專利名稱：一種新的海洋疣孢菌菌株及其應用的制作方法
一種新的海洋疣孢菌菌株及其應用
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應用，尤其涉及一種新的海洋疣孢菌菌株FIM06031 及應用其產生的抗腫瘤活性先導化合物FW03104。
背景技術：
疣孢菌屬(Verrucosispora)最早分自沼澤淤泥，屬于放線菌目小單孢菌科 (Micromonosporaceae)，因孢子表面有疣狀突起而得名，隨培養(yǎng)時間增長，孢子表面的 疣會變?yōu)槊l(fā)狀，革蘭氏陽性，不抗酸，嚴格好氧，化能異養(yǎng)菌，基絲發(fā)達，分枝有隔，直 徑0. 4 μ m，產生單個不游動孢子。已報道的疣孢菌屬菌種很少，菌種大部分來自于海洋、 紅樹林。來源于疣孢菌屬菌種的次級代謝產物的研究報道少。2004年德國TUbingen大 學Bister等從疣孢菌AB-18-032次級代謝產物中得到了結構新穎的多環(huán)聚酮類抗生素 abyssomicinB D，其中abyssomicin C強烈抑制革蘭氏陽性菌的生長，甚至可以抑制耐甲 氧西林金葡菌(MRSA)的生長。2008年德國TUbingen大學Fiedler等從疣孢菌MG-37中發(fā) 現新型抗腫瘤的呋喃衍生物Proximicin A，B和C。Proximicins在結構上含有4-氨基呋 喃-2-羧酸，是一種新發(fā)現的Y-氨基酸。Proximicins抗菌活性較弱，但具有很強的針對 腸道上皮腫瘤細胞、乳腺癌、肝癌的抗腫瘤活性，正被作為新的抗癌候選藥物進行深入地研 究和開發(fā)。

發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種新的海洋疣孢菌菌株FIM06031，該疣孢 菌菌株FIM06031于2010年6月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏編號為CGMCC N0. 3924，且通過提取分離該新菌株的發(fā)酵液獲得一種能夠抑制腫 瘤的萜類先導化合物。本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的本實驗室從東海福建莆田平海海域的海綿中分離到幾十株共附生放線菌，并篩選 到一株抗腫瘤活性很好的放線菌。通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化特性和16S rRNA基因系統(tǒng) 進化分析，將其鑒定為疣孢菌屬的一個菌株。進一步地，從該菌株的發(fā)酵液中分離到一個具有細胞毒活性很強的結構新穎的萜 類化合物FW03104，該萜類化合物FW03104的化學結構式為
4 進一步地，該萜類化合物FW03104具有下述物理化學性狀(1)顏色和外觀白色無定形粉末；(2)分子式=C23H32O3 ；(3)高分辨電噴霧質譜(HR-ESI-MS)測量值m/z379. 2249 [M+Na] +理論值:m/z379. 2351 [M+Na]+ ；(4) 1H 核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 4. 54 (dd)，1. 03，1. 79，1. 41，1. 76，1. 92 (m)，1. 49，1. 94，1. 11，1. 84， 1. 75 (s) ,4. 71(d), 0. 94 (s)，1. 15 (s)，3. 38 (s) ,7. 36,7. 31,7. 50 ；(5) 13C 核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 83. 0,41. 7,72. 0,54. 1,26. 2,26. 8,27. 6,47. 2,41. 4,39. 5，151. 6,21. 5， 108. 9，14. 5,22. 5，173. 3,49. 9，135. 9，130. 4，129. 6，128. 1 ；(6)溶解度溶于甲醇，丙酮，乙腈，乙酸乙酯和二甲亞砜；微溶于正己烷和石油 醚；不溶于水。進一步地，所述萜類化合物FW03104制備方法的具體步驟為(1)制備疣孢菌FIM06031的發(fā)酵液首先將一鉬環(huán)疣孢菌FIM06031淀粉天冬素 瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，溫度35°C，轉速240rpm/min，培養(yǎng)時間45h，然后按10% 移種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度28°C，轉速240rpm/min，振蕩培養(yǎng)96 120h ；(2)提取將經步驟(1)培養(yǎng)所得的疣孢菌FM06031菌株發(fā)酵液通過4500rpm離 心15min后，把獲得的菌絲渣用2倍體積的95%乙醇浸泡2次，浸泡液減壓濃縮，濃縮液用 