當(dāng)于III型。除此以外，對(duì)El區(qū)的測(cè)序分析可以正確的區(qū)分 I/la、II/lb、III/2a、IV/2b、2c (V)、3a、4a、4b、4c、4d、5a、6a 共 12 種不同的基因型或亞型。 臨床研究顯示1b型HCV感染者IFN療效較差，而2a型感染者IFN敏感性較好。來自流行 病學(xué)的研究顯示，在我國，lb,2a兩種亞型感染率接近97%，因此，如何區(qū)分lb、2a感染在我 國臨床HCV治療中具有獨(dú)特的重要作用。目前，對(duì)HCV基因分型的方法除了序列分析法外，還增加了型特異性引物PCR擴(kuò)增 法、型特異性探針雜交法、限制酶切多態(tài)性分析等方法，盡管后續(xù)方法降低了測(cè)序費(fèi)用及縮 短了檢測(cè)時(shí)間，但仍需要HCV基因提取等過程，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展。另外，當(dāng)HCV-RNA陰 性或由于保存不當(dāng)及處理過程中HCV-RNA遭到破壞時(shí)，則不能進(jìn)行基因分型。鑒于上述情況，有些學(xué)者提出了血清學(xué)分型，即篩選HCV各基因型特異性抗原表 位，合成相應(yīng)多肽，采用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)，根據(jù)患者體內(nèi)型特異性抗體的存在情況，進(jìn)行 HCV的血清學(xué)分型。目前，日本學(xué)者根據(jù)不同HCV基因型中C區(qū)氨基酸序列的差異，人工合 成2條多肽，血清1型多肽代表Okamoto分型的I和II型(Simmonds分型的la、lb)，血清 2號(hào)多肽代表Okamoto分型的III和IV型(Simmonds分型的2a、2b)，基于C區(qū)的血清分型 與基因分型具有較高的符合率，但分型率只有45 %，但具有很高的特異性；基于NS4血清分型試劑可以檢測(cè)1-6型，分型率為83% ；與基因分型的符合率為87%，目前，Murex已經(jīng)推 出NS4血清分型的商品化試劑，但價(jià)格昂貴，且結(jié)果判斷復(fù)雜。造成血清分型率低的原因主要在于單獨(dú)使用C區(qū)、NS4抗原進(jìn)行血清學(xué)分型，其抗 體檢出率偏低。事實(shí)上，HCV感染者體內(nèi)針對(duì)HCV病毒產(chǎn)生的抗體情況十分復(fù)雜，存在針對(duì) 多個(gè)不同區(qū)的抗體，因此，HCV診斷通常通過采用多抗體聯(lián)合診斷的手段提高HCV抗體的檢 出率。而近些年對(duì)膜區(qū)E1、E2抗原的研究進(jìn)展，超過90%以上的HCV慢性感染者體內(nèi)都存 在針對(duì)膜區(qū)的抗體，但由于E1、E2抗原難以大量純化，直接影響膜區(qū)抗體在HCV檢測(cè)中的應(yīng) 用，也影響其在HCV血清分型中的進(jìn)一步應(yīng)用。C區(qū)型別特異性抗原表位的位置主要位于65-81aa區(qū)間，但不同研究中選擇的序 列并不相同，缺少進(jìn)一步核實(shí)；NS4型別特異性抗原表位的位置并不固定，其大體范圍位于 1690-1711范圍類，有15-21個(gè)氨基酸組成，尚需要對(duì)其型別特異性表位進(jìn)行精確分析。而 關(guān)于膜區(qū)型別特性抗原的鑒定至今未見報(bào)道。為了提高HCV血清分型的分型率，本研究在對(duì)C、NS4、E1型別特異性抗原表位進(jìn)行 分析鑒定的基礎(chǔ)上，利用基因序列拼接技術(shù)，克隆表達(dá)含有C、NS4、E1三個(gè)區(qū)段的融合型別 特異性抗原，并再此基礎(chǔ)上采用雙孔測(cè)試酶聯(lián)法對(duì)HCV血清進(jìn)行分型。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決HCV基因分型技術(shù)難以用于臨床的目的，本發(fā)明提供一種建立在免疫酶 聯(lián)檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)之上的HCV血清分型技術(shù)。為了提高HCV血清分型的分型率，本發(fā)明公開 了一種基于嵌合多區(qū)段型別特異性抗原進(jìn)行多表位HCV血清分型的方法，克服了原有技術(shù) 中單獨(dú)使用C區(qū)、NS4抗原造成的檢出率偏低的問題。本發(fā)明除了對(duì)現(xiàn)有HCV血清分型通 常采用的C、NS4型別特異性抗原表位進(jìn)行分析鑒定外，還增加了對(duì)El型別特異性抗原表位 篩選，利用基因序列拼接技術(shù)，克隆表達(dá)含有C、NS4、El三個(gè)區(qū)段的嵌合型別特異性抗原， 并在此基礎(chǔ)上建立多表位HCV血清分型技術(shù)，提高HCV血清分型的分型率。