專利名稱:一種高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的離子交換層析分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的分離純化方法,特別是涉及一種使用新型離子交換層析純化金屬離子結(jié)合蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù):
許多蛋白質(zhì)中含有金屬離子輔基,這些金屬離子對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)具有重要的意義。金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)的純化過程存在一些困難,在純化過程中金屬離子的喪失會導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失天然結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步影響該蛋白質(zhì)在離子交換層析過程中同其它雜蛋白的分辨率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種純化金屬離子結(jié)合蛋白的新型離子交換層析純化方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案步驟如下1)選取含有金屬離子結(jié)合蛋白的待分離原料,沉淀離心去除脂類等雜質(zhì)后收集上清液獲得蛋白混合物;2)在所得蛋白混合物中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子;3)選擇不與蛋白結(jié)合金屬離子沉淀的緩沖液作為離子交換層析緩沖液;4)在離子交換層析緩沖液中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子;5)將蛋白混合物經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析,分離得到金屬離子結(jié)合蛋白。本發(fā)明所述的待分離原料為轉(zhuǎn)基因動物乳液、轉(zhuǎn)基因工程菌的發(fā)酵液、轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的發(fā)酵液等,優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳液,所述的金屬離子結(jié)合蛋白優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因人源α-乳清白蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等;以下僅以一種蛋白的分離來加以說明,但本發(fā)明的保護(hù)不局限與此;牛乳中總蛋白濃度為30-38g/L,重組人源乳清蛋白濃度0. 5-4. Og/L,優(yōu)選蛋白濃度為1.0-3. 5g/L。本發(fā)明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸銨沉淀的方法。在采用酸性沉淀時(shí),需在室溫下將待分離原料調(diào)節(jié)PH到3. 5-5. 5,優(yōu)選的PH值為4. 0-5. 0,靜置 15分鐘,離心收集上清液。在采用凝乳酶法時(shí),向待分離原料中加入濃度為5%的凝乳酶溶液,牛乳與凝乳酶溶液體積比例為20-500 1,優(yōu)選的比例為50-200 1,室溫下反應(yīng)10 分鐘,離心收集上清液。在采用硫酸銨沉淀方法時(shí),調(diào)節(jié)待分離原料的PH到5. 0-10.0,優(yōu)選的PH值為6. 0-8.0,并通過加入硫酸銨粉末使得乳清中硫酸銨飽和度為20%-60%,以摩爾數(shù)計(jì)為0. 86-2. 95M,優(yōu)選的硫酸銨飽和度為30% -60%,以摩爾數(shù)計(jì)為1. 33-2. 37M,振蕩2 小時(shí),離心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后備用。本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合金屬離子為鈣離子、三價(jià)鐵離子等,在蛋白混合物和離子交換緩沖液中的添加濃度優(yōu)選為l_50mM。蛋白結(jié)合金屬離子有利于保持金屬離子結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu),有效地提高其在離子交換層析分離純化中的分辨率。本發(fā)明所述的離子交換層析中,離子交換層析介質(zhì)采用瓊脂糖材料為基質(zhì),所述的配基可為DEAE、Q、SP等,優(yōu)選為DEAE。本發(fā)明所述的離子交換層析中,可用的緩沖體系為Tris-HCl緩沖液,甘氨酸-HCl 緩沖液和甘氨酸-NaOH緩沖液,優(yōu)選的緩沖體系為Tris-HCl緩沖液;低鹽緩沖液優(yōu)選為 20-100mM,pH6. 0-8. 0的Tris-HCl緩沖液,添加蛋白結(jié)合金屬離子濃度優(yōu)選為l_50mM ;高鹽緩沖液優(yōu)選為20-100mM,pH6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液,洗脫鹽濃度為0. 5-2. 0M,優(yōu)選濃度為 0. 6-1. 2M,添加蛋白結(jié)合金屬離子濃度優(yōu)選為l-50mM。本發(fā)明所述的離子交換層析中,將處理得到的蛋白混合物溶液調(diào)節(jié)pH到 5. 0-10. 0,優(yōu)選的 pH 值為 6. 0-8. 0。本發(fā)明所述的離子交換層析中,本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)金屬離子結(jié)合蛋白的種類選擇合適的離子交換層析介質(zhì)、層析柱和進(jìn)樣速度將經(jīng)預(yù)處理后的蛋白混合物溶液進(jìn)樣到用低鹽緩沖液平衡好的離子交換層析柱中,層析過程使用^Onm紫外吸收波長進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測,進(jìn)樣的蛋白混合物溶液體積為0. 5-5. 0倍層析柱體積,優(yōu)選為1. 0-3. 0倍層析柱體積。本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)節(jié)工藝參數(shù)以得到不同的金屬離子結(jié)合蛋白的初步純化產(chǎn)品或純品;由于本發(fā)明的離子交換層析過程中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子,從而有效的保持金屬離子結(jié)合蛋白的天然結(jié)構(gòu),通過本步驟可以有效地純化金屬離子結(jié)合蛋白。本發(fā)明所述的凝膠過濾層析中,將金屬離子結(jié)合蛋白的初步純化產(chǎn)品再經(jīng)凝膠過濾層析除去剩余雜質(zhì)以得到純品,凝膠過濾層析介質(zhì)為瓊脂糖介質(zhì),優(yōu)選為Superdex 75。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù),由于采用了在離子交換層析過程中添加蛋白結(jié)合金屬離子的方法,可有效地提高金屬離子結(jié)合蛋白與雜蛋白之間的性質(zhì)差異,實(shí)現(xiàn)金屬離子結(jié)合蛋白的高效純化,得到不同的金屬離子結(jié)合蛋白初步純化產(chǎn)品或純品;采用了凝膠過濾層析對初步純化產(chǎn)品進(jìn)行了進(jìn)一步的精制純化,得到了高純度的金屬離子結(jié)合蛋白的純品; 采用以離子交換層析為核心的復(fù)合工藝方法,生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,適于進(jìn)行金屬離子結(jié)合蛋白的規(guī)?;a(chǎn),產(chǎn)品純度高,工藝回收率高。
