專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原，特別是涉及一種用于孔雀石綠檢 測(cè)的完全抗原的制備方法。
背景技術(shù)：
由于孔雀石綠獨(dú)特的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其自身不含氨基和羧基，不能為偶聯(lián)提供位點(diǎn)，給 半抗原的偶聯(lián)改造增加了一定的難度，添加氨基時(shí)會(huì)產(chǎn)生臨位、對(duì)位、間位不同產(chǎn)物，從而 導(dǎo)致改造后的產(chǎn)物不均一。難以用于孔雀石綠殘留檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次找到了孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，從而合成完全抗原。它不但能有效的 制得用于孔雀石綠殘留檢測(cè)的免疫原。而且操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高。為了達(dá)到上述目的本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原，所述的完全抗原是用副品紅制備 的。本發(fā)明還提供一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的制備方法，操作如下先將先將牛血清白蛋白、副品紅、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以 摩爾比1 129 5216的比例一一加入到磷酸鹽緩沖液中，在室溫下反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，接著 將反應(yīng)后的液體裝入透析袋中，再放入自來(lái)水中透析48小時(shí)，每12小時(shí)換液一次，最后收 集透析袋內(nèi)的液體，在-20°C中預(yù)冷凍2個(gè)小時(shí)，然后在-50°C下冷凍干燥，制成完全抗原粉 紅色固體粉末。所述的磷酸鹽緩沖液是PH為7. 4，含量為0. 01mol/L的磷酸緩沖液。所述的透析袋是半周長(zhǎng)為22mm，截留分子量為14000的透析袋。由于孔雀石綠獨(dú)特的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其自身不含氨基和羧基，不能為偶聯(lián)提供位點(diǎn)，給 半抗原的偶聯(lián)改造增加了一定的難度，添加氨基時(shí)會(huì)產(chǎn)生臨位、對(duì)位、間位不同產(chǎn)物，從而 導(dǎo)致改造后的產(chǎn)物不均一。本發(fā)明首次找到了孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物副品紅，可以生產(chǎn)均 一的產(chǎn)物用于孔雀石綠檢測(cè)。另外，由于本發(fā)明采用了改進(jìn)的碳二亞胺法，本發(fā)明的完全抗 原的合成過(guò)程只需要50個(gè)小時(shí)左右，這樣使制備過(guò)程得到了簡(jiǎn)化，大大節(jié)約了制備完全抗 原的時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，其效率可提高49%左右。與此同時(shí)采用了自來(lái)水作為透析液， 該方法也降低了生產(chǎn)成本。另外，本發(fā)明制備的完全抗原的比例在20-37之間，由此，為對(duì) 提高孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度有了可靠的保證；并且，還有 利于普及推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員 常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。常用試劑為市售分析純?cè)噭?shí)施例一以下將對(duì)本發(fā)明的一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的制備方法作進(jìn)一步的詳 細(xì)描述。具體步驟如下1、稱(chēng)取9. 6g的氯化鈉、3. 58g十二水磷酸氫二鈉、0. 4g氯化鉀、0. 7g磷酸二氫鉀加 入950ml的蒸餾水，調(diào)節(jié)PH至7. 4，再加入50ml的蒸餾水，配置成1000ml，濃度為0. Olmol/ L的磷酸緩沖液。2、在15ml的離心管中依次加入牛血清白蛋白32mg (0. 48u mol)、副品紅 20mg(61.8u mol)、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽480mg (2503. 8u mol)，再 加入8ml的磷酸緩沖液(PH為7. 4，含量為0. Olmol/L)，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。3、將反應(yīng)好的液體裝入透析袋(半周長(zhǎng)22mm，截留分子量14000)內(nèi)，再放入裝有 自來(lái)水的燒杯中，透析48小時(shí)，每12小時(shí)換自來(lái)水一次。4、將透析好的液體，在_20°C中預(yù)冷凍2個(gè)小時(shí)，然后在_50°C下冷凍干燥，制成完 全抗原粉紅色固體粉末。實(shí)施例二用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的使用及效果(1)采用此合成的完全抗原用于免疫小鼠，免疫劑量為0.25mg/次，免疫四次后進(jìn) 行眼眶取血，利用間接ELISA法，測(cè)得的小鼠血清效價(jià)可達(dá)6. 25X 105，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他抗原免 疫小鼠獲得血清效價(jià)，為后續(xù)的單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。(2)孔雀石綠進(jìn)入魚(yú)體后，24h之內(nèi)98%代謝為無(wú)色孔雀石綠，利用合成的完全抗 原，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢查，可直接檢測(cè)無(wú)色孔雀石綠，避免了其他檢測(cè)方法需將無(wú)色孔雀 石綠重新轉(zhuǎn)化為孔雀石綠，節(jié)省了成本和時(shí)間。(3)采用此合成的完全抗原免疫小鼠，獲得的抗體能有效的檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石 綠及無(wú)色孔雀石綠的殘留，檢出限200ng/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫 殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中0. 5ug/kg的檢出限。
權(quán)利要求
一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原，其特征在于，所述的完全抗原是用副品紅制備的。
2.一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的制備方法，其特征在于，通過(guò)下列方法制 得先將牛血清白蛋白、副品紅、I-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比 1 129 5216的比例一一加入到磷酸鹽緩沖液中，在室溫下反應(yīng)2個(gè)小時(shí)；接著將反應(yīng) 后的液體裝入透析袋中，再放入自來(lái)水中透析48小時(shí)；每12小時(shí)換液一次，最后收集透析 袋內(nèi)的液體；在-20°C中預(yù)冷凍2個(gè)小時(shí)，然后在-50°C下冷凍干燥，制成完全抗原粉紅色固 體粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的制備方法，其特征在于 所述的磷酸鹽緩沖液是PH為7. 4，含量為0. 01mol/L的磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的制備方法，其特征在于 所述的透析袋是半周長(zhǎng)為22mm，截留分子量為14000的透析袋。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原及其制備方法。本發(fā)明首次利用孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物副品紅，進(jìn)行了用于孔雀石綠檢測(cè)的完全抗原的合成。免疫原是由副品紅和牛血清蛋白在室溫條件下，通過(guò)碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，用磷酸緩沖液(pH為7.4，濃度為0.01mol/L)透析后，經(jīng)過(guò)冷凍干燥獲得的。研究表明，該方法不僅成功地合成了可用于制備檢測(cè)孔雀石綠特異抗體的免疫原，同時(shí)采用了新的偶聯(lián)方法、縮短了制備時(shí)間，提高了偶聯(lián)比率。本發(fā)明為開(kāi)發(fā)孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/765GK101948531SQ20101026039
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者付喬芳, 姜有聲, 楊先樂(lè), 符貴紅, 胡鯤, 陳力, 黃宣運(yùn) 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)