專利名稱：一種檢測轉(zhuǎn)基因作物的蛋白質(zhì)芯片試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于轉(zhuǎn)基因成分和蛋白質(zhì)芯片的一種快速檢測轉(zhuǎn)基因作物的方法，尤 指在反應(yīng)中一次并行檢測5種商業(yè)化轉(zhuǎn)基因成分的蛋白質(zhì)芯片方法和試劑盒。已有的專利 是利用ELISA試紙條方法進(jìn)行檢測，每種成分都需要檢測一次，耗費(fèi)時間，不利于現(xiàn)場快速 檢測。我們通過選擇商品化的轉(zhuǎn)基因成分的蛋白質(zhì)的抗體，將其作為探針固定于修飾過的 支持物上，將待檢成分經(jīng)前處理后加入到芯片矩陣中，再加入標(biāo)記的抗體，采用激光共聚焦 掃描儀對結(jié)果進(jìn)行檢測，可一次性直接確定待檢的樣品中有無需要檢測的成分，結(jié)果判讀 直觀、明確、快速，而且操作簡單、快速。適用于對商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物的簡單、快速檢測，可用 于檢測機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室對于進(jìn)出口商品的標(biāo)識復(fù)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因育種研究單位對轉(zhuǎn)基因作物田間快 速篩查等，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)使開發(fā)農(nóng)作物新品種的時間大為縮短，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育 出了抗除草劑、抗干旱、耐鹽堿、抗重金屬和抗病蟲害、營養(yǎng)價值高的品種，這對于提高糧食 產(chǎn)量、減少收獲后損失以及增加農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)價值具有重要作用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，越 來越多的轉(zhuǎn)基因作物新品種被培育出來。多個國家和地區(qū)相繼批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入商業(yè) 化生產(chǎn)，種植面積急劇擴(kuò)大。然而轉(zhuǎn)基因作物在帶來巨大社會和經(jīng)濟(jì)效益的同時也存在許 多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對生態(tài)環(huán)境的安全性方面。轉(zhuǎn)基因食品對人類健康及生態(tài)環(huán)境的潛在影響日益受到人們的普遍關(guān)注，轉(zhuǎn)基因 食品的安全性不容忽視。世界各國都在加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因食品的管理，美國、歐盟、日本、加拿大 都已制定了對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)識管理的法規(guī)，歐盟(EC)49/2000號條例規(guī)定食品中 含有超過的轉(zhuǎn)基因成分時，必須在標(biāo)簽上做出標(biāo)識。為了加強(qiáng)對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售 行為，引導(dǎo)和保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，2002年中國農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦 法》，2006年通過了《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》，明確規(guī)定在中國境內(nèi)銷售列入標(biāo) 識的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進(jìn)行是否含有轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識。轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)識管理必 須以有效的檢測方法為基礎(chǔ)。因此，建立針對轉(zhuǎn)基因作物快速檢測方法具有十分重要的現(xiàn)
眉、ο目前國際上，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品采取的主要檢測方法是建立在核酸水平上的PCR檢 測，包括競爭 PCR(competitive PCR)、實(shí)時定量 PCR(Real-time PCR)、PCR-ELISA 方法；建 立在蛋白質(zhì)水平上的Western印記、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫試紙條的檢測方 法。由于這些方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；不適合于現(xiàn)場實(shí)時檢測和跟蹤檢測； 檢測成本過高；對檢驗(yàn)人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高等不足之處，方法較難普 及。蛋白芯片的技術(shù)原理最早由Roger Ekin在上世紀(jì)80年代提出，它將大量蛋白質(zhì) 分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對生物分子準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測，使用 5種抗體固定于基片上，可特異性結(jié)和需檢測的轉(zhuǎn)基因蛋白成分，相比于ELISA及試紙條方 法，具有高通量、檢測時間更短的特點(diǎn)，因此在轉(zhuǎn)基因檢測上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。本發(fā)明首次基于以商品化轉(zhuǎn)基因成分和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因蛋白芯片檢 測技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測，提供了針對商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物成分的蛋白質(zhì)芯片、試劑 盒和檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高的檢測轉(zhuǎn)基因作物 的蛋白質(zhì)芯片。