專利名稱：一種酵母表達的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制備方法，具體地說是一種牛乳鐵蛋白衍生來源的抗菌蛋白片段的真核表達及其產品制備方法。
背景技術：
乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是一種天然非血紅素鐵結合糖蛋白，主要由乳腺上皮細胞表達和分泌，廣泛分布于哺乳動物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，是哺乳動物非特異性免疫和獲得性免疫反應重要的介導分子。乳鐵蛋白是一個多效性的分子，除全長蛋白的鐵離子結合能力外，乳鐵蛋白及其降解產物如N-lobe、C-lobe、N-端抗菌肽——乳鐵蛋白肽和乳鐵蛋白兩親肽等衍生片段在廣譜抗菌、抗炎癥反應、抑制腫瘤生長、調節(jié)免疫動態(tài)平衡、轉錄調節(jié)、蛋白和核糖核酸酶作用等過程中起直接輔助作用，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品、化妝品和飼料添加劑。根據蛋白藥物分子設計原理和方法，本發(fā)明以抗金黃色葡萄球菌為目標，以牛乳鐵蛋白作為出發(fā)抗菌蛋白模板，創(chuàng)新性設計篩選和高效表達具有特異性抗金黃色葡萄球菌活性的抗菌多肽片段，具有重要的人與動物臨床和預防醫(yī)學意義。金黃色葡萄球菌是人和動物的重要病原菌之一，常引起鼻腔、口腔粘膜以及皮膚和上皮組織的感染，在獸醫(yī)臨床主要引起牛、羊的乳房炎，犬、貓的鼻炎、外耳炎，豬的敗血癥，雞的水腫癥等。金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性球菌病對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失，對公共衛(wèi)生尤其是相關從業(yè)人員的生命安全構成嚴重威脅。此外，乳鐵蛋白完整分子的工業(yè)化和商業(yè)化應用也已取得了很大進展，已成為目前國內外研究的熱點。美國食品藥品管理局已于2001年批準乳鐵蛋白作為食品添加劑用于運動和功能性食品中，其抗金黃色葡萄球菌的特異性和活性都不是很高，難以滿足臨床和預防醫(yī)學的實際需求。而小分子量抗菌肽的制備和純化存在分離成本很高，價格昂貴，一時難以推廣普及滿足生產需求。應用基因工程技術在體外高效表達重組乳鐵蛋白衍生抗菌片段，提高表達量和結構穩(wěn)定性，有望為解決抗菌肽替代抗生素這一問題提供了有效思路。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供的牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達及其產品制備方法的目的在于開展牛乳鐵蛋白衍生抗菌分子BLfA的設計篩選、重組畢赤酵母構建和轉抗菌蛋白酵母的高密度發(fā)酵研究，以突破乳鐵蛋白外源表達、翻譯后修飾及重組蛋白純化的技術瓶頸，獲得安全、環(huán)保、高產、高效的基因工程重組乳鐵蛋白及其衍生抗菌蛋白，推進新型抗菌蛋白的工業(yè)化應用進程。同時將為新型抗菌蛋白的分子設計、構效關系研究和乳源抗菌蛋白產業(yè)化提供理論支持。本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)。以牛乳鐵蛋白分子序列為出發(fā)模板，借助計算機輔助設計手段，通過分子設計選定抗金黃色葡萄球菌導向的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA基因序列，全長1032個堿基，編碼344個氨基酸殘基，利用畢赤巴斯德酵母進行真核表達、包括可能發(fā)生的糖基化修飾在內，推算表達產生的重組蛋白分子量約為43KD。牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA序列及其推導的氨基酸序列為
1ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC
1MAPRKNVRWCTISQPEWFKC
61CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG
21RRffQffRMKKLGAPSITCVRR
121GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG
41AFALECIRAIAEKKADAVTL
181GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA
61DGGMVFEAGRDPYKLRPVAA
241GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG
81EIYGTKESPQTHYYAVAVVK
301AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT
101KGSNFQLDQLQGRKSCHTGL
361GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA
121GRSAGffI IPMGILRPYLSffT
421GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC
141ESLEPLQGAVAKFFSASCVP
481TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC
161CIDRQAYPNLCQLCKGEGEN
541CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG
181QCACSSREPYFGYSGAFKCL
601CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA
201QDGAGDVAFVKETTVFENLP
661GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG
221EKADRDQYELLCLNNSRAPV
721GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT
241DAFKECHLAQVPSHAVVARS
781GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA
261VDGKEDLIffKLLSKAQEKFG
841AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG
281KNKSRSFQLFGSPPGQRDLL
901TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC
301FKDSALGFLRIPSKVDSALY
961CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG
321LGSRYLTTLKNLRETAEEVK
1021GCGCGGTACACC
341 ARYT本發(fā)明提供的牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達及其產品制備方法，其步驟如下1、從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了 BLf全長cDNA ；2、以BLf全長cDNA為模板，設計引物PCR擴增了 BLfA編碼基因；3、構建了 Pichia. pastoris重組表達載體pPICBLfA，BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達，在甲醇誘導30h后達搖瓶水平最大表達量485mg/L;rBLfA經Ni-NTA His-Bind 樹脂純化后純度為93. 8% ；重組蛋白的去糖基化反應結果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；4、進行 rBLfA 的 Fe3+結合能力為 0. 330，rBLfA釋放!^e3+的 pH 范圍為 pH 7. 0-3. 5 ；5、rBLfA抑菌活性測定結果顯示，rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌 Staphyloccocus. aureus 白勺功倉泛，MIC 為 6· 5 μ mol/L ；6、表達rBLfA的重組菌株經過5升發(fā)酵罐水平上的高密度發(fā)酵，分泌的目標蛋白質產量達到499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內與rBLfA共表達，使 rBLfA發(fā)酵罐水平的表達量提高了 23%，達6i;3mg/L，CO差光譜的結果表明，VHb在重組菌 X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表達。采用本發(fā)明的方法生產的產品在醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料等行業(yè)有廣闊的應用前景，提高機體免疫力，替代抗生素。本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在UBLfA基本保持了其在天然牛乳鐵蛋白中的原有結構，并具有4個牛乳鐵蛋白分子中最強的分子表面陽離子特性。脫鐵(apo)的rBLfA和rBLf均可導致金黃色葡萄球菌 S. aureus ATCC 25923的存活率下降，具有延緩S. aureus生長的作用，其中rBLfA的抑生長作用優(yōu)于對照產品牛乳鐵蛋白(純度為90%，Sigma, L9507)。2、甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母對甲醇的利用過程中，溶解氧的傳遞極為重要。Vgb的異源表達能改善重組畢赤酵母細胞內部氧的儲存與傳遞。VHb在重組菌X-33 (rBLfA-VHb)中的表達具有促進搖瓶和發(fā)酵罐水平重組菌的生長狀況及rBLfA合成能力的作用，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達量提高了 23%，達6i;3mg/L。3、由于抗菌肽分子量小，在構建重組載體和重組蛋白分離純化時難度大，表達量不高，融合蛋白切割效率低，以及陽離子性和溶血性較強，多聚體毒性高等抗菌肽本身的特殊性質限制了其產業(yè)化進程。本研究的牛乳鐵蛋白衍生抗菌分子BLfA重組畢赤酵母細胞高密度發(fā)酵突破了乳鐵蛋白外源表達、翻譯后修飾及重組蛋白純化的技術瓶頸，能夠獲得安全、環(huán)保、高產、高效的基因工程重組乳鐵蛋白衍生抗菌蛋白，以期推進新型抗菌蛋白的工業(yè)化應用進程。


圖IrBLfA和對照牛乳鐵蛋白的抑菌效果圖2重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖3重組蛋白的純化圖4WeStern blot分析重組蛋白的去糖基化
圖5重組菌的CO差光譜分析下面結合附圖對本發(fā)明做進一步說明。圖IrBLfA和對照牛乳鐵蛋白的抑菌效果，為rBLfA和對照牛乳鐵蛋白37°C分別作用Ih后金黃色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923的存活率(CFU/mL)，其中樣品為Apo rBLfA 和Apo對照牛乳鐵蛋白，處理濃度分別為0,3. 13，6. 25，12. 5，25和50μ mol/L圖2重組蛋白的SDS-PAGE電泳，為重組菌X_33 (rBLfA-VHb)和X_33 (rBLfA)發(fā)酵罐水平表達rBLfA (A，B)，其中泳道1為蛋白質分子量標準，從上至下依次為66. 2，45. 0， 33. 0,26.0, 20. OkDa ；泳道2-9分別為誘導時間為12，24，36，48，60，72小時的發(fā)酵重組蛋白產物。圖3重組蛋白的純化，為畢赤酵母表達重組蛋白rBLfA的純化，其中泳道1為蛋白質分子量標準，從上至下依次為94. 0，66. 2，45. 0，33. 0,26. 0,20. 0,14. 4kDa ；泳道2-4分別為鎳柱純化后rBLfA蛋白。