本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒(HCV)的lb、2a型別特異性的多表位嵌合抗原，其 特征在于，所述Ib型別抗原El區(qū)段包含氨基酸序列1、3、5，同時(shí)所述2a型別抗原El區(qū)段 包含氨基酸序列2、4、6，即，1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAffDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH所述Ib型別抗原NS4區(qū)段包含氨基酸序列7，同時(shí)所述2a型別抗原NS4區(qū)段包含 序列8，即，7VVAPDKEVLYEAFDEM8AIIPDREVLYQEFDEM所述Ib型別抗原C區(qū)段包含氨基酸序列9，同時(shí)所述2a型別抗原序列10，即，9KARRPEGRTWAQPGY
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10KDRRSTGKSWGKPGY。本發(fā)明還提供一種一種利用如上所述抗原進(jìn)行丙型肝炎病毒(HVC)血清分型檢 測(cè)的方法，利用所述Ib型別抗原和2a型別抗原分別形成抗原包被酶聯(lián)板，并進(jìn)一步分別形 成HCV-Ib孔板條和2a孔板條，將待測(cè)HCV血清分別加入兩孔內(nèi)，利用間接ELISA法檢測(cè) HCV血清于上述兩種抗原的反應(yīng)性，根據(jù)每份血清與HCV-Ib和2a抗原孔反應(yīng)的OD比值判 斷HCV的血清型，當(dāng)0D-lb/0D-2a之間的比值大于等于1肝炎病毒血清型為Ib型，否則為 2a型。本發(fā)明是建立在對(duì)HCV膜區(qū)抗原表位和分子進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上目前，HCV血清分型試劑中主要采用的是C區(qū)和NS4區(qū)型別特異性抗原，在至今未 見對(duì)HCV-El區(qū)型別特異性抗原的報(bào)道。本發(fā)明在對(duì)HCV膜區(qū)抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分 析的基礎(chǔ)上，篩選主要的抗原表位區(qū)間；進(jìn)一步采用分子進(jìn)化的方法對(duì)上述抗原序列進(jìn)行 同源比較，篩選其中的主序列，并通過血清學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證篩選表位的抗原性。同時(shí)，本發(fā)明發(fā)明是建立在含有HCV聯(lián)合多區(qū)段型別特異性嵌合抗原基礎(chǔ)之上。目前國際上廣泛采用的HCV分型檢測(cè)試劑均是建立在單抗原檢測(cè)的基礎(chǔ)上，其試 劑盒包被抗原只有C區(qū)或NS4區(qū)中的一種，由于感染者對(duì)HCV不同區(qū)段的抗體的產(chǎn)生情況 并不相同，因此，采用單一抗原對(duì)HCV型別特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)存在檢出率低的問題。故本 發(fā)明采用基因融合的方法，將C、NS4、El區(qū)進(jìn)行多表位嵌合表達(dá)，在此基礎(chǔ)上建立HCV血清 分型技術(shù)，獲得較單一抗原檢測(cè)更高的血清分型率。本發(fā)明首先利用生物信息學(xué)軟件分析丙型肝炎病毒El、NS4區(qū)型別特異性抗原表 位，并利用多序列比較分析其中的共同序列，作為型別特異性抗原表位；由于C區(qū)型別特異 性表位明確，可直接采用多序列比較分析獲得其型別特異性抗原即可。HCV-C、NS4、E1三個(gè) 區(qū)段的lb、2a型別特異性抗原其氨基酸序列如序列1-序列10所示。采用合成肽技術(shù)合成上述El抗原表位，分別包被酶聯(lián)板，采用30分陽性血清對(duì)其 抗原表位的抗原性進(jìn)行分析，選擇其中高抗原活性的El多肽。將Ib及2a型別特異性抗原按C、E1、NS4區(qū)的順序進(jìn)行串聯(lián)后，采用大腸桿菌優(yōu)勢(shì) 密碼子獲得嵌合lb、2a型別特異性抗原基因序列，采用退火延伸PCR法獲得嵌合lb、2a型 別特異性抗原基因，插入PGEX-4T-2載體。測(cè)序法鑒定陽性克隆，并保存菌種。大量培養(yǎng)后， IPTG誘導(dǎo)后，采用親和層析法和葡聚糖凝膠法純化相應(yīng)的嵌合抗原。嵌合抗原的氨基酸序 列分別如序列表中序列11、12所示，SP11:AIIPDREVLYQEFDEMYEVRNVSGVYHVTNDCSNSKARRPEGRTWAQPGY12 :VVAPDKEVLYEAFDEMVEVRNISSSYYATNDCSNNKDRRSTGKSWGKPGY以上述嵌合抗原包被酶聯(lián)板，檢測(cè)每份HCV血清與Ib及2a型別特異性抗原，根據(jù) OD-Ib與0D-2a的雙孔測(cè)試的比值判斷HCV的血清型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所提供的HCV的血清分型檢測(cè)試劑能正確檢測(cè)34份Ib血 清中29份，16份2a血清中的9份，僅有2份Ib血清和3份2a血清未進(jìn)行分型，總體分型 率達(dá)到90%，正確率為85%，均高于活接近國外報(bào)道。