專利名稱：一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物提取領(lǐng)域，涉及一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝。
背景技術(shù)：
毛蘭素(Erianin)，中文系統(tǒng)名3_羥基_4，3’，4’，5’ -四甲氧基聯(lián)芐；分子式 C18H22O5 ；分子結(jié)構(gòu)式如下毛蘭素為聯(lián)芐類化合物，易溶于乙醇、氯仿、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑，極微溶于水。洪衛(wèi)等(毛蘭素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901端粒酶活性的影響.洪衛(wèi)，郭勇，馬勝林， 等.浙江實(shí)用醫(yī)學(xué)，2009，14(3) 181-182.)通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛蘭素能明顯抑制胃癌細(xì)胞 SGC-7901增殖，表現(xiàn)為濃度依賴性，48小時(shí)IC5tl為0. 056 μ g/ml，研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素可以快 速抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的端粒酶活性，8小時(shí)就可見(jiàn)端粒酶活性抑制，48小時(shí)就可以抑 制端粒酶活性的80%，初步觀察表明對(duì)端粒酶活性的抑制與藥物濃度相關(guān)。由于實(shí)驗(yàn)研究 在24小時(shí)這個(gè)時(shí)間點(diǎn)才見(jiàn)到毛蘭素誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡明顯增加，因此， 推斷這種毛蘭素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901端粒酶活性的抑制，可能參與了毛蘭素誘導(dǎo)胃癌細(xì) 胞SGC-7901凋亡的作用機(jī)制，但尚需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。王天山等的研究結(jié)果(鼓槌石斛 中化學(xué)成分對(duì)K562中瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用體外試驗(yàn)，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1997，9 (2) 1-3)表明，聯(lián)芐類和菲類化合物對(duì)體外培養(yǎng)的鼠類L121tl微管蛋白的聚集及有絲分裂、P388 細(xì)胞株、多種人體腫瘤細(xì)胞株如A-549、MCF-7、HT-29、SKMEL-5、MLM、SK-0V-3、HL-60均有 抑制作用。鼓槌石斛中的二氫聯(lián)芐類和菲類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株K526的生長(zhǎng)具有不同程度 的抑制作用，尤以毛蘭素(Erianin、DihydroCombretastatin A-4)的活性最強(qiáng)。李運(yùn)曼等 (毛蘭素誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞的凋亡.李運(yùn)曼，王海燕，劉國(guó)卿.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2001， 22(11) :1022.)研究表明毛蘭素顯著抑制HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)，該抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡和改變HL-60細(xì)胞bcl-2和bax基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。二十世紀(jì)九十年代我國(guó)學(xué)者從石斛中分離提取出毛蘭素，其提取方法是用氯仿或 苯為提取溶媒并用超聲處理30分鐘進(jìn)行提取，提取物再經(jīng)硅膠柱柱層析分離得白色不定 形的毛蘭素結(jié)晶粉末；該方法的缺點(diǎn)是有機(jī)溶媒用量大(是石斛原料的10倍多)，成本 高，時(shí)間長(zhǎng)，而且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。中國(guó)專利申請(qǐng)03115752. 1公開(kāi)了從石斛中提取毛蘭素 的方法，包括應(yīng)用超臨界CO2萃取和柱層析法以無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮等為夾帶劑，以CO2等 位提取介質(zhì)從蘭科植物石斛中提取抗腫瘤成分毛蘭素，對(duì)所得的粗提物再以石油醚醋酸乙酯溶液為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱柱層析分離及重結(jié)晶等步驟獲得精提物；由于上述提取方法 對(duì)技術(shù)要求較高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的小足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素 的工藝。本發(fā)明從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于包括以下步驟(1)制備乙酸乙酯總提取物取鼓槌石斛藥材粉碎，用3-8倍藥材質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡2-7天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A ；將提取后的藥渣用其2-6倍質(zhì)量的乙 醇微波提取5-30分鐘，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，濃縮得浸膏，用2-3倍體積的 乙酸乙酯萃取浸膏3-6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B ；將上述A、B兩部分乙酸乙酯液合 并，于85-90°C條件下蒸餾至流浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物；(2)柱層析分離將上述乙酸乙酯總提物用其2-5倍量的150-300目氧化鋁拌樣， 進(jìn)行氧化鋁柱層析，先以水洗至洗出液近無(wú)色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一 種或兩種以上組合的混合溶液系統(tǒng)梯度洗脫，收集流分，同時(shí)用硅膠薄層層析檢識(shí)，合并收 集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥得毛蘭素。步驟⑴所述提取過(guò)程中所用乙醇為體積百分比為70-99%的乙醇溶液。步驟(1)所述微波輔助提取過(guò)程中微波功率為200-500W。步驟⑴所述乙醇提取液濃縮過(guò)程中濃縮條件為溫度60_65°C，真空度為 0.06-0. IMpa0步驟(2)所述氧化鋁為中性氧化鋁，柱徑高比為1 5-10。步驟(2)所述洗脫溶劑為丙酮、甲醇或乙醇中的一種，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油醚-氯仿-丙酮(98 85 2 10 2 8)。本發(fā)明從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，提取方法簡(jiǎn)單、提取率高，氧化鋁柱分離 效果好，產(chǎn)品純度高，可達(dá)97%以上。本發(fā)明提取的毛蘭素可為開(kāi)發(fā)應(yīng)用新一代天然來(lái)源的抗腫瘤藥物開(kāi)拓了新徑。下面將結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限 于下列實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 將從云南采購(gòu)的鼓槌石斛干燥品粉碎，取Ikg用6倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡4天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用3倍量90 %乙醇于400W微波提取10分鐘，提取3次，常壓過(guò)濾，收集乙醇提取液， 合并，于65°C條件下減壓(真空度為0. 09Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于80°C條件下 真空(真空度為0. 095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其3倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層
