專利名稱：一種將含巰基肽從樹脂上切落的試劑及切落方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種切肽試劑，具體是指一種將含巰基肽從樹脂上切落的試劑；另外， 本發(fā)明還涉及將含巰基多肽從樹脂上的切落的方法，本方法適合于含巰基多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
目前，多肽合成主要分為化學(xué)合成與酶促肽鍵合成。化學(xué)合成又分為液相多肽合 成與固相多肽合成。近年來固相多肽合成占主導(dǎo)地位，這主要是由于它運(yùn)用了洗滌、過濾等 分離技術(shù)來純化反應(yīng)中間體和最終產(chǎn)物。傳統(tǒng)的液相多肽合成既麻煩又費(fèi)時(shí)，而固相多肽 合成作為一種日趨成熟的技術(shù)越來越受到關(guān)注。固相多肽合成一般以樹脂為起始原料，逐個(gè)連接氨基酸得到多肽樹脂，為了防止 副反應(yīng)的發(fā)生，通常參加反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈都是被保護(hù)的。而反應(yīng)物的羧基端是游離的，并 且在反應(yīng)之前必須活化?，F(xiàn)階段本領(lǐng)域大多采用固相合成法，其優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在最初的反 應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，因此可以在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行所有的反應(yīng)，便于自 動(dòng)化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)物很容易分離。在固相多肽合成中，氨基酸的極性以及空間位阻和縮合位置都會(huì)對(duì)多肽的合成難 易程度造成影響。一般情況下，在縮合位置相同的條件下，氨基酸極性越大，縮合難度越??； 空間位阻越大，縮合難度越大；氨基酸極性越小，縮合難度越大；空間位阻越小，縮合難度越 小。因此在多肽合成過程中，要充分綜合考慮氨基酸的極性以及空間位阻和縮合位置。在縮 合反應(yīng)過程中，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度決定著最終產(chǎn)物的純度和收率。反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，氨基酸鏈 可能從固相樹脂中脫落，導(dǎo)致收率降低。反應(yīng)時(shí)間過短，又不能達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，導(dǎo)致最終產(chǎn)物 純度降低。反應(yīng)溫度過低，也會(huì)造成反應(yīng)到不了終點(diǎn)，反應(yīng)溫度過高，較易發(fā)生消旋等副反應(yīng)。目前，在我國(guó)固相多肽合成方法有較多應(yīng)用，已在國(guó)內(nèi)上市的多肽藥物中，有許 多是含巰基的多肽藥物通常均采用固相多肽合成方法生產(chǎn)。如醋酸奧曲肽(英文名 Octreotide)、生長(zhǎng)抑素(英文名Somatostatin)、依替巴肽(英文名Eptifibatid)、特利 加壓素(英文名Terlipressin)、鮭降鈣素(英文名=CalcitoninSalmon)、阿托西班(英文 名Atosiban)、縮宮素(英文名0xytocin)、去氨加壓素(英文名desmopressin)、卡貝縮 宮素(英文名=Carbetocin)等。如采用固相合成方法進(jìn)行生產(chǎn)，則在縮合反應(yīng)完成后，均 需使用“切肽試劑”將肽鏈從樹脂上切落下來得到粗肽即還原型粗肽。然后，再將切落的還 原型粗肽，進(jìn)行氧化環(huán)合反應(yīng)、分離純化、冷凍干燥等工藝過程，得到藥用多肽。然而，這些含巰基的多肽從樹脂上的切落時(shí)，所采用的“切肽試劑”大多采用TFA/ EDT/TIS/H20等混合溶液(簡(jiǎn)稱EDT法切肽)，其中EDT (中文名為乙二硫醇)是一種無國(guó) 內(nèi)生產(chǎn)的化學(xué)試劑，其價(jià)格昂貴，且反應(yīng)時(shí)氣味惡臭。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，該試劑應(yīng)具有原料來源方便、價(jià)格低廉、切肽收率高的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種制備上述含巰基多肽從樹脂上切落的試劑的方法，該方法具 有得率高、無污染、簡(jiǎn)單實(shí)用的特點(diǎn)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，包括以下重 量份的試劑三氟乙酸85-95份；三異丙基硅烷1_5份；巰基烷酸1_4份；苯酚1_4份； 水1-2份。