等量體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物；(3)分離將步驟⑵獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，以環(huán)己烷丙酮溶劑梯 度洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經C18反相柱層析，以甲醇 水梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經S印hadex LH-20凝膠 柱層析，以丙酮洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經正相硅膠柱 層析，以氯仿甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，得到對腫瘤細胞具有細胞毒活性的萜類化合物FW03104純品。進一步地，所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨 0. 5%,酵母粉 0. 5%,MgSO4 ·7H20 0. 05%,NaCl 0. 05%, (NH4)2S040 . 05%，CaCO3O. 1%,50% 陳海水配制，pH 7. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4%，葡萄糖0. 5 %，黃豆餅粉2. 5%，酵母粉 0. 5%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, K2HPO4O. 05%, CaCO3O. 1%,50%陳海水配制，ρΗ7· 8。本發(fā)明的有益效果在于提供了 一種分離自海綿的海洋疣孢菌菌株FIM06031，并 且提供了從該疣孢菌菌株發(fā)酵液中提取分離得到萜類化合物FW03104的方法，該萜類化合 物FW03104對腫瘤細胞具有細胞毒活性，該發(fā)明為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化 合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。

下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。圖1是本發(fā)明一種新的海洋疣孢菌菌株FIM06031及最接近的典型種的基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹的示意圖。圖2是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的氫核磁共振圖譜。圖3是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的碳核磁共振圖譜。圖4是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的異核多鍵相關圖譜。圖5是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的氫氫化學位移相關二維圖譜。圖6是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的異核單量子相干圖譜。圖7是本發(fā)明中萜類化合物FW03104的135度無畸變極化轉移增益圖譜。
具體實施方式
本發(fā)明一種新的海洋疣孢菌菌株FIM06031是從東海福建莆田平海海域的海綿中 分離、篩選并通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化特性和16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析鑒定獲得的。 另外，從該疣孢菌菌株FIM06031發(fā)酵液中提取分離獲得一種對三種腫瘤細胞HepG2、EC109 和HeLa均具有細胞毒活性的萜類化合物FW03104純品。1.該菌株FIM06031的分離(1)將10克海綿(未定名，2006年6月采集自我國東海福建莆田平海海域)用無 菌水清洗3遍，剪刀減碎，加入無菌陳海水30mL于無菌研缽研磨3-5分鐘，制成海綿懸液， 取部分海綿懸液用陳海水稀釋成KT1和10_2倍；(2)分別取原液及稀釋過的海洋生物樣品懸液0. ImL涂布于淀粉天冬素分離瓊脂 平板上，平板于32°C下培養(yǎng)7-20d ；(3)肉眼觀察上述已培養(yǎng)的分離瓊脂平板，菌落形態(tài)類似(菌落圓形、隆起、小、光 滑)，菌落在培養(yǎng)初期為橙色，隨培養(yǎng)時間延長轉變?yōu)樽厣⒑谏?，挑取放線菌單菌落轉接于 淀粉天冬素瓊脂斜面培養(yǎng)基，于32°C下培養(yǎng)10-15d，共獲得47株放線菌，通過菌株抗腫瘤 活性初篩，獲得一株發(fā)酵產物具有顯著抗腫瘤活性的菌株FIM06031。其中，淀粉天冬素分離瓊脂的組分為可溶性淀粉2%，L-天冬素0.5%， KNO3O. 1 %，K2HPO4 · 3H20 0. 