專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接elisa方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、動(dòng)物細(xì)菌學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一 種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌病是引起斷奶仔豬發(fā)病和死亡的重要病因之一。副豬嗜血桿菌 (Haemophilus parasuis,HPS)作為豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下侵入機(jī)體可以 引起嚴(yán)重的全身性疾病(Glasser's disease)，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎 為主要特征。此病過(guò)去一直被認(rèn)為是仔豬的一種散發(fā)性、應(yīng)激性疾病。但是，近年來(lái)，隨著養(yǎng) 豬產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，越來(lái)越多的高健康豬群或SPF豬群的出現(xiàn)，如果這些豬處于一種未免疫 狀態(tài)，一旦HPS入侵，就會(huì)受到嚴(yán)重感染，甚至死亡，各種日齡的豬均可感染，且發(fā)病率可達(dá) 50 70%，死亡率可達(dá)10%以上。目前引起副豬嗜血桿菌感染的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚， 一些研究認(rèn)為副豬嗜血桿菌可以并發(fā)或繼發(fā)于藍(lán)耳病、偽狂犬病、細(xì)小病毒病、圓環(huán)病毒病 和豬瘟等疾病。近年來(lái)，副豬嗜血桿菌病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的主要細(xì)菌性疾病，危害 日漸嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。早期、準(zhǔn)確地做出診斷并進(jìn)行疫苗預(yù)防是控制該病的重 要手段，但副豬嗜血桿菌血清型眾多，而且流行的副豬嗜血桿菌血清型通常為毒力較強(qiáng)的 血清型，如血清5型、4型和13型等。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的HPS的檢測(cè)方法有16SrRNA PCR,Southern雜交、補(bǔ)體結(jié)合試 驗(yàn)(CF)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)和ELISA等。然而，基于檢測(cè)其DNA的PCR和Southern雜交 方法很難應(yīng)用于實(shí)踐，而CF也有參與反應(yīng)的成分多、影響因素復(fù)雜、操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)， IHA和ELISA方法是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的主要HPS抗體檢測(cè)方法，所不同的是抗原的制備 方法，而馮小明(2009)、石碧(2007)等用超聲破碎抗原和莢膜多糖作為包被抗原的建立的 間接ELISA方法結(jié)果證明，ELISA的敏感性比IHA高。目前國(guó)內(nèi)外常用脂多糖、LPS、滅活的 全菌體作為包被抗原進(jìn)行ELISA，檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定并且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性，或是還未驗(yàn)證其 符合率和敏感性。因此，仍然需要建立一種快速、簡(jiǎn)便以及特異性高的檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗 體的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌 抗體的間接ELISA方法。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)上述間接ELISA方法的試劑盒。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA 方法，是將副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)OMP P5蛋白作為包被抗原；所述副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的氨基酸序列如下所示MKKSLIALAVSGLAVASVAQA APQANTFYVGAKAGWATFHNDINQIDSKYANDARYDATNLKYGISRNSVTYGVFGGYQIIDNLAVELGYDYFGRVRGNKQEFRAFKHSAHGTHLSLKPSYEVLNGLDVYGKVGAALVRNDYKRYSQTAGVQTQKAHNLKTSLVLGAGVEYAILP ELAFRVEYQWLSRVGNANKAAQKRGDTAMFGPGSTYSPDAHSVSAGISYRFGQGAAPVVAAPEVVTKNFAFSSDVLF DFGKANLKPAAAQTLDAVHTEIVNLGLANPAVQVNGYTDRIGKDAANLTLSQKRAETVANYIVSKGVNPANVTAVGY GEANPVTGNTCDAVKGRKALITCLAPDRRVEIQVQGSKEVSM所述的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白優(yōu)選通過(guò)基因工程方法得到，具體如下(1)將如下所示的副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列通過(guò)表達(dá)載體pET_32a(+)的 多克隆位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)中，得到pET-32a(+)-0MP P5質(zhì)粒；其中，該副豬嗜 血桿菌OMP P5核苷酸序列的5’端位于表達(dá)載體pET_32a(+)中的Trx Taq編碼序列的3’ 端；(副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列atgaaaaaatctttaattgcattagcagtatcaggtttagcagttgcttctgtagctcaagctgctcca caagctaacactttctatgtaggtgctaaagctggttgggcaacattccacaatgatattaaccaaattgactctaa