顯示HCV的血清分型檢測(cè)試劑具有 較高的正確率和分型率，在我國HCV臨床治療評(píng)價(jià)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是HCV-El區(qū)序列的抗原表位的生物信息學(xué)分析圖2HCV-NS4區(qū)序列的抗原表位的生物信息學(xué)分析圖3HCV純化重組表位抗原SDS-PAGE鑒定結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的用生物信息學(xué)軟件對(duì)HCV抗原El、NS4區(qū)表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定El、NS4區(qū)主要的抗 原表位的氨基酸位置；采用分子進(jìn)化軟件對(duì)比抗原序列，獲得相應(yīng)的lb、2a型別特異性序 列；由于C區(qū)抗原表位明確，直接采用分子進(jìn)化軟件分析其型別特異性抗原即可。利用合成 多肽和30份HCV內(nèi)質(zhì)控血清對(duì)上述多肽的抗原性進(jìn)行鑒定，選擇其中高抗原活性的El多 肽，并按C、E1、NS4區(qū)的順序串聯(lián)lb、2a型別特異性嵌合抗原。本發(fā)明為了有利于lb、2a型別特異性嵌合抗原基因在E. coli中獲得高效的表達(dá)， 選擇大腸桿菌的偏性密碼子設(shè)計(jì)并合成嵌合抗原基因；為了便于基因克隆到表達(dá)載體，在 連接臂的兩端引入BamHI和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以適合表達(dá)載體pGEX_4T_2 (參見中國專 利ZL00100695. 9 表達(dá)載體pBVILl及其構(gòu)建方法和用途)。雙酶切后插入載體pGEX_4T_2 中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序法證明各基因片段已獲正確地插入。HCV-lb,2a型別特異性嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli HBlOl后，通過熱誘導(dǎo)培 養(yǎng)，取全菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，證明各表達(dá)質(zhì)粒均已獲得了高效的表達(dá)，再經(jīng)采用親和 層析及凝膠過濾純化，均可獲得電泳純的HCV-lb、2a型別特異性嵌合抗原純品。用ELISA 檢測(cè)HCV感染者血清與上述2種抗原與之間的反應(yīng)性，并根據(jù)每份血清與HCVlb、2a型別特 異性抗原之間雙孔測(cè)試的比值判斷HCV的血清型。步驟1、HCV型別特異性抗原表位的選擇我們通過生物信息學(xué)軟件對(duì)HCV-El區(qū)序列的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1所 示，含有192-207aa、292-312aa和310-331aa共3個(gè)主要的抗原區(qū)段，采用CLUSTAL ff(l. 8) multiple sequence alignment對(duì)比獲得其型別特異性序列分別如如下序列1_序列6所
7J\ ο通過生物信息學(xué)軟件對(duì)HCV-NS4區(qū)序列的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其 抗原表位主要位于 1693-1708aa，采用 CLUSTAL ff(l. 8)multiple sequencealignment 對(duì)比 獲得其型別特異性序列分別如序列7和序列8所示；C區(qū)抗原表位主明確位于65-81aa，直 接采用CLUSTAL W分析其型別特異性抗原序列如序列9和序列10所示。序列1-10如下所示 1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAffDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH
7 :VVAPDKEVLYEAFDFM8 :AIIPDREVLYQEFDEM9 =KARRPEGRTffAQPGY10 =KDRRSTGKSffGKPGY采用合成肽技術(shù)合成上述HCV-El區(qū)6條型別特異性多肽，包被酶聯(lián)板，步驟2、HCV-lb,2a型別特異性嵌合多表位抗原的克隆與表達(dá)1. HCV-lb,2a型別特異性嵌合多表位抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1. 1HCV-Ib、2a型別特異性嵌合多表位抗原基因的合成根據(jù)上述HCV_lb、2a型別特異性嵌合多表位抗原的氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu) 勢(shì)密碼子委托上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成上述序列的基因。1. 2HCV_lb、2a型別特異性嵌合多表位抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1. 2. IPCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pGEX_4T_2雙酶切取以上合成基因產(chǎn)物及PGEX-4T-2表達(dá)載體各30 μ 1分別放于E印pendorf離心 管中，各加入 10Xbuffer (H) 4 μ 1、BamH I(10u/y 1)和 EcoR I (12u/μ 1)各 1 μ 1，加滅菌 蒸餾水至40 μ 1，置37 °C水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVILl經(jīng)雙酶切后，用 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，具體方法按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行。 純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分 別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖，放于E印pendorf離心管中，各加入Sl液，置55°C水浴 10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55°C溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑 盒說明書進(jìn)行純化。1. 2. 2連接于滅菌E印pendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因 各 1 μ 1、10XT4DNA Ligase buffer 1 μ 1, T4DNA Ligase (12u/ul) 1 μ 1，加滅菌蒸溜水至 10μ 1，置 16°C 過夜。1. 2. 3轉(zhuǎn)化在超凈工作臺(tái)中，用無菌吸頭取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按 《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物 5 μ 1，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分。立即轉(zhuǎn)移到42°C水浴中放置2分鐘，每管加入0. 5ml LB 培養(yǎng)基(不加抗生素)，30°C水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0. 2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基 平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個(gè)菌落，分別接種 于LB中(5ml/管)，培養(yǎng)過夜，次日各取0. Iml轉(zhuǎn)移到LB中(2ml/管)，32°C培養(yǎng)3小時(shí)， 42°C水浴搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達(dá)菌株，并測(cè) 序鑒定。2.抗原的表達(dá)與純化2. 1表達(dá)菌株的培養(yǎng)取_70°C保存的表達(dá)菌株20 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5 %的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)， 30°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)0D600值達(dá)到0. 7時(shí)，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42°C水浴搖床中， 誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。將菌液合并，6000rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。 2. 2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀 懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次