圖4WeStern blot分析重組蛋白的去糖基化，為flfestern blot分析畢赤酵母表達重組蛋白rBLfA的去糖基化，兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗血清作為一抗，堿性磷酸酶標記的羊抗兔作為二抗，其中泳道1為預染蛋白質分子量標準，從上至下依次為89. 0，45. 0，34. 0， 25. 0，19. OkDa ；泳道2為rBLfA ；泳道3為經過Endo H處理的rBLfA。
圖5重組菌的CO差光譜分析，為重組菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光譜分析，圖中橫坐標為波長，縱坐標為吸光值。 具體實施例方式本發(fā)明提供的一種牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達及其制備方法的具體實施方式
如下1、從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了 BLf全長cDNA ；使用Trizol試劑提取牛乳腺組織總RNA，以荷斯坦奶牛乳腺組織總RNA為模板，兩步法RT-PCR擴增BLf cDNA全長分子，第一步為反轉錄，即合成第一鏈cDNA，RT-PCR第二步為PCR擴增，以第一鏈cDNA為模板進行 PCR 擴增，特異性引物序列為Pl :gTCCCATggCCCCgAggAAAAACgTTCgATggTgTA ；P2 ACgTCgACCCCTCgTCAggAAggCgCAg。2、以BLf全長cDNA為模板，設計引物PCR擴增了 BLfA編碼基因，引物為P1 ggAATTCgCCCCgAggAAAAACg ；P2 gCTCTAgAgCCCTggTgTACCgCgCCTTCA 3、構建了 P. pastoris重組表達載體pPICBLfA，用限制性內切酶Rne I線性化，將線形化的重組載體回收純化，分別電擊轉化P. pastoris X-33感受態(tài)細胞。4、BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達，在甲醇誘導30h后達搖瓶水平最大表達量485mg/L ；rBLfA經Ni-NTA His-Bind樹脂純化后純度為93. 8%;兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗血清作為一抗，堿性磷酸酶標記的羊抗兔作為二抗，進行了 SDS-PAGE和Western Blot 分析重組蛋白的糖基化，結果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；5、rBLfA的!^3+結合能力測定(1)將鐵飽和重組蛋白通過超濾置于pH值分別為7.0，6. 5，6.0，5. 5，5.0，4. 5， 4. 0,3. 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，4°C靜置Mh ；(2)超濾去除多余的鹽及鐵離子；(3)酶標儀測定465nm處光吸收值，以對照牛乳鐵蛋白鐵飽和狀態(tài)(pH8. 0)下0D465nm值為100%，估算出不同pH條件下rBLFA的鐵飽和度。rBLfA 的 Fe3+ 結合能力為 0. 330，rBLfA 釋放 Fe3+ 的 pH 范圍為 pH 7. 0-3. 5。6、rBLfA的抑菌活性檢測(1)甘油管保存的金黃色葡萄球菌(S. aureus ATCC 25923)在MHB平板劃線，于 37 °C活化培養(yǎng)；(2)挑取單菌落，37 °C，240rpm振蕩過夜培養(yǎng)至0D600nm為 0. 2-0. 4(7. 2 X 108-1. 44 X 109CFUs/mL)；(3)收集1. 5mL菌液，等體積生理鹽水洗滌兩次，重懸于等體積生理鹽水中；(4)將倍比稀釋后不同濃度的待測抗菌樣品溶液100 μ L分別加到滅菌的96孔板中，濃度分別為50，25，12. 5,6. 25 ( μ mol/μ L)，陽性對照為50 μ mo 1/LAmp,陰性對照為生理鹽水；(5)向每孔中加ΙΟΟμΙ菌液，密封后置37°C中孵育lh。樣品的終濃度為6，3，1.5， 0. 75 ( μ g/ μ L)；(6)將溫育后的樣品梯度稀釋為10-4、10_5、10-6，各取50 μ L，涂平板；(7)待菌液吸收后，封口，倒置，370C，靜置培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落，菌落計數，計算CFU。rBLfA的抑菌活性檢測結果顯示rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌S. aureus生長的功能，MIC 為 6. 5ymol/L;7、表達rBLfA的重組菌株進行了細胞高密度發(fā)酵，產量為499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內與rBLfA共表達，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達量提高了 23 %，達 613mg/L。8、重組菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光譜測定(1)使VHb在過量的Naj2O4的還原作用下由原始狀態(tài)轉變?yōu)檫€原態(tài)；(2)向預處理后的X-33 (rBLfA-VHb)的無細胞提取液中通入CO氣體，溶液逐漸由無色變?yōu)闇\紅色；(3)分光光度計掃描、計算、分析400-500nm之間的差光譜。CO差光譜的結果表明，整合有vgb基因的X-33 (rBLfA-VHb)的無細胞提取液樣品在419nm處有一明顯的波峰出現(xiàn)，而對照組X_33 (rBLfA)則無特征性波峰出現(xiàn)，證明VHb在重組菌X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表達。
