專利名稱：一種分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及板藍(lán)根中芥子苷類化合物的分離，具體說，是涉及一種分離板藍(lán)根中主要芥子苷類化合物原告依春[(2 (R)-羥基-3-丁烯基硫甙)，pr0g0itrin]、表原告依春 [(2 (S)-羥基-3- 丁烯基硫甙)，epiprogoitrin]及 3- 丁烯基硫甙(gluconapin)的方法。
背景技術(shù)：
研究表明板藍(lán)根中的芥子苷類化合物主要為印iprogoitrin，progoitrin， gluconapin和glucoraphenin，它們在總芥子苷類部位中的百分比依次為56%,21%, 17%,3% ；表原告依春(印iprogoitrin)的降解產(chǎn)物表告依春(印igoitrin)是一種生物堿，具有抗流感病毒的作用；但原告依春(progoitrin)的降解產(chǎn)物告依春(goitrin)是一種甲狀腺毒素，具有造成甲狀腺腫大的作用；2010版中國藥典已將RS-告依春作為板藍(lán)根抗病毒藥效的質(zhì)量控制成分。由于表告依春和告依春的生理作用具有較大差異，并且目前還沒有對RS-告依春進行規(guī)?；中苑蛛x純化的工藝，以致嚴(yán)重限制了板藍(lán)根藥材的應(yīng)用，因此，迫切需求能夠大規(guī)模從板藍(lán)根中手性分離RS-原告依春的方法，以滿足對板藍(lán)根中有效成分表告依春的獲取、質(zhì)量控制及其用途的研究需求。但芥子苷是一種具有各種側(cè)鏈R的(Z) - β -D-葡萄糖硫苷-N-肟基硫酸鹽，根據(jù)側(cè)鏈R的不同，通常分為脂肪族芥子苷、芳香族芥子苷和吲哚族芥子苷。由于硫酸基團的強極性及側(cè)鏈R基團的相似性，芥子苷的分離十分困難。與芳香族芥子苷或吲哚族芥子苷相比，脂肪族芥子苷在ODS C18柱上因有更小的保留時間而選擇性很差，這是因為脂肪族芥子苷側(cè)鏈R基團的極性很大，尤其是側(cè)鏈R基團中羥基的加入使得一些脂肪族芥子苷幾乎不產(chǎn)生保留行為，而原告依春和表原告依春就為這類羥基脂肪族芥子苷的一對手性立體異構(gòu)體，由本領(lǐng)域的公知常識可知，將原告依春和表原告依春進行有效手性分離的難度非常大，更不用說，進行高效、經(jīng)濟、高純度分離這對手性異構(gòu)體，也因此，目前還未見關(guān)于從板藍(lán)根中有效分離主要芥子苷類化合物原告依春[(2 (R)-羥基-3-丁烯基硫甙)， progoitrin]、表原告依春[O ( -羥基_3_ 丁烯基硫甙)，epiprogoitrin]及3- 丁烯基硫 ft (gluconapin)的方法 艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述技術(shù)難題，提供了一種能從板藍(lán)根中高效、經(jīng)濟、高純度分離主要芥子苷類化合物原告依春、表原告依春及3- 丁烯基硫甙的方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下—種分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，包括如下具體步驟a)用醇水溶劑回流提取板藍(lán)根藥材粉末；b)將上述提取液在35 60°C減壓濃縮到無醇溶劑；c)將上述濃縮液加入到用蒸餾水平衡的酸性氧化鋁柱中；
d)分別用2 9個柱體積的蒸餾水和2 6個柱體積的0. 01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，以每0. 25 2個柱體積收集為一個流份；e)合并含有芥子苷類化合物的所有流份，在35 60°C減壓濃縮至干；f)用甲醇對總芥子苷類化合物進行脫鹽，并將得到的甲醇濾液在35 60°C減壓濃縮到無甲醇溶劑；g)用蒸餾水溶解總芥子苷類化合物，在_50°C凍干，得總芥子苷類化合物的固體粉末；h)將所得到的總芥子苷類化合物的固體粉末用洗脫液配制成溶液后，加入到用洗脫液平衡的ODS-BP柱中；用1 10個柱體積的洗脫液淋洗柱子，即可分別收集到原告依春 (progoitrin)、表原告依春(印iprogoitrin)及3-丁烯基硫甙(gluconapin)的流份；所述洗脫液為蒸餾水或0. 01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液；i)當(dāng)步驟h)中所用洗脫液為蒸餾水時，將收集到的progoitrin、印iprogoitrin 及gluconapin的流份分別在40°C減壓濃縮至無溶劑滴出，然后在_50°C凍干；當(dāng)步驟h)中所用洗脫液為0. 