專利名稱：胰島素b鏈hla-a*0201限制性ctl表位改造肽配體及其獲得方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改造肽配體(altered peptide ligand, APL)，特別涉及胰島素B 鏈HLA-A*0201限制性CTL (細胞毒性T淋巴細胞)表位mInsB5_14的APL，還涉及該APL的 獲得方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I型糖尿病(Type I diabetes)是由淋巴細胞介導(dǎo)的以胰島0細胞特異性損傷 導(dǎo)致胰島素生成絕對不足為特征的一種自身免疫性疾病。I型糖尿病多發(fā)生在兒童和青少 年，起病急，如不及時治療可引發(fā)累及心、肝、腎、神經(jīng)、眼等重要組織器官的嚴重并發(fā)癥，是 兒童和青少年致殘及早亡的主要原因之一。近年來，我國兒童和青少年患I型糖尿病的人 數(shù)逐年遞增，I型糖尿病正在成為危害我國兒童和青少年健康的主要疾病。目前，I型糖 尿病以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，治療費用高昂且副作用 大，因此，急需建立一種特異性免疫干預(yù)治療策略。大量動物實驗證實，給非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接種自身抗原，可以減 緩甚至完全阻斷I型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，不管是糖尿病患者還是NOD小鼠， 自身反應(yīng)性Thl細胞在I型糖尿病的致病機制中占中心地位，因此，近年來發(fā)展了用自身反 應(yīng)性CD4+T細胞表位替代完整自身抗原來誘導(dǎo)免疫耐受的策略。相對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子 天然抗原，小分子表位肽具有更易誘導(dǎo)免疫耐受、相對安全、易于實現(xiàn)規(guī)?；苽浜图兓?優(yōu)點，最為重要的是可以通過一些氨基酸位點的化學(xué)修飾最大限度地增強其免疫調(diào)節(jié)的能 力。例如，源于胰島素B鏈的mInsB9_23是優(yōu)勢性自身反應(yīng)性⑶4+T細胞表位，Alleva等采 用丙氨酸突變掃描技術(shù)篩選出一條將mInsB9_23的第16位和第19位氨基酸同時替換為丙 氨酸的APL，該APL免疫NOD小鼠后可以有效誘導(dǎo)Thl — Th2型應(yīng)答轉(zhuǎn)換，從而阻斷I型糖 尿病的發(fā)生。源于熱休克蛋白60的Hsp6 0437_46(1也是一個優(yōu)勢性自身反應(yīng)性CD4+細胞表位， Raz等將其第6位和第11位的氨基酸同時替換為纈氨酸后獲得了一條穩(wěn)定性更強的APL， 該APL可以有效誘導(dǎo)Thl —Th2型應(yīng)答轉(zhuǎn)換，在一定程度上減輕或者阻斷0細胞的免疫損 傷，但臨床研究顯示其對I型糖尿病的防治效果卻因人而異，可能是由于免疫應(yīng)答類型轉(zhuǎn) 換在尺度上很難把握，一旦Th2輔助的體液免疫過分加強后，疾病最終轉(zhuǎn)歸則變得難以預(yù) 料，這使得以調(diào)節(jié)⑶4+T細胞應(yīng)答為目的的免疫干預(yù)策略陷于尷尬境地。近年來在NOD小鼠模型研究中有愈來愈多的證據(jù)表明自身反應(yīng)性CD8+T細胞(即 CTL)在I型糖尿病中同樣具有十分重要的致病作用，其識別0細胞上的自身抗原CTL表位 與MHC-I類分子形成的復(fù)合物，通過Fas/FasL、釋放穿孔素等途徑直接殺傷0細胞。已有 研究利用自身抗原CTL表位或其APL在NOD小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)了特異性CTL免疫耐受，對 I型糖尿病有一定的防治作用。同時研究報道，I型糖尿病的發(fā)生與人類HLA_A*0201分子密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，約 60%的I型糖尿病患者攜帶HLA-A*0201等位基因。在HLA_A*0201轉(zhuǎn)基因N0D小鼠[N0D.129P2 (B6) - 0 2ffltmlUncTg (HLA-A/H2-D/ 0 2M)]中，I型糖尿病的發(fā)病時間較普通NOD小鼠提前 且程度加重，是良好的人源化動物模型。近年來已陸續(xù)鑒定出一系列人和小鼠I型糖尿病 自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在較高的人、鼠交叉反應(yīng)性。因此，利用 人源化NOD小鼠篩選對自身反應(yīng)性CTL具有負調(diào)節(jié)效應(yīng)的APL，對于人類I型糖尿病的防治