7超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C, 1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用Imol/ L NaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8. OTE配制) 溶解，加β _巰基乙醇。再于20°C，1，2000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清。2. 3純化將上述溶解的包涵體溶液過Q-S印harose FF陰離子交換柱，用平衡液 (pH8.0,20mmol/L TE含6mol/L脲，0. 1 % β -巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl (用 平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05mol/L NaCl洗脫峰。再過 Sephardex G-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒 定，結(jié)果如附圖3。步驟3嵌合HCV-Ib、2a多表位抗原在血清分型檢測(cè)中的應(yīng)用分別采用嵌合HCV_lb、2a多表位抗原包被酶聯(lián)板，形成HCV-Ib孔板條和2a孔板 條，將待測(cè)HCV血清分別加入兩孔內(nèi)，利用間接ELISA法檢測(cè)HCV血清于上述兩種抗原的反 應(yīng)性，根據(jù)每份血清與HCV-Ib和2a抗原孔反應(yīng)的OD比值判斷HCV的血清型。當(dāng)OD-Ib/ 0D_2a之間的比值大于等于1為Ib型，否則為2a型。采用上述方法對(duì)34份HCV-Ib和9份2a血清進(jìn)行血清分型，結(jié)果如表1所示HCV 的血清分型檢測(cè)試劑能正確檢測(cè)中29份HCV-Ib血清和9份HCV-2a血清，僅有2份Ib血 清和3份2a血清未進(jìn)行分型，總體分型率達(dá)到90% (45/50)，正確率為85% (38/45)，均高 于或接近國外報(bào)道，提示本發(fā)明提出的HCV的血清分型檢測(cè)試劑具有較高的正確率和分型 率，在我國HCV臨床治療評(píng)價(jià)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。表IHCV抗體分型檢測(cè)
權(quán)利要求
一種丙型肝炎病毒(HCV)的1b、2a型別特異性的多表位嵌合抗原，其特征在于，所述1b型別抗原E1區(qū)段包含氨基酸序列1、3、5，同時(shí)所述2a型別抗原E1區(qū)段包含氨基酸序列2、4、6，即，1YEVRNVSGVYHVTNDCSNS2VEVRNISSSYYATNDCSNN3PGHVSGHRMAWDMMMNWSPTTA4QGHITGHRMAWDMMLNWSPTLT5IVSPQHHWFVQECNCSIYPGT6TFSPRRHETVQDCNCSIYPGH所述1b型別抗原NS4區(qū)段包含氨基酸序列7，同時(shí)所述2a型別抗原NS4區(qū)段包含序列8，即，7VVAPDKEVLYEAFDEM8AIIPDREVLYQEFDEM所述1b型別抗原C區(qū)段包含氨基酸序列9，同時(shí)所述2a型別抗原序列10，即，9KARRPEGRTWAQPGY10KDRRSTGKSWGKPGY。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述抗原進(jìn)行丙型肝炎病毒(HVC)血清分型檢測(cè)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒特異性抗原及其在血清分型中的應(yīng)用。具體公開了一對(duì)含有丙型肝炎病毒(HCV)膜區(qū)的型別特異性嵌合抗原序列，還公開了利用該抗原進(jìn)行丙型肝炎病毒血清中分型檢測(cè)的方法。本發(fā)明主要采用免疫酶聯(lián)檢測(cè)技術(shù)，無需病毒基因的提取，可操作性強(qiáng)。含膜區(qū)嵌合抗原的使用較以往單抗原能提高HCV血清的分型率，本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與基因檢測(cè)具有較好的一致性。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101942021SQ20101022687
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者何競(jìng), 修冰水, 馮曉燕, 凌世淦, 宋曉國, 張賀秋, 楊錫琴, 王國華, 陳堃 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所