專利名稱：一種萘人工免疫原na-bsa及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬萘的多克隆抗體領(lǐng)域，特別是涉及一種萘人工免疫原NA-BSA的制備及 用途。
背景技術(shù)：
(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)
環(huán)的碳?xì)浠衔锏慕y(tǒng)稱，如萘、蒽、菲、熒蒽、苯并芘等。近年來，海上石油開采，輪船運(yùn)輸、海 損溢油，工業(yè)、生活燃燒廢氣排放等使得多環(huán)芳烴污染日益嚴(yán)重，大量調(diào)查研究表明，空氣、 土壤、水體及生物體等都受到了多環(huán)芳烴的污染。多環(huán)芳烴是最早發(fā)現(xiàn)且數(shù)量最多的致癌 物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致癌性多環(huán)芳烴及其衍生物已超過400種，占已被發(fā)現(xiàn)致癌物質(zhì)總數(shù) 的1/3以上。每年排放到大氣中的多環(huán)芳烴約幾十萬噸，因其毒性、生物蓄積性和半發(fā)揮性 以及在環(huán)境中的持久存在，已經(jīng)受到國(guó)際科學(xué)界的廣泛關(guān)注。1976年美國(guó)環(huán)保局提出129 種“優(yōu)先控制污染物”中，多環(huán)芳烴類化合物就有16種；歐盟最新有害物質(zhì)禁令中也列入了 16種多環(huán)芳烴；1990年我國(guó)提出的水中優(yōu)先控制的68種污染物中，其中多環(huán)芳烴類化合物 就占7種。萘是多環(huán)芳烴中較常見的物質(zhì)，是工業(yè)上最重要的稠環(huán)芳烴，它從煉油的副產(chǎn)品 煤焦油中大量生產(chǎn)，是制造某些染料、燃料、潤(rùn)滑劑、苯酐、農(nóng)藥及其它有機(jī)化合物的主要原 料。作為防蛀劑，還廣泛應(yīng)用于毛織品、皮貨、木材等的保存。1958年以來，代替滴滴涕等氯 化產(chǎn)品的甲萘威投產(chǎn)以后，用作殺蟲劑原料的比例大大增加。人暴露于萘的機(jī)會(huì)主要在萘 的生產(chǎn)和使用過程，另外吸煙和被動(dòng)吸煙也是一種暴露機(jī)會(huì)，據(jù)報(bào)道香煙中含有一定量的 萘、甲基萘等，因此美國(guó)環(huán)保局(EPA)將萘及其衍生物視為普遍存在的環(huán)境污染物而受到 重視，我國(guó)也已規(guī)定禁止使用萘作為防蛀劑。因此尋求一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的 分析方法成為當(dāng)前研究的主要方向。20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的免疫分析(Immunoassay，ΙΑ)是基于抗原與抗體的特 異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫反應(yīng)涉及抗原與抗體分子間的立體化學(xué)、電荷、氫 鍵和偶極間的綜合作用，具有常規(guī)理化分析技術(shù)無可比擬的選擇性和高靈敏度，非常適宜 于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析。因此，免疫分析具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、分析容 量大、檢測(cè)成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足簡(jiǎn)單、快速、靈敏地檢測(cè)環(huán)境激素的要求。目前關(guān)于免疫分析方法檢測(cè)萘的報(bào)道很少。合格的萘抗原是免疫得到合格的萘抗 體的重要前提，合格的萘抗體是建立萘免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵所在。有關(guān)萘抗體的制備，國(guó)內(nèi) 外報(bào)道甚少。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種萘人工免疫原NA-BSA的制備及用途，以克 服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中對(duì)萘樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，以及在檢測(cè)過程中要用到精密昂貴的檢測(cè)儀器而不適宜推廣使用和不利于當(dāng)環(huán)境污染事件發(fā)生在野外時(shí) 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等缺點(diǎn)。
技術(shù)方案
權(quán)利要求
一種萘人工免疫原NA BSA，結(jié)構(gòu)式如下其中BSA為牛血清白蛋白。FSA00000253707200011.tif
2.一種制備如權(quán)利要求1所述的萘人工免疫原NA-BSA的方法，包含以下步驟(1)萘半抗原的合成將丁二酸酐、萘、無水三氯化鋁按摩爾比1 1 2. 2投料，并溶 解于硝基苯中，得到無色液體，冰浴下攪拌反應(yīng)，在0 4°C冰浴下進(jìn)行7 8小時(shí)后，加入 稀鹽酸終止反應(yīng)，將燒瓶中的液體倒出，加稀鹽酸水解，分離出的有機(jī)層用大量稀鹽酸水洗 后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯，得到棕黃色固體粉末，在甲醇-乙醚中重結(jié)晶獲得黃色晶體狀的 萘半抗原NA，干燥后得純品；(2)萘人工免疫原的合成將溶有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N，N’- 二環(huán)己基碳酰 亞胺(DCC)的有機(jī)溶劑逐滴加入溶有萘半抗原的有機(jī)溶劑中，冰浴下攪拌反應(yīng)3 4小時(shí)， 離心分出上清液，加入到溶有BSA的磷酸緩沖液中，3 6°C反應(yīng)12 16小時(shí)，將溶液裝 入透析袋，用PH6 8磷酸緩沖液透析3 6d ；透析后離心分出上清液，即得萘人工免疫原 NA-BSA偶聯(lián)物，分裝后-10°C _40°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種萘人工免疫原NA-BSA的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的萘的分子結(jié)構(gòu)式為
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的萘半抗原的化學(xué)名稱為Y _氧-2-萘丁酸，分子量228，分子結(jié)構(gòu)式為
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中的有機(jī)溶劑是N，N-二甲 基甲酰胺(DMF)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的半抗原、NHS、DCC摩爾 比為1 1.5 1.5，半抗原、蛋白質(zhì)摩爾比分別為200 1。
7.一種萘人工免疫原NA-BSA的應(yīng)用，通過免疫動(dòng)物制備成萘特異性抗體，能與萘發(fā)生 特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白IgG，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體、土壤及大氣中痕量的萘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種萘人工免疫原NA-BSA及其制備方法和用途，制備(1)將丁二酸酐、萘、無水三氯化鋁按摩爾比1∶1∶2.2投料，溶解于硝基苯中，冰浴攪拌，加稀鹽酸終止反應(yīng)，有機(jī)層用大量稀鹽酸水洗后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去硝基苯，得到棕黃色固體粉末，重結(jié)晶，干燥；(2)將溶有N-羥基琥珀酸亞胺和N，N’-二環(huán)己基碳酰亞胺逐滴加入萘半抗原溶液中，冰浴下攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，加入到牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液中，4℃下反應(yīng)12～16小時(shí)，透析后離心分出上清液，即得萘人工免疫原NA-BSA偶聯(lián)物，分裝后-20℃下保存。本發(fā)明制備簡(jiǎn)便，成本低，容易工業(yè)化生產(chǎn)；萘人工免疫原NA-BSA通過動(dòng)物制備成萘特異性抗體，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體、土壤及大氣中痕量的萘。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101948532SQ20101027031
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者李壹, 李方實(shí), 楊明明, 謝卿 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)