研究具有重要意義。在人源化NOD小鼠中，源于胰島素B鏈的mInsB5_14(即鼠源胰島素B鏈第5到14 位氨基酸)已被證實為HLA-A*0201限制的免疫優(yōu)勢性CTL表位，且與人源表位具有高度的 交叉反應(yīng)性。因而，通過改造天然表位111111紐5_14來獲得在HLA-A*0201背景下能顯著下調(diào) mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水平的APL，對于人類I型糖尿病的防治研究具有重要的實際意 義和良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種胰島素B鏈HLA_A*0201限制性CTL表 位mInsB5_14的APL，其在HLA_A*0201背景下能顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答 水平；目的之二在于提供所述APL的獲得方法，該方法同樣適用于其它自身免疫疾病中自 身抗原的改造及其APL的篩選，可為治療性負調(diào)疫苗的設(shè)計和研制提供有用的工具；目的 之三在于提供所述APL在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1、胰島素 B 鏈 HLA_A*0201 限制性 CTL 表位 APL，由 His-Leu-Cys-Gly-Pro-Phe-Le u-Val-Glu-Gla所示的氨基酸序列組成，是將鼠源胰島素B鏈HLA_A*0201限制性CTL表位 mInsB5_14的第6位組氨酸替換為苯丙氨酸而得。2、所述胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位APL的獲得方法，其特征在于包 括以下步驟a、利用計算機模擬技術(shù)建立胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB5_14與 HLA-A*0201分子的二元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，再進一步建立上述二元復(fù)合物與T細胞抗原受體 (TCR)的三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，分析天然表位mInsB5_14*潛在的TCR主要作用位點；b、對步驟a所得天然表位mInsB5_14*潛在的TCR主要作用位點進行單氨基酸殘基 突變，獲得一系列天然表位mInsB5_14的候選APL，對這些候選APL進行計算機分析，從中篩 選出與HLA-A2分子親和力高于天然表位、且空間構(gòu)象和天然表位接近的候選APL ；c、合成步驟b篩選出的候選APL，通過細胞功能實驗從中鑒定出在HLA_A*0201背 景下能夠顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水平的APL，即得本發(fā)明所述胰島素 B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位APL。3、所述胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位APL在制備I型糖尿病治療性負 調(diào)肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表 位mInsB5_14的APL，其在HLA_A*0201背景下能顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答 水平，并具有易于規(guī)?；苽浜图兓?、使用安全等特點，可單獨或聯(lián)合其他免疫顯性自身抗 原CTL表位APL應(yīng)用于I型糖尿病治療性負調(diào)肽疫苗的研制，在I型糖尿病治療領(lǐng)域具有 較好的應(yīng)用前景；本發(fā)明還提供了獲得所述APL的方法，該方法同樣適用于其它自身免疫疾病中自身抗原的改造及其APL的篩選，能夠有效指導(dǎo)后續(xù)研究，減少肽合成與細胞功能 實驗的工作量，降低研究成本，加快研究進度，從而為治療性負調(diào)疫苗的設(shè)計和研制提供有 用的工具。