權利要求
1.一種酵母表達的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA，其特征是具有4個牛乳鐵蛋白分子中最強的分子表面陽離子特性，其中牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA基因的核苷酸序列為1 ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC 61 CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG 121 GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG 181 GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA 241 GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG 301 AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT 361 GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA 421 GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC 481 TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC 541 CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG 601 CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA 661 GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG 721 GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT 781 GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA 841 AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG 901 TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC 961 CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG 1021 GCGCGGTACACC
2.一種制備權利要求1所述的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA的制備方法，其特征是(1)從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了BLf全長cDNA ；以BLf全長cDNA為模板，設計引物PCR擴增了 BLfA編碼基因；(2)構建了Pichia. pastoris重組表達載體pPICBLfA，BLfA在畢赤酵母搖瓶水平得到分泌表達，在甲醇誘導30h后達搖瓶水平最大表達量485mg/L ；rBLfA經Ni-NTA His-Bind 樹脂純化后純度為93. 8% ；重組蛋白的去糖基化反應結果顯示，rBLfA被糖基化修飾，表觀分子量為43. OkDa ；(3)表達的rBLfA的重組菌株進行了細胞高密度發(fā)酵，產量分別為499mg/L，利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內與rBLfA共表達，使rBLfA發(fā)酵罐水平的表達量提高了 23%，達6i;3mg/L，CO差光譜的結果表明，VHb在重組菌X_33 (rBLfA_VHb)中得到了有效的表達。結果，rBLfA的Fe3+結合能力為0. 330，rBLfA釋放Fe3+的pH范圍為pH 7. 0-3. 5 ；rBLfA 具有抑制金黃色葡萄球菌Maphyloccocus. aureus生長的功能，MIC為6. 5 μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因工程抗菌蛋白的制備方法，具體地說是一種牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA的真核表達蛋白及其制備方法。從荷斯坦奶牛乳腺組織中克隆了BLfA編碼基因并構建重組表達載體，實現(xiàn)其在畢赤酵母中表達，搖瓶和5升發(fā)酵罐最大表達量分別為485和499mg/L；利用透明顫菌血紅蛋白VHb在宿主菌胞內與rBLfA共表達，表達量提高了23％，達613mg/L；rBLfA經親和純化，純度為93.8％；鐵結合實驗表明，rBLfA的Fe3+結合能力為0.330，釋放Fe3+的pH范圍為7.0-3.5；rBLfA具有抑制金黃色葡萄球菌生長的功能，MIC為6.5μmol/L。
文檔編號C07K14/79GK102408480SQ20101028687
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權日2010年9月20日
發(fā)明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 白雪晶 申請人:中國農業(yè)科學院飼料研究所