專利名稱：人類乳頭瘤病毒(hpv)衣殼蛋白l1多肽及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，具體地說是一種人類乳頭瘤病毒(HPV)衣殼蛋白Ll多肽及 其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
宮頸癌是一種嚴(yán)重影響婦女健康的疾病。全球范圍內(nèi)，宮頸癌是第二大婦女 常見腫瘤，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位，每年新發(fā)病例接近50萬(Valdespino VM, Valdespino VE. . Curr Op in Obstet Gynecol，2006，18 :35_40·)。近年來，人類乳頭瘤病 毒(HPV)感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生的主要病因。Warlboomers等在1999年對22個國家的 1035例宮頸癌標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的檢出率為 99.7%。從1933年第一例人乳頭瘤病毒(HPV)被發(fā)現(xiàn)，到目前已確定的人類乳頭瘤病毒亞 型已有200余種。按致病力的高低分為高危型和低位型，高危型包括HPV16，18，31，33，35， 39，45，51，52，56，58，59，63，78，82等，主要與宮頸鱗狀上皮內(nèi)不典型增生以及宮頸癌的發(fā) 生有關(guān)；低危型包括朋￥6，11，40，42，44，54，61，70，72，81等，主要與生殖道疣狀物的發(fā)生 有關(guān)。有研究表明，感染了高危型HPV的女性發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)或?qū)m頸癌的風(fēng) 險高出了 HPV 陰性的女性 100 倍(von Knebel DM. Eur J Cancer 2002 ；38 2229~42)。HPV 感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)發(fā)生發(fā)展的必要因素，但流行病學(xué)的調(diào)查表明，CINI和CINII 進展為CINIII或?qū)m頸癌的幾率是9%和22%。大部分的CINI和CINII的病人會自動恢復(fù)， 而機體對HPV病毒的清除是病變消退的主要原因。隨著巴氏涂片、液基細胞學(xué)等檢查的普 及，大大提高了宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌的檢出率。但也常導(dǎo)致過度治療和相關(guān)并 發(fā)癥，加重病人心理和經(jīng)濟負擔(dān)，臨床亟需新的檢測手段分流低危和高危病人。近年來人們 發(fā)現(xiàn)了一些與宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的標(biāo)志物，如P16、Ki67、HPVLl 等。其中HPVLl蛋白占HPV表面蛋白的90%以上，被認(rèn)為是機體識別并清除病毒的主要靶 點。大量研究表明，隨著宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)的進展，病變組織HPV-Ll衣殼蛋白表 達呈現(xiàn)下降的趨勢。人類乳頭瘤病毒(HPV)為不全封閉式病毒，成熟HPV病毒由環(huán)狀雙鏈DNA核心及 蛋白衣殼組成，無包膜結(jié)構(gòu)。HPV病毒基因組主要分為3個區(qū)①早期基因區(qū)(Early，E區(qū))， 編碼與病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯和與細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白。②晚期基因區(qū)(Late，L區(qū))，包括L1、L2 基因，分別編碼病毒的衣殼蛋白Li、L2。③非編碼的上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)，含有調(diào)節(jié)病毒DNA 復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的增強子、沉默子等。HPV病毒衣殼呈對稱的二十面體，直徑50-55nm。Ll蛋白 為HPV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，L2蛋白為次要結(jié)構(gòu)蛋白。每個病毒含72個由Li、L2組成的 殼蛋白單位，而每個殼蛋白單位由5個位于外圍的Ll蛋白和一個位于中心的L2蛋白構(gòu)成。 Ll蛋白分子量約55KDa，在不同HPV型別中高度保守，是主要的屬特異性抗原。HPV病毒感染宿主以后，常經(jīng)過一個無癥狀的潛伏期。此后，因病毒自身致病性的 高低和宿主免疫狀態(tài)的不同，病毒或者繼續(xù)潛伏，或者開始復(fù)制。