gtatgctaatgatgcacgttatgatgctactaatttaaaatatggcattagccgtaactctgtaacttacggtgtgt ttggtggttaccaaattattgacaacttagcagttgaattaggttacgattatttcggtcgtgttcgtggtaacaaa caagaattccgtgcattcaaacactctgcacacggtacacacttaagcttaaaaccaagctatgaagtattaaacgg tttagatgtttacggtaaagttggtgctgcattagttcgtaacgattacaaacgttatagccaaacagctggagtgc aaactcaaaaagctcataacttaaaaacctctttagtattaggtgcaggtgttgagtatgcaattcttccagaatta gcattccgtgttgagtaccaatggttaagccgtgtgggtaatgctaacaaagcagctcaaaaacgtggcgacacagc tatgtttggtccaggttctacatatagccctgatgcacactcagtatctgcaggtatttcataccgcttcggtcaag gtgcagcaccagttgtagcagcaccagaagttgtaactaaaaacttcgcgttcagctcagacgtattatttgacttc ggtaaagcaaacttaaaaccagctgcagcacaaacattagacgcagtacacactgagatcgtaaatttaggtttagc aaaccctgctgtacaagtaaacggttacacagaccgtat tggtaaagatgctgccaacttaactctttcacaaaaa cgtgcagaaacagtagcaaactacatcgtttctaaaggtgttaacccagctaacgtaacagcggtaggttacggtga agctaacccagtaactggtaacacatgtgacgcagttaaaggtcgtaaagcattaatcacttgcttagcaccagatc gccgtgttgaaatccaagttcaaggttcaaaagaagtttctatgtaa(2)根據(jù)表達(dá)載體pET_32a (+)的操作指南，將pET_32a (+) -OMP P5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表 達(dá)宿主中，進(jìn)行表達(dá)、純化和復(fù)性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白；所述的步驟(2)更優(yōu)選為將pET-32a-0MP P5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)，接著，挑取單個(gè)菌落在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素的終 濃度至少為50 μ g/mL)中37 °C振蕩培養(yǎng)，待0D600值達(dá)到0. 6時(shí)加入IPTG (終濃度為 0. 2mmol · L—1)進(jìn)行誘導(dǎo)5 6小時(shí)，收集菌體，超聲裂解收集得到的菌體，用Novagen的 His · Tag融合蛋白純化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行包涵體的抽提與純化；純化后用尿 素進(jìn)行透析復(fù)性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，優(yōu)選為所述副豬嗜血桿菌OMP P5 蛋白的包被量為0. 02 0. 05 μ g ；所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，更優(yōu)選為S/N ^ 2. 1 (S為待測(cè)血 清測(cè)定得到的OD45tl, N為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的OD45tl)，且OD45tl > 0. 375 ；實(shí)現(xiàn)所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的試劑盒，包含包被緩沖液、 封閉液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其中，包被抗原為副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)通過(guò)特異性試驗(yàn)、阻斷實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用檢測(cè)，證明本發(fā)明所述的 檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法具有特異性好、敏感性高、重復(fù)性好及快速、簡(jiǎn) 便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于副豬嗜血桿菌抗體的臨床大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。(2)本發(fā)明所用的包被抗原，即副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白可通過(guò)基因工程方法獲 得，生物安全性高。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有用此蛋白作為抗原建立HPS抗體間接ELISA檢測(cè)方 法的相關(guān)報(bào)道，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是副豬嗜血桿菌OMP P5基因的PCR擴(kuò)增圖；其中泳道M為DL2000DNA Marker ；泳道1為陽(yáng)性對(duì)照；泳道11為陰性對(duì)照；泳道 2 10禾Π 12 17為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是pET-32a(+)-0MP P5質(zhì)粒的酶切鑒定圖；其中泳道M為寬范圍DNA Marker (100 6000bp)；泳道2和3分別為EcoRV酶 和BamH I酶進(jìn)行雙酶切的產(chǎn)物；泳道1為PCR產(chǎn)物；泳道4為pET_32a(+)質(zhì)粒單酶切。圖 3 是 HPS OMP P5 蛋白的 SDS-PAGE 圖；其中泳道M為高分子量蛋白Marker ；泳道1為空載體對(duì)照；泳道2為未誘導(dǎo)對(duì) 照；泳道3為培養(yǎng)基對(duì)照；泳道4和9為全菌體表達(dá)產(chǎn)物；泳道5、6和10為超聲破碎菌體 沉淀；泳道7、8和11為超聲破碎菌體上清。