專利名稱：一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體為一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和 蟲草多糖的方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草(北蟲草)，又名蛹蟲草(Cordyc印s militaris)，屬子囊菌亞門、麥角 菌科、蟲草屬，是一種珍貴的藥用菌。近年來，由于天然冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis)需 求不斷增長，有限的資源日益枯竭，目前尚未人工規(guī)?；耘?。于是人們開始培育生產(chǎn)周期 短，與天然冬蟲夏草有相似醫(yī)療保健功效的北冬蟲夏草滿足消費(fèi)需求，替代天然冬蟲夏草 的不足，為人工規(guī)?；嘤谋倍x夏草的發(fā)展提供了廣闊的市場和良好的發(fā)展機(jī)遇。蟲草素和蟲草多糖是天然冬蟲夏草、人工培育北冬蟲夏草中重要的生理活性成 份，大量的藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，蟲草素具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、 減肥、提高性功能等作用；蟲草多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG抗體含量和機(jī)體的 免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體自身抗癌抑癌的能力，兩者均表現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景。人工培育的北冬蟲夏草培養(yǎng)基中含有蟲草素、蟲草多糖等生理活性成份，從殘余 培養(yǎng)基中提取蟲草素、蟲草多糖等保健食品或醫(yī)藥中間體，將能變廢為寶，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。目前，據(jù)國內(nèi)外公開報(bào)道的有關(guān)北冬蟲夏草或其培養(yǎng)基中蟲草素和多糖的提取專 利文獻(xiàn)，提取技術(shù)都是單一成份分步提取，即使大規(guī)模生產(chǎn)，往往需要多套設(shè)備系統(tǒng)進(jìn)行非 連續(xù)性提取，分離步驟多，投資大，生產(chǎn)成本高。比如，有些專利中利用離子交換樹脂分步提 取，樹脂再生時(shí)需用大量的酸堿等化學(xué)試劑，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)的設(shè)備要求較高，并且?guī)韽U氣 廢水，造成環(huán)境污染。另外，有些專利中報(bào)道采用大孔樹脂，但是不能同時(shí)提取蟲草素和蟲 草多糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時(shí)提取蟲草素和蟲草多 糖的方法。一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時(shí)提取蟲草素和蟲草多糖的方法，是利用 提取劑對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中的蟲草素和蟲草多糖進(jìn)行提取，同時(shí)使提取液流經(jīng) 大孔樹脂后再次對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提取；將吸附在大孔樹脂上的蟲草素和 蟲草多糖洗脫下來，洗脫液濃縮干燥后得到的產(chǎn)品中含有蟲草素和蟲草多糖。具體包括如下步驟
(1)將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內(nèi)，用提取劑對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提取；提取液流出后用大孔樹脂進(jìn)行吸附，然后流回裝有北冬蟲夏草固體培 養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提??；提取時(shí)間為10 20hr ；大孔樹脂為非極性樹脂，可以用H-01、 H-IO或H-20樹脂，優(yōu)選為H-20樹脂；
北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 1 20L 0. 3 0. 5L ；優(yōu)選為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L ；提取劑為水；
(2)用洗脫劑洗脫大孔樹脂，得到洗脫液；洗脫速度為0.5 2BV/hr ； 北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為Ikg :1 2L ； 洗脫劑優(yōu)選為10 50%體積濃度的乙醇水溶液；
(3)取洗脫液濃縮和干燥，得到含有蟲草素和蟲草多糖的固體。步驟(1)中，將粉碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。步驟(1)中，裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔 樹脂的吸附柱的底部入水口，吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基 的容器底部的入水口，提取液的流動(dòng)方向?yàn)槿萜鞯撞咳胨凇萜魃喜砍鏊凇?附柱底部入水口——吸附柱上部水口——容器底部入水口。步驟(3)中所述的濃縮和干燥方法為將洗脫液濃縮至比重為1. 05 1. 1，在 80 IOCTC下加熱烘干，或-50 -io°c下低溫冷凍干燥，或者真空低溫干燥；真空低溫干 燥的條件為真空度一 0. 09 一 0. IMpa，溫度范圍30 50°C。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中蟲草素和蟲草多糖提取技術(shù)的不足，能從北冬蟲夏草固 體培養(yǎng)基殘基中同時(shí)提取蟲草素和蟲草多糖，變廢為寶；所得產(chǎn)品活性成分含量高；以水 為提取劑，所涉及的工藝和設(shè)備簡單，可實(shí)現(xiàn)在常溫下連續(xù)動(dòng)態(tài)地提取和吸附分離。所用樹 脂不需經(jīng)過酸堿再生可以重復(fù)使用，降低投資和運(yùn)行成本，環(huán)保節(jié)能，適合大規(guī)模工業(yè)化生 產(chǎn)。而且北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中生理活性成份蟲草素和蟲草多糖的提取得率高，產(chǎn)品中 蟲草素含量可達(dá)15 35%，蟲草多糖含量10 35%。