本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準(zhǔn)確、便于結(jié)果判定的檢測轉(zhuǎn)基因作物的檢測 試劑盒(基于蛋白質(zhì)芯片)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案選擇以商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因成分的蛋白質(zhì)作為抗原，以抗原抗體免疫反應(yīng) 為基礎(chǔ)，設(shè)計相應(yīng)的抗體成分。一組檢測轉(zhuǎn)基因作物的蛋白質(zhì)抗體，如下l)Bt crylAc/Ab 單克隆抗體DClO DB22) Bt cryIAh 單克隆抗體CBlO DClO3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab01 Ab024)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉(zhuǎn)基因成分Bt cry lAc/Ab, Bt cry IAh和植酸酶 蛋白質(zhì)的單克隆抗體對，抗體4)和5)為檢測轉(zhuǎn)基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白質(zhì)和耐 鹽IrrE蛋白質(zhì)的多克隆抗體；作為二次結(jié)合的抗體，使用熒光素標(biāo)記。我們采用蛋白芯片檢測技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因作物檢測方法，對反應(yīng)的各種條件進(jìn)行 了優(yōu)化，其中包括基片修飾的優(yōu)化，點(diǎn)樣緩沖液的優(yōu)化，點(diǎn)樣濃度的優(yōu)化，標(biāo)記二抗使用濃 度的優(yōu)化，熒光素與二抗標(biāo)記的比例優(yōu)化，封閉條件的優(yōu)化。檢測轉(zhuǎn)基因成分的蛋白質(zhì)芯片設(shè)計方案為4行六列，每點(diǎn)3個重復(fù)，點(diǎn)間距為450 微米，一張芯片12個點(diǎn)陣。點(diǎn)陣分布如下表所示 1)抗體來自中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所2)質(zhì)量體系控制點(diǎn)(QC)為Cy3標(biāo)記的BSA3)空白對照(BC)為點(diǎn)樣緩沖液和IXPBS4)陰性對照(NC)為10mg/ml的BSA溶液由于基片修飾、點(diǎn)樣緩沖液、點(diǎn)樣濃度、樣品和基片反應(yīng)條件、封閉液、清洗液以及反應(yīng)時間對芯片反應(yīng)后信號強(qiáng)度有一定影響，通過優(yōu)化，確定了最佳芯片制作體系，見下表。表2建立的芯片制作和反應(yīng)體系 6)芯片掃描條件使用共聚焦激光掃描儀，設(shè)置合適的參數(shù)。試劑盒成分有l(wèi))Bt (巧認(rèn)(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶 PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，6)檢測用蛋 白質(zhì)芯片7)熒光素，8)清洗液本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)快速檢測時間僅為1. 5-2小時；2)特異由于采用了蛋白質(zhì)抗原抗體特異性結(jié)合，每種抗體重復(fù)點(diǎn)制三次，從而 使結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高；3)高通量本發(fā)明能夠同時檢測包括:l)Bt crylAc/Ab蛋白，2)Bt cryIAh蛋白， 3)植酸酶PHY蛋白，4)抗草甘膦G2-EPSPS蛋白，5)耐鹽IrrE蛋白；4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。


圖1是本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片的一種結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片圖1的方陣的陽性圖。圖3是本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片圖1的方陣的陰性圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片，其結(jié)構(gòu)是在平面型支撐載體的平面 上被覆有修飾材料的膜層，在該膜層的表面以點(diǎn)陣方式排布有轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測用的外源 蛋白質(zhì)探針。其中所說的該平面型支撐載體，可以采用目前同類技術(shù)中已有使用的玻璃片、 硅片等材料制成的片狀支持基體中的一種。該平面型支撐載體上被覆的修飾材料的膜層， 可以為環(huán)氧或PSG材料膜層。以點(diǎn)陣方式排布于該膜層表面處的供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品用的蛋白 質(zhì)探針，可以采用平面附著的方式位于所說的該修飾材料膜層的表面，使用接觸式點(diǎn)樣方 式完成這個目的。如圖1所示的可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測的基因芯片中，在常用的玻片、硅片的平 面型支撐載體的平面上，被覆有膜層材料，該膜層材料可以為環(huán)氧或PSG材料膜層中的一種。在該膜層的表面上以平面附著的點(diǎn)陣方式排布有供多種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行判斷用的蛋 白質(zhì)探針，這些探針包括l)Bt (巧認(rèn)(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶 PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體。該點(diǎn)陣方式 排布是每個外源蛋白質(zhì)探針集中于該材料膜層表面處的一個區(qū)域內(nèi)的形式。