HPV病毒在感染人體細胞 后有兩種復(fù)制方式一種為將HPV病毒DNA整合到宿主細胞DNA的固定復(fù)制方式，另一種則以病毒DNA宿主細胞核內(nèi)的寄生性的流動式的復(fù)制方式。一般而言，HPV引起良性或癌前 病變早期病毒基因組DNA是以游離的形式存在，而HPV基因組整合入宿主染色體是其致癌 的重要標(biāo)志。近年來大量研究表明，HPV病毒蛋白Ll的表達能反映宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變 (SIL)的預(yù)后及進展，Ll蛋白的表達與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的程度以及預(yù)后呈負相關(guān)。 Heejeong Lee ^RM, ^^M^MX^&^M7^. (low squamous intraepithelial lesion, LSIL)患者HPV Ll蛋白的表達的幾率，明顯高于宮頸高鱗狀上皮內(nèi)病變(high squamous intraepithelial lesion,HSIL)和宮頸癌(分別為 75. 8%，40%，40% )，且感染了低危型 HPV患者的細胞涂片Ll蛋白的陽性率高于感染了高危型患者的細胞涂片(分別為88. 9%， 70. 8 % ) (Heejeong Lee, M. D. , Kyung-Ji Lee, M. D. , Chan-Kwon Jung, Μ. D. Diagnostic Cytopathology, 2008, 36 (12) :864_867)。Melsheimer 等的研究也發(fā)現(xiàn)，HSIL 患者 HPV Ll 蛋白的表達水平與LSI患者比較顯著下降(Melsheimer P, Kaul S, Dobeck S, et al. Acta Cytologica，2003，47 124-128.)。Griesser在一項前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)(平均隨訪時間22. 8 個月，隨訪其細胞學(xué)涂片或錐切組織病理結(jié)果)，84例伴hrHPV感染的輕到中度宮頸上皮不 典型增生病例中，HPV Ll蛋白陽性者只有31%進展為CIN II (cervical intraepithelial neoplasia II，II度宮頸上皮內(nèi)瘤變)或CIN III ；而HPV Ll蛋白表達陰性者中，76. 4%進 展為CIN II，CIN III，或微侵癌，提示在低到中度不典型鱗狀上皮病變中，HPVLl蛋白陰性 病例比陽性病例更傾向于進展(Griesser H, Sander H, Hilfrich R, et al. Anal Quant Cytol Histol，2004，26 (5) :241_245.)。D. Rauber 等在對 279 例感染了 hrHPV 且經(jīng)細胞 學(xué)和組織學(xué)證實為CINI和CINII的病人隨訪了 25個月后發(fā)現(xiàn)HPVL1陽性的病人49. % 恢復(fù)，41. 5%的病人病情呈保持狀態(tài)，只有9. 4%的病人進展；而在HPVLl陰性的病例中 恢復(fù)、保持現(xiàn)狀和進展的比例分別是33. 3 %、40. 7 %、25. 9 % (D. Rauber，G. Mehlhorn, P. A.Fasching, M. W. Beckmann, S. Ackermann.European Journal of Obstetrics & Gynecology andReproductive Biology 140(2008)258—262)。 Tomomi Yoshida ^RMM HPV Ll衣殼蛋白與P16聯(lián)合應(yīng)用，可使CIN患者預(yù)后的預(yù)測更為準(zhǔn)確，他將Ll (_)/pl6(+) 定義為高危型，Ll(+)/pl6(+)定義為中間型，Ll(+)/pl6(-)定義為低危型，Ll(-)/pl6(_) 定義為低危型或無CIN證據(jù)型。以上研究強烈提示，HPVLl蛋白可作為判斷CINI或CINII病 人予頁后的標(biāo)志物(Yoshida T, Sano T, Yoshida T, Sano T, Kanuma T, Owada N, et al. Cancer Cytopathology 2008; 114 (2) :83_88)。宮頸組織HPV Ll蛋白表達預(yù)測癌前病變進展的機制①HPV衣殼蛋白Ll是公認(rèn)的機體免疫系統(tǒng)對HPV進行攻擊的主要靶點，而當(dāng) HPVLl蛋白表達下降或不表達時，病毒可逃避機體的免疫攻擊和清除(免疫逃逸)，導(dǎo)致持 續(xù)感染，從而病變持續(xù)或進展為癌；②研究發(fā)現(xiàn)，隨著SIL的進展，病毒基因組整合入宿主基因組的比例顯著增加。 在CINI及CINII中只有5-15%的HPVDNA與宿主DNA整合，而在CINIII中這一比例高達 50% -94%，在基因整合過程中，HPV Ll基因與其啟動子可能被分隔或是HPV Ll基因被破 壞，從而導(dǎo)致HPV Ll基因的轉(zhuǎn)錄翻譯受阻，Ll蛋白表達減少，因此，病毒基因整合可能是導(dǎo) 致Ll蛋白表達的原因，換言之，HPVLl蛋白表達下降可能提示病毒基因組的整合增加，而后 者與SIL的進展密切相關(guān)；