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，包括以下重量份的試劑三氟乙酸85_93份；三異丙基硅烷2_5份；巰基烷酸2_4份；苯酚1_3份；水 1-2 份。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，包括以下重量份的試劑三氟乙酸90份；三異丙基硅烷4份；巰基烷酸3份；苯酚2份；水1份。所述的巰基烷酸為巰基丙酸、2-巰基丙酸、3-巰基丙酸、β -巰基丙酸、巰基乙酸 中的任意一種。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的巰基烷酸也可以由巰基烷酸鹽代替，即巰基丙 酸、2-巰基丙酸、3-巰基丙酸、β -巰基丙酸、巰基乙酸的鈉鹽、銨鹽、鈣鹽。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，按以下步驟進(jìn)行1)將上述比例的三氟乙酸、三異丙基硅烷、巰基烷酸、苯酚和水混合均勻，冷卻至 0-15°C ；2)在含有巰基多肽的樹脂中，加入上述切肽試劑；3)將上述溶液在室溫下攪拌1-3小時(shí)，用砂芯漏斗過濾除去樹脂，樹脂用50份三 氟乙酸分二次洗滌。4)在上述得到的濾液與洗滌液中，加入500-1000份冷乙醚，0_10°C靜置0. 5-5小 時(shí)；5)過濾上述制備得到的白色沉淀，并收集該沉淀；6)將收集到的沉淀用200份乙醚分?jǐn)?shù)次洗滌后，真空干燥至恒重，得到多肽粗品。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，步驟2)中加入含巰基多肽的樹脂中 的切肽試劑，其溫度不能高于20°C ；優(yōu)選5°C。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，步驟4)中加入的冷乙醚溫度在 0-10°C，用量為切肽試劑的5-10倍，沉淀30分鐘以上。此處乙醚最佳采用無水乙醚，也可 采用甲基叔丁基醚等醚類溶劑。由于三氟乙酸溶液與乙醚的混合過程是一個(gè)放熱過程，為避免含巰基肽遇高溫破 壞，故沉淀用乙醚需低溫。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，步驟5)中白色沉淀用漏斗過濾收集 或離心收集。所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，步驟6)將上述收集得到的沉淀用乙 醚充分洗滌，除去“切肽試劑”及副產(chǎn)物。此處乙醚優(yōu)選無水乙醚，也可采用丙酮、乙酸乙酯、 甲基叔丁基醚等溶劑。在真空條件下干燥至恒重，其中優(yōu)選P2O5真空條件下干燥。本發(fā)明中，最后一步的裂解是固相合成中最重要的步驟，肽鏈上的許多側(cè)鏈保護(hù)基，在用三氟乙酸處理時(shí)也被同時(shí)除去。此步反應(yīng)中產(chǎn)生的烷基正離子會(huì)使有些氨基酸的 側(cè)鏈烷基化，因而同樣需要加入正離子清除劑如Tis，H2O,苯酚等。含巰基的多肽，如“-Cys (Trt)-，，從樹脂上的切落時(shí)，通常采用的“切肽試劑”大多 含“乙二硫醇”，利用“乙二硫醇”的巰基(-SH)來保護(hù)Cys上的巰基(-SH)不被氧化，同時(shí) 也可清除正離子(Trt+)。目前，常用的切肽試劑是TFA/EDT/TIS/H20等混合溶液，其中乙二 硫醇(1)在三氟乙酸環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生環(huán)硫乙烷(2)和硫化氫氣體，所以此反應(yīng)特別臭，給環(huán)保 帶來很大的壓力；此外，整個(gè)切肽反應(yīng)的效果也不夠理想。本發(fā)明采用巰基丙酸(英文名=Mercaptopropionic acid，分子式=C3H6O2S,分子 量106. 14)替代EDT。巰基丙酸(3)在三氟乙酸環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生丙硫內(nèi)酯(4)和水。該反應(yīng) 是一個(gè)可逆反應(yīng)，即丙硫內(nèi)酯和水會(huì)開環(huán)成巰基丙酸。此反應(yīng)過程中不會(huì)產(chǎn)生硫化氫氣體，
大大減少了環(huán)保污染；同時(shí)切肽反應(yīng)的效果也好。
OH+I^
十 H2。
SH ^^ OH HO