01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液時，將收集到的progoitrin、 印iprogoitrin及gluconapin的流份分別按步驟e)、f)、g)所述操作進行后處理；j)重復(fù)步驟h)至步驟i)，即可分離得到progoitrin、印iprogoitrin及 gluconapin的3個純品的固體粉末。步驟a)中用于提取板藍(lán)根藥材粉末的醇水溶劑優(yōu)選體積百分比為50 % 95 %的乙醇水溶液或體積百分比為50% 100%的甲醇水溶液；所用醇水溶劑的體積(ml)優(yōu)選為板藍(lán)根藥材粉末重量(g)的5 12倍。步驟c)中所述的酸性氧化鋁的粒徑優(yōu)選為100 200目或200 300目；所述酸性氧化鋁的重量與濃縮液所用藥材的重量之比優(yōu)選為20 2 1。步驟h)中所述的ODS-BP柱的填料重量與總芥子苷類化合物的固體粉末的重量之比優(yōu)選為100 10 1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要有以下幾點1、樣品純度高，分離得到的原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫甙的純度均可達(dá)到 98%。2、操作簡單方便，周期短，可規(guī)?；a(chǎn)。3、重現(xiàn)性好，產(chǎn)率高，經(jīng)濟且環(huán)保。


圖1是實施例1分離得到的progoitrin樣品的HPLC譜圖；圖2是實施例1分離得到的印iprogoitrin樣品的HPLC譜圖；圖3是實施例1分離得到的gluconapin樣品的HPLC譜圖；圖4是化合物progoitrin的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖；圖5是化合物印iprogoitrin的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖；圖6是化合物gluconapin的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)、完整地說明；實施例中所采用的HPLC的檢測方法為色譜柱為Ultimate XB-Q84. 6謹(jǐn)，5 μ m)， 檢測波長為2^nm，溫度為30°C，流速為1. Oml/min，進樣量為10 μ 1，分析時間為30min，流動相為乙腈-0.02%磷酸水溶液，洗脫梯度為(乙腈)，0min，0% ；5min,0% ；25min,20% ； 28min,0% ；30min,0% ；所采用的TLC的檢測方法為薄層層析色譜板為硅膠GF254板，展開劑為氯仿_甲醇-水15 15 1，顯色劑為碘蒸氣。實施例1將3kg板藍(lán)根藥材粉末用體積百分比為70%的乙醇水溶液在80°C提取3次，每次 30min，3次所用的溶劑體積分別為30LJ9LJ9L ；合并3次提取液，在50 55°C減壓濃縮到無乙醇溶劑，得到3. 5L濃縮液。15kg酸性氧化鋁柱，其柱體積為15L，用蒸餾水平衡，然后將3. 5L濃縮液加入到柱頂端；待上樣完成后，分別用75L蒸餾水和45L 0. lmol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，每0. 5 個柱體積收集為一個流份；以黑芥子苷(sinigrin)為準(zhǔn)標(biāo)樣，采用所述的HPLC和TLC的檢測方法，合并Fr. 12 13的含有芥子苷類化合物的所有流份，在50°C減壓濃縮至干；用IL 甲醇對總芥子苷類化合物進行脫鹽，將得到的甲醇濾液在40°C減壓濃縮到無甲醇溶劑；用適量體積的蒸餾水溶解總芥子苷類化合物，在_50°C凍干，即得15g總芥子苷類化合物的固體粉末，產(chǎn)率為0.5%。200g ODS-BP柱，其柱體積為400ml，用0. 05mol/L的硝酸鉀水溶液平衡，取IOg總芥子苷類化合物的固體粉末，用適量0. 05mol/L的硝酸鉀水溶液溶解，上樣；在加壓下，用 2400ml 0. 05mol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，所收集流份的體積有200ml，IOOml和50ml ； 同樣采用上述的HPLC和TLC的檢測方法，合并含有相同芥子苷的流份，在40°C減壓濃縮至干；用適量甲醇對各芥子苷類化合物進行脫鹽，將得到的甲醇濾液在40°C減壓濃縮至干； 用適量蒸餾水溶解各芥子苷，在_50°C凍干，即得progoitrin，epiprogoitrin, gluconapin 各芥子苷類化合物的固體粉末。