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中圖1為TCR-HLA-A*020 l-mInsB5_14三元復(fù)合物的模擬結(jié)構(gòu)，其中箭頭a所指為TCR ； 箭頭b所指為mInsB5_14 ；箭頭c所指為HLA_A*0201分子；箭頭d所指為mInsB5_14第6位點。圖2為天然表位mInsB5_14和候選APL mInsB5_14H6F在HLA_A*0201分子結(jié)合槽中 的構(gòu)象，其中HLA-A*0201分子以表面靜電勢能圖顯示。圖3為合成的候選APL mInsB5_14H6F的高效液相色譜圖和質(zhì)譜圖。圖4為候選APL mInsB5_14H6F與HLA_A*0201分子的親和力檢測結(jié)果。圖5為HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因NOD小鼠的PCR鑒定結(jié)果，其中1泳道為DNA分子量標 準，2泳道為待測小鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物，3泳道為內(nèi)參照的PCR產(chǎn)物。圖6為ELISpot法檢測候選APL mInsB5_14H6F刺激天然表位mInsB5_14特異性CTL 分泌IFN-Y的能力。圖7為胞內(nèi)因子染色法檢測候選APL mInsB5_14H6F刺激天然表位mInsB5_14特異性 CTL分泌IFN-Y的能力。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。一、建立TCR-HLA-A ± 020l_mInsB5_14三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，確定天然表位 mInsB5_14中潛在的TCR主要作用位點采用Insight II軟件先建立天然表位mInsB5_14(氨基酸序列為HLCGPHLVEA)與 HLA-A*0201分子的二元復(fù)合物(pMHC)結(jié)構(gòu)模型，再進一步建立pMHC與TCR的三元復(fù)合物 結(jié)構(gòu)模型(圖1)，分析天然表位mInsB5_14*可能與TCR發(fā)生作用的氨基酸殘基位點。結(jié)果 顯示，天然表位mInsB5_14中的第5位點和第6位點均為潛在的TCR主要作用位點，但第5位 點的脯氨酸殘基對多肽構(gòu)象的影響較大，因此本發(fā)明僅將第6位點作為改造位點。二、對天然表位mInsB5_14*潛在的TCR主要作用位點進行單氨基酸殘基突變，從中 篩選出與HLA-A2分子親和力高于天然表位、且空間構(gòu)象和天然表位接近的候選APL采用Insightll軟件，首先，以天然表位mInsB5_14與HLA_A*0201分子的二元復(fù)合 物結(jié)構(gòu)模型為模板，定義距天然表位mInsB5_145 A范圍內(nèi)的HLA_A*0201分子中的氨基酸殘 基為作用位點，對天然表位mInsB5_14與前述定義為作用位點的HLA-A*0201分子中的氨基 酸殘基進行分子動力學(xué)計算；然后，將天然表位mInsB5_14中第6位點的組氨酸殘基(H)分 別進行保守或不保守的單氨基酸殘基爾、1 、￡、￥、0、1、1或6)突變，獲得一系列候選APL， 分別對這些候選APL與前述定義為作用位點的HLA-A*0201分子中的氨基酸殘基進行分子 動力學(xué)計算；最后，采用discovery studio 2. 5. 5內(nèi)嵌模塊MM-PBSA計算突變前后多肽與 HLA-A*0201分子結(jié)合自由能的變化值，并將所得候選APL的空間構(gòu)象與天然表位mInsB5_14
5的空間構(gòu)象進行分子重疊，計算候選APL中a碳(Ca)原子相對天然表位mInsB5_14的 RMSD 值。結(jié)果如表1和圖2所示，當天然表位mInsB5_14中第6位點的組氨酸殘基(H)突變 為苯丙氨酸殘基(F)時，與HLA-A*0201分子的結(jié)合自由能變化最大(A AG = -7. 747kcal/ mol, A AG值越負表示該候選APL與HLA_A*0201分子的親和力越大)，而且C a原子相對 天然表位mInsB5_14的RMSD值最小(RMSDea = 0. 38，RMSDCa值越小表示該候選APL的空間 構(gòu)象與天然表位的空間構(gòu)象越接近)，因此，推測候選APL mInsB5_14H6F為目標APL。表1候選APL相對天然表位mInsB5_14的A A G值和RMSDCa值