圖2所示的可用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片的結(jié)構(gòu)是圖1的一個矩陣的結(jié) 構(gòu)放大圖，每個外源蛋白質(zhì)探針平行3個點(diǎn)，以取得準(zhǔn)確的結(jié)果。具體制備方法(一 )可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片的制備將預(yù)先制備好的轉(zhuǎn)基因成分蛋白質(zhì)的抗體稀釋成合適的濃度，按照實(shí)驗(yàn)要求將各 種濃度的抗體和對照以及質(zhì)量控制液按順序排列于384孔板中，用于蛋白質(zhì)芯片的點(diǎn)制； 這些抗體和對照包括l)Bt (巧認(rèn)(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶PHY 單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，6)質(zhì)量控制點(diǎn) (QC), 7)空白對照(BC)，8)陰性對照點(diǎn)(NC)，該5個抗體均使用標(biāo)準(zhǔn)抗體制備方法制得。蛋 白質(zhì)芯片由arrayer (博奧生物芯片公司，中國)機(jī)器手，使用直徑為0. 4mm的針點(diǎn)制，蛋白 質(zhì)芯片載體為環(huán)氧基修飾的玻片，每張芯片上有12個重復(fù)的一級矩陣，每個矩陣為4X6的 二級點(diǎn)陣，每個樣品點(diǎn)在二級陣中平行三次重復(fù)以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。( 二)抗原抗體反應(yīng)及信號檢測將檢測用蛋白質(zhì)芯片置于芯片反應(yīng)盒中，盒下部小孔中滴加數(shù)滴蒸餾水，提供濕 盒反應(yīng)環(huán)境；將抗原蛋白質(zhì)稀釋到適合的濃度，每陣加30μ 1抗原蛋白質(zhì)，濕盒中室溫反應(yīng) 30分鐘；清洗液(PBST)震蕩清洗5分鐘，室溫1500rpm離心甩干；將標(biāo)記好的抗體每陣加 30 μ 1，濕盒中室溫反應(yīng)30分鐘，清洗液(PBST)震蕩清洗5分鐘，室溫1500rpm離心甩干； 激光共聚焦掃描儀掃描，參數(shù)設(shè)置laserpower-PMT-90-600/700，進(jìn)行信號檢測。
權(quán)利要求
一組基于蛋白質(zhì)芯片的檢測轉(zhuǎn)基因作物的抗體成分如下1)Bt cry1Ac/Ab單克隆抗體DC10，2)Bt cry1Ah單克隆抗體CB10，3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab01，4)抗草甘膦G2 EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉(zhuǎn)基因成分Bt cry1Ac/Ab、Bt cry1Ah和植酸酶蛋白質(zhì)的單克隆抗體，抗體4)和5)為檢測轉(zhuǎn)基因成分抗草甘膦G2 EPSPS蛋白質(zhì)和耐鹽IrrE蛋白質(zhì)的多克隆抗體。
2.一種基于蛋白質(zhì)芯片可簡單快速進(jìn)行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)基因作物檢測試劑盒，由以下組 分組成1)BtcrylAc/Ab單克隆抗體2)Bt cryIAh單克隆抗體3)植酸酶PHY單克隆抗體4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體6)檢測用蛋白質(zhì)芯片7)熒光素8)陰性對照稀釋液；9)蛋白質(zhì)芯片
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因作物檢測試劑盒，其特征在于所述檢測抗體名稱為1)BtcrylAc/Ab 單克隆抗體 DB22)Bt cryIAh單克隆抗體DClO3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab024)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉(zhuǎn)基因成分Bt crylAc/Ab.Bt crylAh和植酸酶蛋白 質(zhì)的單克隆抗體，抗體4)和5)為檢測轉(zhuǎn)基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白質(zhì)和耐鹽IrrE 蛋白質(zhì)的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的蛋白質(zhì)芯片。它是在平面型支撐載體的平面上被覆有修飾材料的膜層，在該膜層的表面以點(diǎn)陣方式排布有供轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測用的蛋白質(zhì)抗體探針，這些蛋白質(zhì)抗體探針包括1)Bt cry1Ac/Ab單克隆抗體，2)Bt cry1Ah單克隆抗體，3)植酸酶PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種基于抗原抗體反應(yīng)的可簡單快速進(jìn)行結(jié)果判定的轉(zhuǎn)基因作物檢測芯片試劑盒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)快速檢測時間僅為1.5-2小時；2)特異由于采用了蛋白質(zhì)抗原抗體特異性結(jié)合，每種抗體重復(fù)點(diǎn)制三次，從而使結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高；3)高通量本發(fā)明能夠同時檢測5種商業(yè)化轉(zhuǎn)基因成分的蛋白質(zhì)；4)穩(wěn)定重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示所建立方法的穩(wěn)定性良好。
文檔編號C07K16/16GK101914156SQ201010257618
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者喬彩霞, 凌鳳俊, 劉輝, 吳丹, 周琦, 張偉, 張利峰, 張瑞宏, 張維, 李東燕, 林敏 , 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 賴平安, 邢佑尚, 高志強(qiáng), 齊晶 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所