③也有文獻指出HPV Ll基因水平的甲基化修飾與宮頸病變有關(guān)。Turan發(fā)現(xiàn)在 宮頸鱗癌中HPV-18L1基因甲基化水平顯著高于正常宮頸細胞中HPV-18L1基因甲基化水 平，推斷HPV-18L1基因的甲基化可能是導(dǎo)致Ll蛋白表達下降的原因(Turan T5Kalantari M, Calleja-Macias IE, et al. Virology, 2006 ；349 175-183. Turan T, Kalantari M, Cuschieri K, et al. Virology，2007，361 185-193.)。Kalantari M 等也有類似的發(fā) M (Kalantari M, Calleja-Macias IE, Tewari D, et al. J Virol Dec,2004,78 (23) 12762-12772.)。綜上所述，HPVLl陽性可以作為CINI或CINII病人預(yù)后較好的一個指標(biāo)，單獨檢 測HPV Ll蛋白或者與其它篩查抗體聯(lián)合檢測可作為預(yù)測HPV相關(guān)SIL病變臨床轉(zhuǎn)歸的新 手段，從而為臨床對HPV感染患者進行分流提供實驗室依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一條高度保守的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽，以及該 多肽的制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供的人類乳頭瘤病毒(HPV)衣殼蛋白Ll多肽，由含N端--Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His-—C端所示的氨基酸序列組成；進一步由含N 端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C 端所示的氨基酸序列組 成，且長度小于50個氨基酸；再進一步，多肽的氨基酸序列為N端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C 端所示；或者是由 N 端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C端所示的氨基酸序列取代、缺失或疊加一個或多個氨基酸所 組成。本發(fā)明是通過對18種低危和高危HPV亞型(6，11，16，18，52，58等)的Ll蛋白表 位預(yù)測和多序列比對，篩選出的一條非常保守且位于蛋白質(zhì)表面，長度為12個氨基酸，序 列為 N端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C端的多肽，以其誘 導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以與多型別HPVLl反應(yīng)，可用于多種型別HPVLl的檢測，尤其是在人類宮頸 癌癌前病變檢測中的應(yīng)用，針對這一肽段的抗體還可用于多型別HPVLl的純化、制備。本發(fā)明提供的上述人類乳頭瘤病毒外衣殼蛋白Ll多肽，具體可應(yīng)用于以下幾個 方面以所述人類乳頭瘤病毒外衣殼蛋白Ll多肽為作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)制備多克隆抗血 清或單克隆抗體。多克隆抗血清或單克隆抗體可用于各型HPV及HPVLl的檢測。以所述的人類乳頭瘤病毒外殼蛋白Ll多肽的氨基酸序列進行變換后，或者功能 肽段為本氨基酸序列，或者功能肽段為進行變換后的序列為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)制備多克隆抗血 清或單克隆抗體?？寺】寡寤騿慰寺】贵w可用于各型HPV及HPVLl的檢測。以所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽為基本結(jié)構(gòu)單元，以連接短肽或氨基 酸連接，形成具有多個重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白或長肽，再將此蛋白或長肽作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)制備多 克隆抗血清或單克隆抗體。多克隆抗血清或單克隆抗體可用于各型HPV及HPVLl的檢測。以所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽與具有佐劑效應(yīng)的蛋白相連接，再將 此連接后的蛋白作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)制備多克隆抗血清或單克隆抗體，用于各型HPV及HPVLl的檢測。以所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽與化學(xué)佐劑或生物佐劑混合后，再將 此混合物作為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)制備多克隆抗血清或單克隆抗體。多克隆抗血清或單克隆抗體 可用于各型HPV及HPVLl的檢測。以上述的誘導(dǎo)物所誘導(dǎo)制備的多克隆血清或單克隆抗體用以多型別人類乳頭瘤 病毒或HPVLl的檢測、分離、純化，用于各型HPV及HPVLl的檢測。以所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽作為被檢測物，制備用于檢測多型別 HPV感染患者血清、體液、組織中的抗HPVLl蛋白抗體，或者經(jīng)HPVLl蛋白免疫的哺乳類或非 哺乳類動物免疫血清、體液、組織中的抗HPVLl蛋白抗體的診斷試劑。