05 %, NaCl 0. 05 %, MgSO4 · 7H20 0. 05 %, CaCO3O. 1 %，K2Cr2O7O. 005%，多菌靈(含 50%苯丙咪唑)0· 1%，瓊脂 1. 5%, pH7. 5 ；淀粉天冬素瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉2%，L-天冬素0.05%， KNO3O. 1 %，K2HPO4 · 3H20 0. 05 %, NaCl 0. 05%, MgSO4 · 7H20 0. 05 %, CaCO3O. 1 %，瓊月旨 1. 8%, pH7. 5。2.該菌株FIM06031的鑒定(1)將菌株FIM06031的斜面培養(yǎng)物劃線于高氏天冬素瓊脂平板斜插蓋玻片于 32°C下培養(yǎng)5-20天，觀察氣絲、基絲及色素；取出蓋玻片用光學顯微鏡觀察，電子顯微鏡下 觀察孢子形態(tài)及外觀；培養(yǎng)特征和生理生化特性采用國際鏈霉菌計劃推薦的培養(yǎng)基進行培 養(yǎng)、觀察和描述；菌株FIM06031孢子單個著生在孢子梗上，孢子表面有疣狀突起；在無機培 養(yǎng)基上孢子少，在有機培養(yǎng)基上生長良好，在20-40°C均可生長(最適生長溫度35°C )，45°C 以上不生長；能液化明膠、凝固胨化牛奶；能利用蔗糖、麥芽糖、淀粉、D-葡萄糖、D-木糖和 D-甘露糖等，不利用蜜二糖、鼠李糖、棉籽糖、松三糖、D-果糖、山梨醇和肌醇等；不水解纖 維素；(2)菌株FIM06031基因組DNA采用酶解法提取，得到的DNA樣品儲存于_20°C，將 該DNA樣品作為DNA模板進行16S rRNA基因PCR擴增，PCR產物送北京三博公司測序；將 所測得的菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中已有序列進行比對，及進行同源性分 析；在LPSN(http://www. bacterio. cict. fr)網站上選取相應的模式株16S rRNA基因序 列，系統(tǒng)進化分析用CLUSTAL-X軟件進行比對，生成的比對文件用TREEC0N軟件鄰接法進行 系統(tǒng)進化分析，拓撲分析為1000次重復取樣的結果；結果發(fā)現菌株FIM06031與稀有放線 菌撫抱菌屬(Verrucosispora)發(fā)表生效的模式菌株 Verrucosispora gifhornensis DSM 44337τ的同源性最高，相似性99. 78%，與疣孢菌Verrucosispora sp. AB-18-032相似性最 高達 99. 85% ；(3)綜上得知，菌株FIM06031為疣孢菌屬(Verrucosispora)的一個菌株，定名為 Verrucosispora sp. FIM06031。另外，菌株FIM06031 的 16S rRNA基因部分序列長 1375bp， 在DNA數據庫GenBank登錄號為EU696742。其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。3.萜類化合物FW03104制備方法的具體步驟為(1)制備疣孢菌FIM06031的發(fā)酵液首先將一鉬環(huán)疣孢菌FIM06031淀粉天冬素 瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，溫度35°C，轉速240rpm/min，培養(yǎng)時間45h，然后按10% 移種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度28°C，轉速240rpm/min，振蕩培養(yǎng)96 120h ；其中，種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，酵母 粉 0. 5%，MgS04 ·7Η20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4)2S040 . 05%，CaCO3O. 1 %，蒸餾水配制，ρΗ 7. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4%，葡萄糖0. 5 %，黃豆餅粉2. 5%，酵母粉 0. 5%, MgSO4 ‘ 7Η20 0. 05%，K2HPO4O. 05%，CaCO3O. 1%，蒸餾水配制，ρΗ 7.8;(2)提取將經步驟(1)培養(yǎng)所得的疣孢菌FM06031菌株發(fā)酵液通過4500rpm離 心15min后，把獲得的菌絲渣用2倍體積的95%乙醇浸泡2次，浸泡液減壓濃縮，濃縮液用 等量體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物；(3)分離將步驟⑵獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，以環(huán)己烷丙酮溶劑梯 度洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經C18反相柱層析，以甲醇水梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經Sephadex LH-20凝膠 柱層析，以丙酮洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經正相硅膠柱 層析，以氯仿甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，得到萜類化合物FW03104純品，從外形 上看，其為白色無定形粉末。