重復(fù)上述ODS-BP柱的分離過程，最后，從IOg總芥子苷類化合物中，分離得到了 progoitrin 1040mg, epiprogoitrin 3310mg, gluconapin 1050mg,且純度均為 98. 0% ；分離得到的progoitrin、印iprogoitrin及gluconapin樣品的HPLC譜圖分別見圖1、圖2、圖 3所示。實施例2將IOg板藍(lán)根藥材粉末用體積百分比為95%的乙醇水溶液在80°C提取3次，每次 30min，每次所用的溶劑體積為100ml ；合并3次提取液，在40°C減壓濃縮到無乙醇溶劑，得到9ml濃縮液。50g酸性氧化鋁柱，其柱體積為50ml，用蒸餾水平衡，然后將9ml濃縮液加入到柱頂端；待上樣完成后，分別用250ml蒸餾水和150ml 0. lmol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，每 0.5個柱體積收集為一個流份；以黑芥子苷(sinigrin)為準(zhǔn)標(biāo)樣，采用所述的HPLC和TLC 的檢測方法，合并Fr. 12 15的含有芥子苷類化合物的所有流份，在40°C減壓濃縮至干； 用10 15ml甲醇對總芥子苷類化合物進行脫鹽，將得到的甲醇濾液在40°C減壓濃縮到無甲醇溶劑；用適量體積的蒸餾水溶解總芥子苷類化合物，在-50°C凍干，即得80mg總芥子苷類化合物的固體粉末，產(chǎn)率為0. 8%。20g ODS-BP柱，其柱體積為40ml，用0. lmol/L的硝酸鉀水溶液平衡，取80mg總芥子苷類化合物的固體粉末，用適量0. lmol/L的硝酸鉀水溶液溶解，上樣；在加壓下，用 240ml 0. lmol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，所收集流份的體積有20ml，IOml和5ml ；同樣采用上述的HPLC和TLC的檢測方法，合并含有相同芥子苷的流份，在40°C減壓濃縮至干；用適量甲醇對各芥子苷類化合物進行脫鹽，將得到的甲醇濾液在40°C減壓濃縮至干；用適量蒸餾水溶解各芥子苷，在_50°C凍干，即得progoitrin，epiprogoitrin, gluconapin各芥子苷類化合物的固體粉末。重復(fù)上述ODS-BP柱的分離過程，最后，從80mg總芥子苷類化合物中，分離得到了 progoitrin 6mg, epiprogoitrin 20mg, gluconapin 8mg,且純度均為 98. 0%。實施例3將IOg板藍(lán)根藥材粉末用甲醇在70°C提取3次，每次30min，每次100ml ；合并3次提取液，在40°C減壓濃縮到無溶劑，再用9ml蒸餾水溶解。50g酸性氧化鋁柱，其柱體積為50ml，用蒸餾水平衡，然后將9ml水溶液加入到柱頂端；待上樣完成后，分別用250ml蒸餾水和150ml 0. lmol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，每 0.5個柱體積收集為一個流份；以黑芥子苷(sinigrin)為準(zhǔn)標(biāo)樣，采用所述的HPLC和TLC 的檢測方法，合并Fr. 12 16的含有芥子苷類化合物的所有流份，在40°C減壓濃縮至干； 用10 15ml甲醇對總芥子苷類化合物進行脫鹽，將得到的甲醇濾液在40°C減壓濃縮到無甲醇溶劑；用適量體積的蒸餾水溶解總芥子苷類化合物，在-50°C凍干，即得90mg總芥子苷類化合物的固體粉末，產(chǎn)率為0. 9%。20g ODS-BP柱，其柱體積為40ml，用蒸餾水平衡，取90mg總芥子苷類化合物的固體粉末，用適量蒸餾水溶解，上樣；在加壓下，用240ml蒸餾水淋洗柱子，所收集流份的體積有20ml，IOml和5ml ；同樣采用上述的HPLC和TLC的檢測方法，合并含有相同芥子苷的流份，在40°C減壓濃縮至無溶劑滴出；在_50°C凍干，即得progoitrin，epiprogoitrin, gluconapin各芥子苷類化合物的固體粉末。重復(fù)上述ODS-BP柱的分離過程，最后，從90mg總芥子苷類化合物中，分離得到了 progoitrin 5mg, epiprogoitrin 15mg, gluconapin 9mg,且純度均為 98. 0%。經(jīng)檢測分析得知用本發(fā)明的分離方法得到的progoitrin、印iprogoitrin和 gluconapin樣品的ESI-MS[M-H]-分別為388、388、372，都擁有很強的碎片峰m/z 259 ’三者的氫譜數(shù)據(jù)見表1所示；三者的碳譜數(shù)據(jù)見表2所示。表1 氫譜數(shù)據(jù) GOOMHz，D2O, ppm)