圖4為HPS OMP P5蛋白純化的SDS-PAGE圖；其中泳道1 3為穿過(guò)峰；泳道4 8為漂洗下組分；泳道M為高分子量蛋白 Marker ；泳道9 14為洗脫下組分。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1一、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白基因的克隆、表達(dá)和純化1、PCR引物設(shè)計(jì)與合成(1)根據(jù)HPS OMP P5基因序列(基因登錄號(hào)為CP001321)，用生物軟件Premier Primer5.0設(shè)計(jì)了 1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增HPS OMP P5的全基因。引物由上海生工生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物HPS P1的序列5 ‘ -GCCGATATCGCTCCACAAGCTA ACACT-3 ‘(下劃線(xiàn)部分為EcoRV酶切位點(diǎn))；下游引物HPS P2的序列5 ‘ -CGCGGATCC TTACATAGAAACTTCTTTTGAACCT-3 ‘(下劃線(xiàn)部分為 BamHI 酶切位點(diǎn))。2、HPS OMP P5基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建以臨床分離菌株HPS菌液為模板，用設(shè)計(jì)好的特異性引物P1/P2進(jìn)行擴(kuò)增(95°C 預(yù)變性5min ；94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 IOmin)(見(jiàn)圖 1)。擴(kuò)增產(chǎn)物用 Omega 公司的 Bio—tek Ε. Ζ. N. A. GelExtraction Kit DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段(1116bp)。目的片段回收后，與PMD18-T載體連接，連接后(按 照分子克隆)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ci (廣州合達(dá)生物科技有限公司)，涂布于含氨芐青霉素 (氨芐的濃度為10(^8/11^)1^固體培養(yǎng)基，371、230印111培養(yǎng)12 1611后，挑取生長(zhǎng)出的 陽(yáng)性克隆重組子接種于加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后用PCR方法從克 隆質(zhì)粒pMD18-T-0MP P5中擴(kuò)增出副豬嗜血桿菌OMP P5基因片段，用EcoR V和BamHI雙酶 切后，將基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a (+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并進(jìn)行PCR鑒定和 酶切鑒定(見(jiàn)圖2)。陽(yáng)性質(zhì)粒由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定(如下所示)， 陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-0MP P5。atgaaaaaatctttaattgcattagcagtatcaggtttagcagttgcttctgtagctcaagctgctcca caagctaacactttctatgtaggtgctaaagctggttgggcaacattccacaatgatattaaccaaattgactctaa gtatgctaatgatgcacgttatgatgctactaatttaaaatatggcattagccgtaactctgtaacttacggtgtgt ttggtggttaccaaattattgacaacttagcagttgaattaggttacgattatttcggtcgtgttcgtggtaacaaa caagaattccgtgcattcaaacactctgcacacggtacacacttaagcttaaaaccaagctatgaagtattaaacgg tttagatgtttacggtaaagttggtgctgcattagttcgtaacgattacaaacgttatagccaaacagctggagtgc aaactcaaaaagctcataacttaaaaacctctttagtattaggtgcaggtgttgagtatgcaattcttccagaatta gcattccgtgttgagtaccaatggttaagccgtgtgggtaatgctaacaaagcagctcaaaaacgtggcgacacagc tatgtttggtccaggttctacatatagccctgatgcacactcagtatctgcaggtatttcataccgcttcggtcaag gtgcagcaccagttgtagcagcaccagaagttgtaactaaaaacttcgcgttcagctcagacgtattatttgacttc ggtaaagcaaacttaaaaccagctgcagcacaaacattagacgcagtacacactgagatcgtaaatttaggtttagc aaaccctgctgtacaagtaaacggttacacagaccgtattggtaaagatgctgccaacttaactctttcacaaaaac gtgcagaaacagtagcaaactacatcgtttctaaaggtgttaacccagctaacgtaacagcggtaggttacggtgaa gctaacccagtaactggtaacacatgtgacgcagttaaaggtcgtaaagcattaatcacttgcttagcaccagatcg ccgtgttgaaatccaagttcaaggttcaaaagaagtttctatgtaa3、重組pET-32a-0MP P5融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及檢測(cè)按照分子克隆方法，將陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-0MP P5轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)(廣州合達(dá)生物科技有限公司)，挑取單個(gè)菌落在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中 37°C振蕩培養(yǎng)。待0D600值達(dá)到0. 6時(shí)加入異丙基硫代-β -D-半乳糖核苷IPTG (終濃度為 0. 