具體實(shí)施例方式用滾軸式不銹鋼刀片粉碎機(jī)將塊狀的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基的殘基進(jìn)行粉碎，主 軸轉(zhuǎn)速為400 600r/min，篩網(wǎng)孔徑為10 20mm，得到北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒。所得 產(chǎn)品中蟲草素和蟲草多糖的檢測方法為
蟲草素含量的測定(高效液相色譜法) (1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
準(zhǔn)確稱取2. 5毫克蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，用純凈水加熱溶解后定容到10毫升，冷卻至室溫備用。(2)色譜條件
C18色譜柱(150mm*4. 6mm)；流動(dòng)相為甲醇水=15 85 ；流速1. Oml/min ；柱溫40°C; 檢測波長258nm。(3)樣品含量測定
準(zhǔn)確稱取0. 25克樣品，用純凈水加熱溶解后定容到25毫升，冷卻至室溫，搖勻， 4000rpm離心lOmin，上清液過0. 22 w m濾膜過濾，20 w L進(jìn)樣，通過樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積 來計(jì)算蟲草素的含量。
蟲草多糖含量的測定(苯酚_硫酸法) (1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制
準(zhǔn)確稱取在105°c烘至恒重的葡聚糖20. OOmg,加水溶解并稀釋至100ml。搖勻備用， 此液濃度為200μ g/ml。(2)葡聚糖吸收常數(shù)的測定
準(zhǔn)確吸取上述葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液0，0. 10，0. 20，0. 30，0. 40，0. 60，0. 80和1. OOml置于25ml 比色管中，葡聚糖的重量依次為0，20，40，60，80，120，160和200微克，各管補(bǔ)加水至 2. OOml,各管再準(zhǔn)確加入5%苯酚液1. Oml,再在不斷搖動(dòng)下，小心而緩慢的加入IOml硫 酸，立即置于沸水浴中加熱2分鐘，取出，冷卻至室溫后，用分光光度計(jì)在最大吸收波長處 (約483-485nm)，以不加葡聚糖的空白溶液(即第一管)為參比液，使用Icm比色皿，測定 各管的吸光度，計(jì)算吸收常數(shù)。(3)樣品的測定
稱取已磨細(xì)過篩(40目或60目)的樣品粉末，約0. 25克，稱準(zhǔn)至0. 0001克，置于 25ml容量瓶內(nèi)，加入水約20ml，搖勻后置于沸水浴中加熱提取約1小時(shí)，并不時(shí)搖動(dòng)瓶內(nèi) 液體，當(dāng)粉末不再浮上液面全部沉在瓶底時(shí)，即可停止加熱取出，冷至室溫，補(bǔ)加水至刻 度，搖勻。于離心機(jī)內(nèi)離心不少于10分鐘(轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘)取上清液備用。吸取上述備用液，加入6倍的95%乙醇或5倍的無水乙醇，邊加邊搖，加蓋后， 冰箱內(nèi)冷藏過夜，取出，離心20分鐘，轉(zhuǎn)速不少于4000轉(zhuǎn)/分鐘。小心棄去上清液，沉淀用 少量水溶解，轉(zhuǎn)移至另一 25ml容量瓶內(nèi)，洗滌液也并入瓶內(nèi)，再加水至刻度，搖勻備用。吸取上述溶液一定體積(吸取體積以使配制后的液體光吸收值介于0. 2-0. 8之間 為合適)，補(bǔ)加水至2. 0ml，加入5%苯酚液1.0ml，搖勻后，在不斷搖動(dòng)下，小心而緩慢的 加入硫酸10ml，立即置于沸水浴中加熱2分鐘，取出，冷至室溫后，用分光光度計(jì)進(jìn)行 比色，空白試驗(yàn)為參比值，使用Icm的比色皿.使用波長應(yīng)為最大光吸收處的波長(約為 483-485nm),記下樣品測定液的光吸收值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖吸收常數(shù)計(jì)算樣品中蟲草多 糖的含量。實(shí)施例1
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管 中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將PVC管蓋緊。用蠕動(dòng)泵將2500ml飲用水從PVC管底端泵入，PVC管上端出來的水提液從下端流 入裝有100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ2.5Χ50(:πι)中，玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動(dòng) 泵泵入PVC管底端，進(jìn)行水循環(huán)提取；蠕動(dòng)泵開啟時(shí)間即提取時(shí)間為16小時(shí)。用400ml 30% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的玻璃柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為1. 05時(shí)停止?jié)饪s。濃縮液用 80 100°C熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥，得干粉0.85克。干粉中蟲草素含量34.7%，蟲草多糖含量 15. 66%。實(shí)施例2
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管中，用蠕動(dòng)泵將500ml飲用水從PVC管底端泵入，PVC管上端出來的水提液從下端流入裝有 100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ 2. 5 X 50cm)中，玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動(dòng)泵泵入 PVC管底端，進(jìn)行水循環(huán)提取，蠕動(dòng)泵開啟時(shí)間即提取時(shí)間為16h。用400ml 10% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的玻璃柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為1.07時(shí)停止?jié)饪s。濃縮液 在-50 -10°C下低溫冷凍干燥，得干粉1. 24克。干粉中蟲草素含量24. 8%，蟲草多糖含 量 11. 29%。實(shí)施例3