權(quán)利要求
1.一種分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，包括如下具體步驟a)用醇水溶劑回流提取板藍(lán)根藥材粉末；b)將上述提取液在35 60°C減壓濃縮到無醇溶劑；c)將上述濃縮液加入到用蒸餾水平衡的酸性氧化鋁柱中；d)分別用2 9個柱體積的蒸餾水和2 6個柱體積的0.01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液淋洗柱子，以每0. 25 2個柱體積收集為一個流份；e)合并含有芥子苷類化合物的所有流份，在35 60°C減壓濃縮至干；f)用甲醇對總芥子苷類化合物進行脫鹽，并將得到的甲醇濾液在35 60°C減壓濃縮到無甲醇溶劑；g)用蒸餾水溶解總芥子苷類化合物，在-50°C凍干，得總芥子苷類化合物的固體粉末；h)將所得到的總芥子苷類化合物的固體粉末用洗脫液配制成溶液后，加入到用洗脫液平衡的ODS-BP柱中；用1 10個柱體積的洗脫液淋洗柱子，即可分別收集到原告依春 (progoitrin)、表原告依春(印iprogoitrin)及3-丁烯基硫甙(gluconapin)的流份；所述洗脫液為蒸餾水或0. 01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液；i)當(dāng)步驟h)中所用洗脫液為蒸餾水時，將收集到的progoitrin、印iprogoitrin及 gluconapin的流份分別在40°C減壓濃縮至無溶劑滴出，然后在-50°C凍干；當(dāng)步驟h)中所用洗脫液為0. 01 0. 5mol/L的硝酸鉀水溶液時，將收集到的progoitrin、印iprogoitrin 及gluconapin的流份分別按步驟e)、f)、g)所述操作進行后處理；j)重復(fù)步驟h)至步驟i)，即可分離得到progoitrin、印iprogoitrin及gluconapin 的3個純品的固體粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，步驟a) 中用于提取板藍(lán)根藥材粉末的醇水溶劑是體積百分比為50% 95%的乙醇水溶液或體積百分比為50% 100%的甲醇水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，步驟a) 中用于提取板藍(lán)根藥材粉末的醇水溶劑的體積(ml)為板藍(lán)根藥材粉末重量(g)的5 12 倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，步驟c) 中所述的酸性氧化鋁的粒徑為100 200目或200 300目。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，步驟c) 中所述的酸性氧化鋁的重量與濃縮液所用藥材的重量之比為20 2:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離板藍(lán)根中芥子苷類化合物的方法，其特征在于，步驟h) 中所述的ODS-BP柱的填料重量與總芥子苷類化合物的固體粉末的重量之比為100 10:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離板藍(lán)根中主要芥子苷類化合物原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫甙的方法。所述方法是首先用醇水溶劑回流提取板藍(lán)根藥材粉末，再將提取物經(jīng)酸性氧化鋁柱層析，然后用ODS-BP反相硅膠柱分離而得。用本發(fā)明方法分離得到的原告依春、表原告依春及3-丁烯基硫甙的純度均可達(dá)到98%，且重現(xiàn)性好、產(chǎn)率高、經(jīng)濟且環(huán)保，及操作簡單方便、周期短、可規(guī)模化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)無法高效、經(jīng)濟及高純度分離原告依春和表原告依春這類羥基脂肪族芥子苷的一對手性立體異構(gòu)體的難題，對研究板藍(lán)根的有效成分及其藥理作用具有深遠(yuǎn)意義。
文檔編號C07H1/08GK102399247SQ20101028617
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月19日
發(fā)明者李醫(yī)明, 王瑞, 王錚濤, 謝智勇 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)