4.通過MS和匪R技術鑒定萜類化合物FW03104的結構高分辨電噴霧質譜(HR-ESI-MS)測量值m/z379. 2249 [M+Na] +理論值m/z379. 2351 [M+Na] +1H 核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 4. 54 (dd)，1. 03，1. 79，1. 41，1. 76，1. 92 (m)，1. 49，1. 94，1. 11,1. 84， 1. 75 (s) ,4.71(d), 0. 94 (s)，1. 15 (s)，3. 38 (s)，7. 36，7. 31，7. 50 (見圖 2)；13C 核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 83. 0,41. 7,72. 0,54. 1,26. 2,26. 8,27. 6,47. 2,41. 4,39. 5，151. 6,21. 5， 108. 9，14. 5，22. 5，173. 3,49. 9，135. 9，130. 4，129. 6，128. 1 (見圖 3)；同時，本發(fā)明還測定了該化合物多種核磁共振圖譜(見圖4至圖7)，從而確定了該 化合物所有的碳原子和氫原子的歸屬及該化合物的化學結構，確定其為結構新穎的萜類化 合物，結構式如下5.對萜類化合物FW03104進行體外抗腫瘤試驗本實施例對萜類化合物FW03104進行了體外抗腫瘤試驗，表明其具有顯著的抑制 腫瘤的作用。試驗所用菌株為國際通用的腫瘤細胞株，即EC109(食管癌細胞)；HepG2 (肝癌細胞)；HeLa (宮頸癌細胞)。
具體實施例方式分別取對數生長期的腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調細胞 懸液密度至IX IO5 4X IO5個/mL,按IOOyL/孔接種于96孔板，于5% C02、37°C條件下
培養(yǎng)24h ；將培養(yǎng)孔內的培養(yǎng)基吸凈，每孔加入100 μ L已配制好的相應濃度的含藥物的培 養(yǎng)液，同時設對照和空白(對照和空白按照最高濃度的藥物中的甲醇的百分比配制)，此時 培養(yǎng)基血清濃度為2%，于5% C02、37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)；在培養(yǎng)24h，48h和72h后，分別 取出相應的孔板，倒置顯微鏡下觀察，并拍下細胞的形態(tài)圖；72h后每孔加入MTT液(5mg/ ml) 10 μ L，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3-4h ；吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μ L的DMS0，在脫色搖床上 搖動(約IOmin)溶解結晶；選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值，記 錄結果。按如下公式計算藥物對腫瘤細胞抑制率腫瘤細胞生長抑制率(IC) = (OD對照組-OD實驗組)/OD對照組*100%。腫瘤細胞生存率=OD實驗組/OD對照組*100%。用SPSS軟件分析半數致死濃度IC5(1。試驗結果見表1表1FW03104對腫瘤細胞的抑制作用
腫瘤細胞H印G2EC109HeLaIC50(UM)16. 9925. 3334. 64萜類化合物FW03104在高濃度時可以引起細胞死亡，隨濃度的降低，對腫瘤細胞 生長的抑制作用減弱。從該萜類化合物的體外抗腫瘤活性試驗表明其有很強的抗腫瘤活性，因而為研 究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。另外，本發(fā)明中所涉及到的各培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比，除此之外，其它 的百分比均為體積比。
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權利要求
一種新的海洋疣孢菌菌株，其特征在于所述海洋疣孢菌菌株為疣孢菌FIM06031(Verrucosispora sp.FIM06031)，于2010年6月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.3924。