將24. 32公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將桶蓋緊。用高壓隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入，不銹鋼桶上端出來的水提液 從下端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中，不銹鋼柱上端的流出液 繼續(xù)用高壓隔膜泵泵入不銹鋼桶底端，進(jìn)行水循環(huán)提取，高壓隔膜泵開啟時(shí)間即提取時(shí)間 為 16h。用30升20% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的不銹鋼柱進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為1. 07時(shí)停止?jié)饪s。濃縮液用 80 100°C熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥，得干粉94. 7克。干粉中蟲草素含量18. 17%，蟲草多糖含量 32. 58%。實(shí)施例4
將24. 89公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中，裝填要均勻，不擠壓，用蓋子將桶蓋緊。用高壓隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入，不銹鋼桶上端出來的水提液 從下端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中，不銹鋼柱上端的流出液 繼續(xù)用高壓隔膜泵泵入不銹鋼桶底端，進(jìn)行水循環(huán)提取，高壓隔膜泵開啟時(shí)間即提取時(shí)間 為 16h。用30升50% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑，用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的不銹鋼柱進(jìn)行洗脫，流速lBV/h。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，濃縮液比重為1. 09時(shí)停止?jié)饪s。濃縮液在真空度一 0.09 一 0. IMpa,30 50°C條件下真空低溫干燥，得干粉 110. 65克。干粉中蟲草素含量28. 1%，蟲草多糖含量14.43%。
權(quán)利要求
一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其特征在于，包括如下步驟(1) 將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內(nèi)，用提取劑對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提?。惶崛┝鞒龊笥么罂讟渲M(jìn)行吸附，然后流回裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提取；提取時(shí)間為10～20hr；北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為1kg1～20L0.3～0.5L；提取劑為水；(2) 用洗脫劑洗脫大孔樹脂，得到洗脫液；洗脫速度為0.5～2BV/hr；北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為1kg1～2L；洗脫劑為10～50%體積濃度的乙醇水溶液；(3) 取洗脫液濃縮和干燥，得到含有蟲草素和蟲草多糖的固體。
2.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其 特征在于，步驟(1)中，將粉碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。
3.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其 特征在于，步驟(1)中，裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔 樹脂的吸附柱的底部入水口，吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基 的容器底部的入水口，提取液的流動(dòng)方向?yàn)槿萜鞯撞靠凇萜魃喜砍鏊凇街?底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。
4.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法， 其特征在于，步驟(1)中，北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L。
5.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其 特征在于，步驟(1)中，所述的大孔樹脂為非極性大孔樹脂。
6.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其 特征在于，步驟(1)中，所述的大孔樹脂為H-20型、H-Ol型或H-IO型大孔樹脂。
7.權(quán)利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法， 其特征在于，步驟(3)中所述的濃縮和干燥方法為將洗脫液濃縮至比重為1. 05 1. 1，在 80 IOCTC下加熱烘干，或-50 -io°c下低溫冷凍干燥，或者真空低溫干燥。
8.權(quán)利要求7所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法，其 特征在于，所述真空低溫干燥的條件為真空度一 0. 09 一 0. IMpa，溫度范圍30 50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時(shí)提取蟲草素和蟲草多糖的方法，是利用提取劑對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中的蟲草素和蟲草多糖進(jìn)行提取，同時(shí)使提取液經(jīng)大孔樹脂吸附后再次對(duì)北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提取和吸附；再將吸附在大孔樹脂上的蟲草素和蟲草多糖洗脫下來，洗脫液濃縮干燥后得到的產(chǎn)品中含有蟲草素和蟲草多糖。本方法能從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時(shí)提取蟲草素和蟲草多糖，而且活性成分含量高；樹脂不需經(jīng)過酸堿再生可以重復(fù)使用，環(huán)保，成本低，工藝和設(shè)備簡單，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)提取。
文檔編號(hào)C07H1/08GK101906127SQ20101023513
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者唐亮, 唐永范 申請(qǐng)人:上海國寶企業(yè)發(fā)展中心;上海國寶生物工程研究所