⑶ ⑷本發(fā)明的有益效果是由于乙二硫醇是一種國(guó)內(nèi)無生產(chǎn)的化學(xué)試劑，其價(jià)格昂貴、 且反應(yīng)時(shí)氣味惡臭；本發(fā)明選用巰基丙酸代替現(xiàn)常用的乙二硫醇，不僅能降低生產(chǎn)成本，大 大減少了環(huán)保污染；同時(shí)還能提高切肽反應(yīng)的效果。同時(shí)具有采購成本低、三廢減少、粗肽 質(zhì)量佳等特點(diǎn)，非常適合于含巰基多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。本文所涉及的試劑之間的重量份均為體積份。以下通過表格形式將縮寫對(duì)應(yīng)的英文名和中文名進(jìn)行詳細(xì)說明
英文名中文名
EDTEthanedithiol乙二硫醇
TFATrifluoroacetic acd三氟醋酸
TISTriisopropylsilane三異丙基娃燒
MPAMercaptopropionic acid 巰基丙酸
MAAMercaptoacetic acid巰基乙酸
權(quán)利要求
一種將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，包括以下重量份的試劑三氟乙酸85 95份；三異丙基硅烷1 5份；巰基烷酸1 4份；苯酚1 4份；水1 2份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，其特征在于包括以下 重量份的試劑三氟乙酸85-93份；三異丙基硅烷2-5份；巰基烷酸2-4份；苯酚1_3份；7K 1~2份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，其特征在于包括 以下重量份的試劑三氟乙酸90份；三異丙基硅烷4份；巰基烷酸3份；苯酚2份；水1份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，其特征在于所述的巰 基烷酸為巰基丙酸、2-巰基丙酸、3-巰基丙酸、β-巰基丙酸、巰基乙酸中的任意一種。
5.權(quán)利要求1所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，按以下步驟進(jìn)行1)將上述比例的三氟乙酸、三異丙基硅烷、巰基烷酸、苯酚和水混合均勻，冷卻至 0-15°C ；2)在含有巰基多肽的樹脂中，加入上述切肽試劑；3)將上述溶液在室溫下攪拌1-3小時(shí)，用砂芯漏斗過濾除去樹脂，樹脂用50份三氟乙 酸分二次洗滌。4)在上述得到的濾液與洗滌液中，加入500-1000份冷乙醚，0-10°C靜置0.5-5小時(shí)；5)過濾上述制備得到的白色沉淀，并收集該沉淀；6)將收集到的沉淀用200份乙醚分?jǐn)?shù)次洗滌后，真空干燥至恒重，得到多肽粗品。
6.權(quán)利要求5所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，所述步驟2)中加入含巰基多 肽的樹脂中的切肽試劑，其溫度不能高于20°C ；優(yōu)選5°C。
7.權(quán)利要求6所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，所述步驟4)中加入的冷乙醚 溫度在0-10°C，用量為切肽試劑的5-10倍，沉淀30分鐘以上。
8.權(quán)利要求7所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，所述步驟5)中白色沉淀用漏 斗過濾收集或離心收集。
9.權(quán)利要求8所述的將含巰基多肽從樹脂上切落的方法，所述步驟6)將上述收集得到 的沉淀用乙醚充分洗滌，除去多余的切肽試劑和雜質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種切肽試劑，具體是指一種將含巰基肽從樹脂上切落的試劑；另外，本發(fā)明還涉及將含巰基多肽從樹脂上的切落的方法，本方法適合于含巰基多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。一種將含巰基多肽從樹脂上切落的試劑，包括以下重量份的試劑三氟乙酸85-95份；三異丙基硅烷1-5份；巰基烷酸1-4份；苯酚1-4份；水1-2份。本發(fā)明的有益效果是由于乙二硫醇是一種國(guó)內(nèi)無生產(chǎn)的化學(xué)試劑，其價(jià)格昂貴、且反應(yīng)時(shí)氣味惡臭；本發(fā)明選用巰基丙酸代替現(xiàn)常用的乙二硫醇，不僅能降低生產(chǎn)成本，大大減少了環(huán)保污染；同時(shí)還能提高切肽反應(yīng)的效果。同時(shí)具有采購成本低、三廢減少、粗肽質(zhì)量佳等特點(diǎn)，非常適合于含巰基多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101967179SQ20101027287
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者周又佳 申請(qǐng)人:周又佳