圖1顯示的是免疫細胞化學(xué)檢測多肽抗血清結(jié)果圖；圖2顯示的是免疫組織化學(xué)檢測多肽抗血清結(jié)果圖；圖3顯示的是Western blot檢測多肽抗血清結(jié)果圖；圖4顯示的是中和實驗檢測多肽抗血清結(jié)果圖。圖5顯示的是中和實驗檢測多肽抗血清結(jié)果圖。 圖6是細胞學(xué)在宮頸癌防治中的應(yīng)用示意圖。在圖1中，圖1-A、a為宮頸腺癌Hela細胞株，圖2_B、b為宮頸鱗癌Siha細胞株。 圖1_A、B為以多肽抗血清為抗體，圖l-a、b為以陰性對照組兔血清為抗體。Ll蛋白主要在 細胞核中表達，細胞漿中少量表達。由圖1可以看出多肽抗血清能和宮頸癌細胞株HeLa和 SiH中的Ll蛋白結(jié)合，而對照組則不能。在圖2中，圖2-A、a為尖銳濕疣圖片，圖2_A、b為CINII-III圖片，圖2_C、c為 CINI圖片，圖2-D、d為HPV(+)宮頸炎圖片，圖2-E為HPV(-)的宮頸炎圖片。圖2_A、B、C、 D、E為以多肽抗血清為抗體，圖2-a、b、c、d為以陰性對照組兔血清為抗體。Ll蛋白主要在 細胞核中表達，細胞漿中少量表達。由圖2可以看出多肽抗血清能和尖銳濕疣、CIN以及宮 頸炎中的Ll蛋白結(jié)合，而對照組則不能，HPV陰性的宮頸炎也不能。在圖3中，HPVLl蛋白分子量在55Kd左右，圖3顯示多肽抗血清能與siha和hela 細胞中的Ll蛋白結(jié)合，在50+Kd處出現(xiàn)條帶。在圖4中，圖4-A、a為宮頸腺癌細胞株Hela，圖4_B、b為宮頸鱗癌細胞株Siha。 圖4A、B為以多肽抗血清與無關(guān)多肽的混合物為抗體，圖4a、b為以多肽抗血清與本發(fā)明說 提供的多肽為抗體。在圖5中，圖5_A、a為尖銳濕疣圖片，5_B、b為CINI圖片，5_C、c為CINII-III圖 片，5-D、d為HPV (+)宮頸炎圖片，圖5中A、B、C、D為以多肽抗血清與無關(guān)多肽的混合物為 抗體，圖5中a、b、c、d為以多肽抗血清與本發(fā)明提供的多肽為抗體。由此看出，本發(fā)明所 提供的多肽能有效的中和抗血清中的抗體，而無關(guān)多肽卻不能。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述的實施例用于描述本發(fā)明，而 不是限制本發(fā)明。
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實施例一1、18種低危和高危HPV亞型保守抗原表位的篩選和肽段合成通過計算機模擬，采用多種B細胞表位預(yù)測軟件(如antigenic，ν6. 0. 1)進行18 種HPV亞型(6，11，16，18，52，58等)的Ll蛋白表位預(yù)測和多序列比對，并用naccess程 序計算相應(yīng)氨基酸殘基的液相可及面積，我們篩選一條非常保守且位于蛋白質(zhì)表面的肽段 (N—Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C)，并且委托北京賽百盛生 物科技公司合成了該肽段及該肽段的交聯(lián)物(Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—KLH)，純度> 90%。2、抗血清的制備初次免疫實驗組將弗氏完全佐劑與合成的免疫原Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His-KLH蛋白等量混合，磁力攪拌器上攪拌30min。混合均勻后免疫家兔， 每只家兔免疫0.5ml的200ug/ml抗原。2周后用弗氏不完全佐劑與免疫原等量混合，充分 乳化后進行家兔免疫(操作同前)。后間隔2周免疫一次，總共免疫4次，在第四次免疫后 2周從頸動脈置管收集血清，加等量甘油，充分混勻后分裝。實施實例二抗多肽抗血清對被HPV病毒感染細胞反應(yīng)性的免疫細胞化學(xué)檢測將處于對數(shù)生 長期的HeLa(感染了 HPV18的宮頸腺癌細胞株)、Siha(感染了 HPV16的宮頸鱗癌細胞株) 細胞用胰酶消化后，將細胞懸液接種在置于24孔板中的蓋玻片上，C02孵箱、37°C過夜培 養(yǎng)，當(dāng)細胞覆蓋玻片約70%時用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗5minX3次，3% H2O2消除 內(nèi)源性過氧化物酶30min，PBS5minX 3次，0. 