圖1為分離純化工藝流程圖。圖2為離子交換層析分離純化人源α-乳清白蛋白和牛源α-乳清白蛋白。圖3為凝膠過濾I分離純化人源α -乳清白蛋白。圖4為凝膠過濾II分離純化牛源α -乳清白蛋白。實(shí)施例1取25mL轉(zhuǎn)基因人源α-乳清白蛋白牛乳,牛乳總蛋白濃度為33g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調(diào)節(jié)pH4. 6,靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下,調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清80mL,總蛋白濃度為9. 5g/L,人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L,牛源α -乳清白蛋白濃度為1. 2g/L。向乳清中添加氯化鈣粉末使得氯化鈣濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到8. 0,進(jìn)樣到用20mM,pH8. 0,含50mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡好的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱中,柱內(nèi)徑1. 5 厘米,柱床高度10厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速 10ml/min,上樣完畢后用20mM,pH8. 0,50M氯化鈣的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM,含IM NaCl的pH8. 0的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線形洗脫, 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為3.8g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為 1.2g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 2g/L;收集牛源α-乳清白蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為1.5g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為0.2g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為1. Og/L。取離子交換層析人源α -乳清白蛋白活性峰18mL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM 硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波長吸收檢測,流速2mL/min, 上樣完畢后繼續(xù)用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集230mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 9g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為0. 7g/L,工藝回收率60%,純度78%,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L。取離子交換層析牛源α -乳清白蛋白活性峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM 硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外280nm波長吸收檢測,流速2mL/min, 上樣完畢后繼續(xù)用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集230mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 6g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 5g/L,工藝回收率60%,純度83%,人源α-乳清白蛋白濃度為0.05g/L。實(shí)施例2取25mL轉(zhuǎn)基因人源α-乳清白蛋白牛乳,牛乳總蛋白濃度為33g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為1.0g/L。乳液調(diào)節(jié)pH4. 7,靜置15分鐘后使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下,調(diào)離心力為IOOOOg離心15分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清20mL,總蛋白濃度為9. 5g/L,人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L,牛源α -乳清白蛋白濃度為1. 2g/L。向乳清中添加硝酸鈣粉末使得硝酸鈣濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到9. 0,進(jìn)樣到用20mM,pH9. 0,30mM硝酸鈣的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡好的Q Sepharose FF離子交換層析柱中,柱內(nèi)徑1. 5厘米, 柱床高度10厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速IOml/ min,上樣完畢后用20mM,pH9. 0含0. M硫酸銨,30M硝酸鉀的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至 ^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM,含IM NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線形洗脫, 收集人源α-乳清白蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為3. 