2mmol化―1)進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)6h后，離心收集菌液，然后用適量pH8. 0的裂解液(50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCl，IOmM咪唑)重懸上述菌體沉淀，在細(xì)菌重懸液中加入溶菌酶 至終濃度為lmg/mL，并置于冰浴中孵育30min。冰浴超聲破碎細(xì)菌，工作方式400W功率， 超聲破碎時(shí)間2s，間隔時(shí)間5s，超聲20min，直至液體變透亮為止。超聲裂解后，4°C 9000r/ min離心30min，分別收集菌液上清與沉淀，用于純化(上樣前用0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾)；上 清和沉淀分別留樣作SDS-PAGE檢測(cè)分析。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明(見(jiàn)圖3)，重組大 腸桿菌能夠特異性表達(dá)HPS OMP P5蛋白，且主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。收集的蛋白用Novagen公司的Ni-NTA His · Bind融合蛋白親和純化柱，按照說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行包涵體的抽提與純化。包涵體的抽提步驟如下l)9000rpm離心IOmin收集菌體， 棄上清，盡量去除培養(yǎng)基，按每IOOmL培養(yǎng)基所得菌體加入40mL IX結(jié)合緩沖液比例重懸 菌體，此步驟不加變性劑；2)按前述方法進(jìn)行超聲，重懸菌液，剪切降解核酸；3)9000rpm離 心20分鐘，包涵體和細(xì)胞碎片位于沉淀中，其他可溶蛋白部分位于上清中；4)移去上清，每IOOml培養(yǎng)物的沉淀重懸于20mL 1 X結(jié)合緩沖液，重復(fù)第3步?？赡苄枰曇詮氐?重懸沉淀；5)移去上清，按每IOOmL培養(yǎng)物加5mL緩沖液比例，加入含6M尿素的IX結(jié)合 緩沖液重懸沉淀；6)冰浴孵育1小時(shí)，徹底溶解包涵體，9000rpm離心30分鐘去除不溶成 分，Ni-NTA His - Bind純化之前用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾上清。純化步驟如下1)將Iml 50% Ni-NTA His-Bind樹(shù)脂懸液加到4ml細(xì)胞裂解液中，輕柔混勻(如旋轉(zhuǎn)混合器200rpm)，室 溫結(jié)合15-60min ；2)將裂解液與Ni-NTAHis · Bind樹(shù)脂的混合物小心加入下端封閉的空 色譜柱中；3)除去柱下端封閉蓋子，收集流出液(穿過(guò)峰)，保存用于SDS-PAGE電泳分析; 4)以4ml buffer C漂洗雜蛋白2次。保存漂洗組分用于SDS-PAGE電泳分析；5)以0. 5ml buffer D洗脫目的蛋白4次，再以0. 5ml buffer E洗4次，收集組分，用SDS-PAGE分析(如 圖4所示)；蛋白單體通常用buffer D即可洗脫，而多聚體、聚合物和含兩個(gè)His· Tag標(biāo) 簽的蛋白通常由buffer E洗脫。目的蛋白洗脫后，用5mL的平衡緩沖液平衡柱子，然后再 灌滿(mǎn)20%乙醇，封閉，以備下次使用。純化蛋白加入終濃度為lmg/mL的還原型谷胱甘肽后分別用含有4m0l/L、3m0l/L、 2mol/L、lmOl/L、0mOl/L尿素的pH8. 5的PBS緩沖液，進(jìn)行梯度透析復(fù)性，得到有活性的目的蛋白。二、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為抗原的間接ELISA方法的鑒定1、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為抗原的間接ELISA檢測(cè)方法相關(guān)試劑的配方包被緩沖液(0.05M 碳酸鹽緩沖液 ρΗ9· 6) 1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3 溶于 800mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至9. 6，并定容至IOOOmL。封閉液1 °/0 BSA,即Ig牛血清白蛋白(BSA)加入IOOmL的包被液中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。洗滌緩沖液(pH7.4PBST) :0· 2g KH2P04，2.9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl，0.2g KCl，0. 5mLTween-20 (0. 05% V/V)以上各物質(zhì)準(zhǔn)確稱(chēng)量后，加雙蒸水完全溶解后，調(diào)pH值至 7. 4，定容至 IOOOmL0抗體稀釋液0. 5g BSA溶于IOOmLPBST (洗滌緩沖液)中。TMB (四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色液取A液lmL+B液50mL(Α液和B液的比例為 1 50)。A 液5mg/mL TMB 50mg 溶于 IOmL DMSO 中 4°C避光保存。B 液磷酸-檸檬酸緩沖液(PH 5. 0)甲液0. 2Μ(71· 6g/L) Na2HPO4. 12H20 ；乙液 0. IM(19. 2/L)檸檬酸。配制方法51. 4mL甲液+48. 6mL乙液+IOOmL超純水，加入30% H202 112 μ L至于棕色瓶中4°C避光保存。終止液(2M H2SO4)雙蒸水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98% ) 21. 7mL。2、HPS OMP P5蛋白作為抗原的間接ELlSA方法的操作程序用純化的pET-32a(+)-0MP P5蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應(yīng)板，建立間接 ELISA方法，步驟如下(1)包被用包被液稀釋抗原液后，100 μ L/孔，加入96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板， 4°C過(guò)夜。甩干后洗滌，每孔加250 μ L洗滌液，每次3分鐘，甩干，洗3次。(2)封閉每孔加封閉液100μ L，37°C作用封閉2h，甩干，每孔加250 μ L洗滌液進(jìn) 行洗滌，每次3分鐘，甩干，洗3次。