1% Triton打孔15min, PBS5minX 3次，用山 羊血清封閉液封閉30min，加入1 500稀釋的家兔血清4°C過夜，PBS洗5minX3次，再滴 加山羊抗兔二抗工作液15min，PBS洗5min X 3次，加入辣根標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，PBS洗 5minX3次，DAB顯色3min，自來水終止反應(yīng)，蘇木蘇復(fù)染5min，后經(jīng)脫水透明后封片。圖1_A、B為以多肽抗血清為抗體，圖l_a、b為以陰性對照組兔血清為抗體。Ll蛋 白主要在細胞核中表達，細胞漿中少量表達。由圖1可以看出多肽抗血清能和宮頸癌細胞 株HeLa和SiH中的Ll蛋白結(jié)合，而對照組則不能。實施實例三抗多肽抗血清對HPV陽性的臨床標(biāo)本反應(yīng)性的免疫組化檢測經(jīng)臨床病理科鑒定 為尖銳濕疣、CIN、宮頸炎且HPV感染陽性的組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫 蠟水化后，再用0. 01mol/lpH6. 0檸檬酸鹽緩沖液100°C修復(fù)20min，自然冷卻至室溫后PBS 洗5minX 3次，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶30min，PBS5minX 3次，用山羊血清封閉液封 閉30min，加入1 500稀釋的家兔血清4°C過夜，PBS洗5minX 3次，再滴加山羊抗兔二抗 工作液15min，PBS洗5min X 3次，加入辣根標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，PBS洗5minX3次，DAB 顯色3min，自來水終止反應(yīng)，蘇木蘇復(fù)染5min，后經(jīng)脫水透明后封片。圖2_A、B、C、D、E為以多肽抗血清為抗體，圖2-a、b、c、d為以陰性對照組兔血清為 抗體。Ll蛋白主要在細胞核中表達，細胞漿中少量表達。由圖2可以看出多肽抗血清能和 尖銳濕疣、CIN以及宮頸炎中的Ll蛋白結(jié)合，而對照組則不能，HPV陰性的宮頸炎也不能。實施實例4抗多肽抗血清對被HPV病毒感染細胞反應(yīng)性的Western Blot檢測
A、細胞蛋白的提取用BCA總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白。將Siha (感染了 HPV16的宮頸鱗癌細胞株)和Hela(感染了 HPV18的宮頸腺癌細胞株)細胞用刮匙刮下后 500g4°C離心 2min，PBS 洗兩次，加入 RIPA 200ul、cocktail8ul、PMSF2ul、2ul 蛋白酶抑制 劑，振蕩15s，冰上靜置10min，15000g4°C離心lOmin，洗取上清即為總蛋白。用BCA蛋白定 量試劑盒測定蛋白濃度，按IOOug/管分裝后存放于-80°C冰箱備用。B、用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣lOOug，120V, 1. 5h，轉(zhuǎn) 移至醋酸纖維膜上后，5%脫脂奶粉振蕩封閉lh，用5%脫脂奶粉按1 800稀釋抗血清4°C 過夜，TBST洗膜5minX3次，再用5%脫脂奶粉按1 5000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體振蕩作用lh，TBST洗膜5min X 3次，加入化學(xué)發(fā)光劑顯色5min，BioRed化學(xué)發(fā)光儀下 顯色。HPVLl蛋白分子量在55Kd左右，圖3顯示多肽抗血清能與siha和hela細胞中的 Ll蛋白結(jié)合，在50+Kd處出現(xiàn)條帶。實施實例五合成多肽特異性封閉抗多肽抗血清對HPV病毒感染細胞的免疫反應(yīng)性的免疫細 胞化學(xué)檢測將處于對數(shù)生長期的Hela、Siha和H8細胞用胰酶消化后，將細胞懸液接種在 置于24孔板中的蓋玻片上，C02孵箱、37°C過夜培養(yǎng)，當(dāng)細胞覆蓋玻片約70%時用4%多聚 甲醛固定15min，PBS洗5minX3次，3%H202消除內(nèi)源性過氧化物酶30min，PBS5minX3 次，0. 1% Triton打孔15min，PBS5minX 3次，用山羊血清封閉液封閉30min，加入1 500 稀釋的家兔血清及10ug/ml的本發(fā)明提供的多肽(N端-—Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His-—C端)或無關(guān)多肽的混合物，4°C過夜，PBS洗5minX 3次，再滴加 山羊抗兔二抗工作液15min，PBS洗5min X 3次，加入辣根標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，PBS洗 5minX3次，DAB顯色3min，自來水終止反應(yīng)，蘇木蘇復(fù)染5min，后經(jīng)脫水透明后封片。圖4中A、B，圖5中A、B、C、D、E為以多肽抗血清與無關(guān)多肽的混合物為抗體，圖4 中a、b，圖5中a、b、c、d、e為以多肽抗血清與本發(fā)明提供的多肽為抗體。由此看出，本發(fā) 明所提供的多肽能有效地中和抗血清中的抗體，而無關(guān)多肽卻不能。