7g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為 1. lg/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 3g/L;收集牛源α -乳清白蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為1.6g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為0.3g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 9g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集230mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 8g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為0. 65g/L,工藝回收率56%,純度81%,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. lg/L。
取離子交換層析穿透峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集230mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 6g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0. 48g/L,工藝回收率58%,純度80%,人源α-乳清白蛋白濃度為0. 06g/L。實(shí)施例3取25mL含有轉(zhuǎn)基因人源α -乳清白蛋白的CHO細(xì)胞分泌液,總蛋白濃度為IOg/ L,人源α-乳清白蛋白濃度為1.4g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)分泌液pH到 9. 0,緩慢加入硫酸銨粉末到硫酸銨飽和度為50%,以摩爾記數(shù)為2. 37M,在室溫下振蕩2小時(shí)后,將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下,調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘并收集上清液20mL,上清液總蛋白濃度9.5g/L,人源α -乳清白蛋白濃度為1. 6g/L。向處理所得蛋白混合物中添加氯化鈣粉末使得氯化鈣濃度為40mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到6. 0,進(jìn)樣到用20mM,pH6. 0, 40mM氯化鈣的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡好的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱中,柱內(nèi)徑1. 5厘米,柱床高度10厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速lOml/min,上樣完畢后用20mM,pH6. 0,40M氯化鈣的1Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至 ^Onm紫外吸收信號回到基線。再用20mM,含IM NaCl,pH6. 0的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行階梯式洗脫并收集洗脫峰18mL,總蛋白濃度為4.0g/L,人源α-乳清白蛋白濃度為1. 4g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集230mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 9g/L,人源α -乳清白蛋白濃度為0. 8g/L,工藝回收率69 %,純度89 %。實(shí)施例4取25mL轉(zhuǎn)基因人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白牛乳,牛乳總蛋白濃度為33g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為1.7g/L,牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. lg/L。向牛乳中加入濃度為5%的凝乳酶溶液,牛乳與凝乳酶溶液體積比例為50 1,室溫下反應(yīng)10分鐘,使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下,調(diào)離心力為IOOOOg離心10分鐘去除脂類和酪蛋白后收集上清液獲得乳清20mL,總蛋白濃度為9. 5g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為2. Og/L,牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 12g/L。向乳清中添加硝酸鐵粉末使得硝酸鐵濃度為50mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乳清pH到8. 0,進(jìn)樣到用20mM,pH8. 0,50mM 硝酸鐵的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡好的SP Sepharose FF離子交換層析柱中,柱內(nèi)徑1. 5 厘米,柱床高度10厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速 10ml/min,上樣完畢后用20mM,pH8. 0,50M硝酸鐵的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm紫外吸收信號回到基線。使用20mM,含IM NaCl的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線形洗脫,收集人源乳鐵蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為3. 8g/L,人源乳鐵蛋白濃度為1. 2g/L,牛源乳鐵蛋白濃度為0. 05g/L ;收集牛源乳鐵蛋白活性峰18mL,總蛋白濃度為1. 5g/L,人源乳鐵蛋白濃度為0.9g/L,牛源α-乳清白蛋白濃度為0.01g/L。