(3)加樣用抗體稀釋液稀釋血清(1 160)后每孔加入100μ L，37°C作用lh，甩 干。每孔加250 μ L洗滌液進(jìn)行洗滌、每次3分鐘，甩干，洗3次。(4)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗每孔加50 μ L最適稀釋倍數(shù) (1 5000)的二抗，37°C作用30min，甩干。每孔加250 μ L洗滌液進(jìn)行洗滌，每次3分鐘， 甩干，洗3次。(5)加顯色液每孔加入新配制的顯色液50 μ L，室溫避光顯色I(xiàn)Omin。(6)加入終止液每孔加入100 μ L終止液終止反應(yīng)。(7)測(cè)OD值自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔0D450nm值。3、HPS OMP P5蛋白作為抗原的間接ELlSA方法的特異性試驗(yàn)利用初步建立的ELISA檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(App)陽(yáng)性血清、豬鏈球 菌(SS)陽(yáng)性血清、豬多殺巴氏桿菌(PM)陽(yáng)性血清、豬大腸桿菌(E.coli)陽(yáng)性血清、豬偽 狂犬病毒(ADV)陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)陽(yáng)性血清和豬繁殖與呼吸障礙綜合征 (PRRSV)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)HPS陰、陽(yáng)性血清作為對(duì)照，以檢測(cè)其特異性；觀察上述各 血清與HPS OMP P5蛋白的交叉反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1特異性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于該方法是將副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)OMP P5蛋白作為包被抗原；而且判斷標(biāo)準(zhǔn)如下待測(cè)血清的OD450值＞0.375，且待測(cè)血清的OD450值/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的OD450值≥2.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于所述 的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于所述 的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白通過(guò)基因工程方法得到，具體如下(1)將核苷酸序列如SEQID NO. 2所示的的副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列通過(guò)表 達(dá)載體pET-32a(+)的多克隆位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)中，得到pET_32a(+)-OMP P5 質(zhì)粒；其中，該副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列的5’端位于表達(dá)載體pET-32a(+)中的Trx Taq編碼序列的3’端；(2)根據(jù)表達(dá)載體pET-32a(+)的操作指南，將pET_32a(+)-OMP P5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿 主中，進(jìn)行表達(dá)、純化和復(fù)性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于所述 的步驟(2)為將pET-32a-0MP P5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)，接著， 挑取單個(gè)菌落在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中于37°C振蕩培養(yǎng)，待0D600值達(dá)到0. 6時(shí)加 入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，收集菌體，超聲裂解收集得到的菌體，用Novagen的His · Tag融合蛋白 純化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行包涵體的抽提與純化；純化后用尿素進(jìn)行透析復(fù)性，得 到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特征在于所述 副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的包被量為0. 02 0. 05 μ g。
6.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的試劑 盒，包含包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其特征在于 所用的包被抗原為副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法以及試劑盒。該間接ELISA方法是將副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為包被抗原；而且判斷標(biāo)準(zhǔn)如下待測(cè)血清的OD450值＞0.375，且待測(cè)血清的OD450值/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的OD450值≥2.1。實(shí)現(xiàn)該方法的試劑盒，包含包被緩沖液、封閉液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其中，所用的包被抗原為副豬嗜血桿菌OMPP5蛋白。通過(guò)特異性試驗(yàn)、阻斷實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用檢測(cè)，證明本發(fā)明具有特異性好、敏感性高、重復(fù)性好及快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于副豬嗜血桿菌抗體的臨床大規(guī)模檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101968490SQ201010264499
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者宋帥, 李春玲, 王貴平, 賈愛(ài)卿, 陳善真 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所