2.一種抑制腫瘤的萜類化合物FW03104，其特征在于所述萜類化合物FW03104是通過 分離提取疣孢菌FIM06031的發(fā)酵液獲得的，該萜類化合物FW03104的化學結構式為
3.如權利要求2所述抑制腫瘤的萜類化合物FW03104，其特征在于其具有下述物理化 學性狀(1)顏色和外觀白色無定形粉末；(2)分子式=C23H32O3；(3)高分辨電噴霧質譜(HR-ESI-MS)測量值:m/z 379. 2249[M+Na] +理論值:m/z 379. 2351 [M+Na]+ ；(4)1H核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 4. 54 (dd)，1. 03，1. 79，1. 41，1. 76，1. 92 (m)，1. 49，1. 94，1. 11，1. 84，1. 75 (s)， 4. 71(d)，0. 94 (s), 1. 15 (s)，3. 38 (s)，7. 36，7. 31，7. 50 ；(5)13C 核磁共振波譜(MEOD，400MHz)δ (ppm) 83. 0,41. 7,72. 0,54. 1,26. 2,26. 8,27. 6,47. 2,41. 4,39. 5，151. 6,21. 5, 108. 9，14. 5,22. 5，173. 3,49. 9，135. 9，130. 4，129. 6，128. 1 ；(6)溶解度溶于甲醇，丙酮，乙腈，乙酸乙酯和二甲亞砜；微溶于正己烷和石油醚；不 溶于水。
4.如權利要求2所述抑制腫瘤的萜類化合物FW03104，其特征在于其制備方法的具體 步驟為(1)制備疣孢菌FIM06031的發(fā)酵液首先將一鉬環(huán)疣孢菌FIM06031淀粉天冬素瓊脂 斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，溫度35°C，轉速240rpm/min，培養(yǎng)時間45h，然后按10%移種 量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度28°C，轉速240rpm/min，振蕩培養(yǎng)96 120h ；(2)提取將經步驟(1)培養(yǎng)所得的疣孢菌FIM06031菌株發(fā)酵液通過4500rpm離心15min后，把獲得的菌絲渣用2倍體積的95%乙醇浸泡2次，浸泡液減壓濃縮，濃縮液用等 量體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得浸膏狀提取物；(3)分離將步驟(2)獲得的提取物采用正相硅膠柱層析，以環(huán)己烷丙酮溶劑梯度洗 脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經C18反相柱層析，以甲醇水梯 度洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經S印hadex LH-20凝膠柱層 析，以丙酮洗脫，薄層層析檢測，收集含萜類化合物FW03104的流份；再經正相硅膠柱層析， 以氯仿甲醇溶劑梯度洗脫，薄層層析檢測，得到對腫瘤細胞具有細胞毒活性的萜類化合 物FW03104純品。
5.如權利要求4所述抑制腫瘤的萜類化合物FW03104，其特征在于 所述種子培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉1.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，酵母粉 0. 5%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%, (NH4)2S040 . 05%, CaCO3O. 1%,50%陳海水配制， pH 7. 5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為可溶性淀粉4%，葡萄糖0.5%，黃豆餅粉2.5%，酵母粉0.5%， MgSO4 · 7H20 0. 05%, K2HPO4 0. 05%, CaCO3 0. 1%，50%陳海水配制，pH 7. 8。
全文摘要
本發(fā)明從海綿中分離并篩選到一株抗腫瘤活性很好的放線菌，該放線菌為海洋疣孢菌菌株FIM06031(Verrucosispora sp.FIM06031)，并且提供了從該疣孢菌菌株FIM06031發(fā)酵液中提取分離得到對腫瘤細胞具有細胞毒活性的萜類化合物FW03104的方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。
文檔編號C07C67/48GK101921721SQ201010242600
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權日2010年8月2日
發(fā)明者林如, 江紅, 聶毅磊, 連云陽, 鄭衛(wèi) 申請人:福建省微生物研究所