4析(徑高比為1 7)，石油醚-氯仿-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素15g，純度為98. 57%。實(shí)施例2 將從云南采購(gòu)的鼓槌石斛干燥品粉碎，取2. 5kg用7倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡6天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)3次，合并提取液A。將第三次提取 后的藥渣用4倍量95%乙醇于350W微波提取15分鐘，提取3次，常壓過(guò)濾，收集乙醇提取 液，合并，于62°C條件下減壓(真空度為0.085Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于85°C條 件下真空(真空度為0. 095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 6)，石油醚-氯仿系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收試劑，濃縮析晶，乙醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素37. lg，純度為98. 35%。實(shí)施例3 將從云南采購(gòu)的鼓槌石斛干燥品粉碎，取5kg用8倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡5天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用4倍量90 %乙醇于350W微波提取20分鐘，提取2次，常壓過(guò)濾，收集乙醇提取液， 合并，于60°C條件下減壓(真空度為0. 090Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量的乙 酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于90°C條件下 真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 5)，石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf = 0.2-0.6 相同流分，回收試劑，濃縮析晶，乙醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素72g，純度為97. 83%。實(shí)施例4 將從云南采購(gòu)的鼓槌石斛干燥品粉碎，取8kg用6倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯室 溫浸泡5天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)2次，合并提取液A。將第二次提取后 的藥渣用3倍量85 %乙醇于350W微波提取12分鐘，提取3次，常壓過(guò)濾，收集乙醇提取液， 合并，于65°C條件下減壓(真空度為0. 078Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏2倍量的乙 酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于85°C條件下 真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。將上述乙酸乙酯總提物用其5倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 10)，石油醚-氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素120g，純度為98. 47%。實(shí)施例5:將從云南采購(gòu)的鼓槌石斛干燥品粉碎，取12. 5kg用5倍鼓槌石斛質(zhì)量的乙酸乙酯 室溫浸泡5天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A，重復(fù)3次，合并提取液A。將第三次提取 后的藥渣用4倍量95%乙醇于280W微波提取23分鐘，提取2次，常壓過(guò)濾，收集乙醇提取 液，合并，于63°C條件下減壓(真空度為0. 086Mpa)濃縮得乙醇浸膏，用相當(dāng)于浸膏3倍量 的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液B，合并A、B兩部分乙酸乙酯萃取液，于90°C條 件下真空(真空度為0.095Mpa)濃縮得浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物。
將上述乙酸乙酯總提物用其4倍量的150-300目的氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層 析(徑高比為1 9)，石油醚-氯仿-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf = 0. 2-0. 6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇反復(fù)重結(jié)晶得毛蘭素181g，純度為98. 24%。
權(quán)利要求
一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其工藝包括以下步驟(1)制備乙酸乙酯總提取物取鼓槌石斛藥材粉碎，用3 8倍藥材質(zhì)量的乙酸乙酯室溫浸泡2 7天，常壓過(guò)濾，收集乙酸乙酯提取液A；將提取后的藥渣用其2 6倍質(zhì)量的乙醇微波提取5 30分鐘，收集乙醇提取液，合并得乙醇提取液，濃縮得浸膏，用2 3倍體積的乙酸乙酯萃取浸膏3 6次，收集、合并乙酸乙酯萃取液B；將上述A、B兩部分乙酸乙酯液合并，于85 90℃條件下蒸餾至流浸膏，自然揮干，得乙酸乙酯總提物；(2)柱層析分離將上述乙酸乙酯總提物用其2 5倍量的150 300目氧化鋁拌樣，進(jìn)行氧化鋁柱層析，先以水洗至洗出液近無(wú)色，再以石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一種或兩種以上組合的混合溶液系統(tǒng)梯度洗脫，收集流分，同時(shí)用硅膠薄層層析檢識(shí)，合并收集Rf＝0.2 0.6相同流分，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥得毛蘭素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述提取過(guò)程中所用乙醇為體積百分比為70-99%的乙醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述微波輔助提取過(guò)程中微波功率為200-500W。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(1) 所述乙醇提取液濃縮過(guò)程中濃縮條件為溫度60-65°C，真空度為0. 06-0. IMpa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(2) 所述氧化鋁為中性氧化鋁，柱徑高比為1 5-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于步驟(2) 所述洗脫溶劑為丙酮、甲醇或乙醇中的一種，或石油醚-丙酮(98 90 2 10)、石油 醚-氯仿(98 80 2 20)、石油醚-氯仿-甲醇(98 85 2 10 2 8)、石油 醚_氯仿_丙酮(98 85 2 10 2 8)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從鼓槌石斛中提取毛蘭素的工藝，其特征在于通過(guò)浸漬提取和微波輔助提取的方法制備鼓槌石斛乙酸乙酯提取物；再經(jīng)與氧化鋁拌樣上柱層析，有機(jī)溶劑洗脫，硅膠薄層層析檢識(shí)，收集Rf＝0.2-0.6相同流分，回收試劑，濃縮析晶，甲醇或丙酮重結(jié)晶，干燥即得毛蘭素。本發(fā)明提取的化合物為開(kāi)發(fā)應(yīng)用新一代天然來(lái)源的抗腫瘤藥物開(kāi)拓了新途徑。
文檔編號(hào)C07C41/36GK101973857SQ20101023581
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者劉東鋒, 楊成東, 郭琴 申請(qǐng)人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司