APL氨基酸序列AAG(kcal/mol)RMSDeamInsB5.14H6FHLCGPFLVEA-7.7470.380mInsB5.14H6RHLCGPRLVEA2.5451.432mInsB5-14臓HLCGPELVEA-1.2430.467mInsB5..14H6YHLCGPYLVEA-3.3720.603mInsB5..14H6QHLCGPQLVEA-0.4450.512mInsB5.]4H6LHLCGPLLVEA11.0870.523mInsB5.14H6THLCGPTLVEA23.0570.934mInsB5..14H6GHLCGPGLVEA2.9880.567三、合成篩選出的候選APL，通過細胞功能實驗從中鑒定出在HLA-A女0201背景下 能夠顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水平的APL1、候選APL的合成、純化及鑒定候選APL mInsB5_14H6F委托杭州中肽生化有限公司進行合成，合成方案采用標準 Fmoc方案，即由去保護和激活交聯(lián)兩個反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直至合成目的多肽，獲得的目的多肽 粗品用高效液相色譜法進行純化，純化后的目的多肽經(jīng)反相高效液相色譜法鑒定純度為 97. 4%，經(jīng)質(zhì)譜法鑒定分子量與理論值一致(圖3)，最后冷凍干燥，溫度-70°C保存?zhèn)溆谩?、候選APL與HLA_A*0201分子的親和力檢測采用HLA_A*0201表達陽性但內(nèi)源性抗原肽遞呈途徑必需的抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運 體(TAP)缺陷的T2細胞株進行實驗，未與內(nèi)源性抗原肽結(jié)合的HLA-A*0201分子在T2細胞 表面的表達極不穩(wěn)定，很快發(fā)生降解；而與外源性抗原肽結(jié)合的HLA-A*0201分子可以在T2 細胞表面穩(wěn)定地表達，且表達量與外源性抗原肽和HLA-A*0201分子的親和力呈正相關(guān)。實驗分為4組APL組mInSB5_14H6F ；天然表位組mInSB5_14 ；陽性對照組 HIV476_484 (氨基酸序列為ILKEPVHGV)；陰性對照組0VA (氨基酸序列為AHTK-DGFNF)。將 1 X 106個T2細胞懸于1ml含有濃度為100 u g/ml的肽(按實驗分組加入相應(yīng)肽)、濃度為 3 u g/ml的0 2微球蛋白的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，在溫度為37°C、C02氣體體積分數(shù) 為5%的條件下孵育18小時，用PBS洗滌細胞2次，加入BB7. 2雜交瘤細胞分泌的鼠抗人 HLA-A*0201單克隆抗體100 u 1，4°C孵育30分鐘，再用PBS洗滌細胞2次，加入按體積比為1 50或1 100稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體100iil，4°C孵育30分鐘，用 PBS洗滌并重懸細胞后，用流式細胞儀(Becton-Dickinson公司)于波長488nm處測定熒光 強度，計算平均熒光強度百分數(shù)(％ MFI)。結(jié)果如圖4所示，候選APL mInsB5_14H6F與HLA_A*0201分子的親和力(％ MFI = 2. 44)與天然表位 mInsB5_14(% MFI = 2. 81)相當。3、候選APL刺激天然表位mInsB5_14特異性CTL分泌細胞因子IFN_ y能力檢測(1)HLA_A*0201轉(zhuǎn)基因NOD小鼠的鑒定取實驗小鼠組織0. lg，用基因組DNA提取試劑盒(TIANgen公司)抽提得到濃度為 60 100ng/iil的基因組DNA 50 yl，經(jīng)紫外分光光度法檢測其A260/280為1. 80 2. 00， 滿足后續(xù)實驗要求。根據(jù) Jackson 官方網(wǎng)站(http//jaxmice. jax. org/strain/006611. html#genes)提供的PCR鑒定HLA-A2基因型方法鑒定實驗小鼠是否為HLA_A*0201轉(zhuǎn) 基因N0D小鼠。