取離子交換層析洗脫峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集170mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 35g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 3g/L,工藝回收率21 %,純度86 %,牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 002g/L。取離子交換層析穿透峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集170mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. lg/L,牛源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 02g/L,工藝回收率,純度20 %,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 06g/L。實(shí)施例5取IOOmL含有轉(zhuǎn)基因人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的E. Coli發(fā)酵液,總蛋白濃度為20g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0.6g/L。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到7.0,緩慢加入硫酸銨粉末到蛋白溶液硫酸銨飽和度為40%,以摩爾記數(shù)為1. 84M,在室溫下振蕩2小時(shí)后,將沉淀樣品使用Sigma 3k30離心機(jī)4攝氏度下,調(diào)離心力為IOOOOg離心30分鐘收集沉淀,并使用85mL pH7. 0的20mM磷酸鹽緩沖液復(fù)溶,上清液總蛋白濃度10g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 5g/L。向蛋白溶液中添加氯化鐵粉末使得氯化鐵濃度為30mM。使用IM的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH到7. 0,進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0, 30mM氯化鐵的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡好的CM Sepharose FF離子交換層析柱中,柱內(nèi)徑 1.5厘米,柱床高度10厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速10ml/min,上樣完畢后用20mM,pH7. 0,30mM氯化鐵的Tris-HCl緩沖液繼續(xù)沖洗至^Onm 紫外吸收信號回到基線。再用20mM,含lMNaCl,pH7. 0的Tris-HCl緩沖液一步洗脫并收集洗脫峰18mL,總蛋白濃度為4g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 5g/L。取離子交換層析洗脫峰ISmL進(jìn)樣到用20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡好的Superdex 75凝膠過濾層析柱中,柱內(nèi)徑3. 5厘米,柱床高度60厘米,層析設(shè)備GE AKTA Explorer 100,紫外^Onm波長吸收檢測,流速2mL/min,上樣完畢后繼續(xù)用 20mM,pH7. 0含0. IM硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液沖洗,收集170mL處的蛋白峰共30mL,總蛋白濃度為0. 4g/L,人源乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為0. 3g/L,工藝回收率60%,純度75%。
權(quán)利要求
1.高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的離子交換層析分離純化方法,其步驟包括1)選取含有金屬離子結(jié)合蛋白的待分離原料,沉淀離心去除脂類等雜質(zhì)后收集上清液獲得蛋白混合物;2)在所得蛋白混合物中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子;3)選擇不與蛋白結(jié)合金屬離子沉淀的緩沖液作為離子交換層析緩沖液;4)在離子交換層析緩沖液中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子;5)將蛋白混合物經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析聯(lián)用的組合層析,分離得到金屬離子結(jié)合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中的待分離原料為轉(zhuǎn)基因動物乳液、轉(zhuǎn)基因工程菌的發(fā)酵液、轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞的發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述的蛋白質(zhì)是有金屬離子結(jié)合能力的蛋白,如重組人源α-乳清白蛋白,牛源α-乳清白蛋白,重組人乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,蛋白結(jié)合金屬離子為鈣離子、三價(jià)鐵離子等。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,離子交換層析所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,離子交換層析介質(zhì)為常用的蛋白質(zhì)層析介質(zhì),如瓊脂糖基質(zhì)的DEAE、Q、SP離子交換層析介質(zhì)等。
全文摘要
本發(fā)明一種高效純化金屬離子結(jié)合蛋白的離子交換層析分離純化方法,其步驟為選取含有金屬離子結(jié)合蛋白的待分離物料,添加沉淀劑進(jìn)行沉淀粗分離獲得蛋白混合物。在蛋白混合物中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子,以保持目標(biāo)蛋白的三級結(jié)構(gòu)。將處理所得蛋白混合物進(jìn)行離子交換層析分離操作,并在層析緩沖液中添加適量的蛋白結(jié)合金屬離子,由于該金屬離子輔基可以有效地保持目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu),因此可以有效地提高目標(biāo)蛋白與雜蛋白在離子交換層析中的分辨率。進(jìn)一步通過凝膠過濾層析可以得到高純度、高回收率的金屬離子結(jié)合蛋白的純品,生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,適于規(guī)?;a(chǎn)。
文檔編號C07K1/36GK102382168SQ20101027146
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者張焱, 羅堅(jiān), 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所