權(quán)利要求
一種人類乳頭瘤病毒(HPV)衣殼蛋白L1多肽，其特征是由含N端 Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His C端所示的氨基酸序列組成。
2.如權(quán)利要求1所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽，其特征是由含N端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His-—C端所示的氨基酸序列組成，且肽段的 長度小于50個氨基酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽，其特征是由含 N 端一Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His—C 端所示的氨 基酸序列取代、缺失或疊加一個或多個氨基酸所組成。
4.權(quán)利要求1或2或3所述人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽制備，其特征是通過對 18種低危型和高危型HPV亞型的Ll蛋白表位預(yù)測和多序列比對，篩選出的一條保守且位于 蛋白質(zhì)表面，長度為12個氨基酸，序列為N端-—CysThr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr lie His-—C 端的多肽。
5.權(quán)利要求1或2或3所述人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽的應(yīng)用，其特征是以所 述的肽段作為誘導(dǎo)物，所誘導(dǎo)制備的多克隆抗血清或單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1或2或3所述的人類乳頭瘤病毒外殼蛋白Ll多肽的應(yīng)用，其特征是以 所述的肽段為基本結(jié)構(gòu)單元，以連接多肽連接，形成具有多個重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白或長肽，再將 此蛋白或長肽作為誘導(dǎo)物，所誘導(dǎo)制備的多克隆抗血清或單克隆抗體。
7.權(quán)利要求1或2或3所述的人類乳頭瘤病毒外殼蛋白Ll多肽的應(yīng)用，其特征是以 所述的多肽與具有佐劑效應(yīng)的蛋白相連接，再將此連接后的蛋白作為誘導(dǎo)物，所誘導(dǎo)制備 的多克隆抗血清或單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1或2或3所述的人類乳頭瘤病毒外殼蛋白Ll多肽的應(yīng)用，其特征是以 所述的多肽與化學(xué)合成佐劑或生物佐劑混合后，再將此混合物作為誘導(dǎo)物，所誘導(dǎo)制備的 多克隆抗血清或單克隆抗體。
9.權(quán)利要求1或2或3所述的人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白Ll多肽的應(yīng)用，其特征是以 多肽作為被檢測物，制備用于檢測多型別HPV感染患者血清、體液、組織中的抗HPVLl蛋白 抗體，或者制備用于檢測經(jīng)HPVLl蛋白免疫的哺乳類或非哺乳類動物免疫血清、體液、組織 中的抗HPVLl蛋白抗體的試劑。
10.權(quán)利要求5或6或7或8所述多克隆抗體或單克隆抗體的應(yīng)用，其特征是制備用 于多型別人HPV或HPVLl的檢測、分離、純化的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1(HPVL1)多肽及其制備與應(yīng)用。該人類乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1多肽，氨基酸序列為N端---Cys Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His---C端的肽段，或者是包含這一氨基酸序列且長度小于50個氨基酸的肽段。本發(fā)明是通過對18種低危型和高危型HPV亞型(6，11，16，18，52，58等)的L1蛋白表位預(yù)測和多序列比對，篩選出的一條非常保守且位于蛋白質(zhì)表面的肽段，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以與多型別HPVL1反應(yīng)，可用于多種型別HPVL1的檢測，尤其是在人類宮頸癌癌前病變檢測中的應(yīng)用，針對這一肽段的抗體還可用于多型別HPVL1的純化、制備。另外，本發(fā)明還提供這一肽段作為多種型別HPV抗血清和單克隆抗體被檢測物的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/06GK101914139SQ20101022881
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者劉寶, 張 林, 林勇, 王霞, 甘曉玲, 胡麗娜, 陳恒禧 申請人:四川大學(xué)