結(jié)果如圖5所示，從實驗小鼠的基因組DNA中擴增出了長度約300bp的 HLA-A*0201基因片段，證實實驗小鼠為HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因N0D小鼠。(2) ELISpot法檢測候選APL刺激天然表位mInsB5_14特異性CTL分泌IFN- y的能 力選擇16 20周齡雌性HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因N0D小鼠，用0NET0UCH Ultra血糖 儀(強生公司)每周監(jiān)測小鼠血糖值變化，取血糖值< 11. lmol/L的糖尿病前驅(qū)期小鼠進 行實驗。實驗分為4組APL組mInSB5_14H6F ；天然表位組mInSB5_14 ；陰性對照組0VA ；空 白對照組只加入濃度為10IU/ml的小鼠白介素2(mIL-2)維持而不加任何刺激物。采用 密度梯度離心法從小鼠脾臟中分離脾臟單個核細胞(SPMC)，同時沖洗小鼠股骨骨髓腔獲 得骨髓細胞。將小鼠骨髓細胞用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度至 2X105/ml,以5ml/孔接種至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入終濃度為50ng/ml的小鼠集落刺激因 子(mGM-CSF)和終濃度為lOng/ml的小鼠白細胞介素4 (mIL_4)，在溫度為37°C、C02氣體體 積分數(shù)為5%的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。每2天1/3量更換培養(yǎng)基并補加mGM-CSF和mIL_4，第6 天加入終濃度為5ng/ml的腫瘤壞死因子-a (TNF_ a )，第7天收獲細胞，得成熟的骨髓來 源樹突狀細胞(BMDC)，用流式細胞儀檢測BMDC表面分子⑶11c、⑶80驗證BMDC的純度和 成熟度，保存?zhèn)溆?。將小鼠SPMC用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞濃度至 1.0X106/ml,以1ml/孔接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔加入終濃度為10 y g/ml的mInsB5_14 (空 白對照組不加)和終濃度為10IU/ml的mIL-2，在溫度為371、0)2氣體體積分數(shù)為5%的條 件下刺激培養(yǎng)28天(共4個周期)，每2天1/3量更換培養(yǎng)基并補加mIL-2，按實驗分組每 7天補加負載相應(yīng)肽的同源BMDC (將BMDC以1X105/孔接種于48孔培養(yǎng)板中，加入終濃度 為10 y g/孔的肽進行刺激，第7天按BMDC與SPMC的數(shù)量比為1 10加入經(jīng)mInsB5_14刺 激過的SPMC中)，獲得經(jīng)不同肽刺激的mInsB5_14特異性CTL。采用ELISpot試劑盒(達科 為公司)檢測上述經(jīng)不同肽刺激的mInsB5_14特異性CTL分泌IFN- y的能力調(diào)整CTL濃 度至1. 0X106/ml，取100 ill鋪板，按實驗分組加入終濃度為10ii g/ml的相應(yīng)肽，刺激36 小時后去除細胞，再按試劑盒說明書依次加入一抗、二抗和顯色劑進行反應(yīng)，顯色晾干后讀 數(shù)。結(jié)果如圖6所示，APL組分泌IFN- y的能力明顯低于天然表位組(P < 0. 01)，陰 性對照組分泌IFN-y的能力與天然表位組相當，證實候選APL mInsB5_14H6F是具有特異性
7負調(diào)作用的APL，在HLA-A*0201背景下能夠顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水 平。(2)胞內(nèi)因子染色法檢測候選APL刺激天然表位mInsB5_14特異性CTL分泌IFN- y 的能力選擇16 20周齡雌性HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因NOD小鼠，用0NET0UCH Ultra血糖儀 每周監(jiān)測小鼠血糖值變化，取血糖值< 11. lmol/L的糖尿病前驅(qū)期小鼠進行實驗。實驗分 為5組APL組mInSB54_14H6F ；天然表位組mInSB5_14 ；陽性對照組刀豆素A(ConA)；陰性 對照組0VA ；空白對照組只加入濃度為10IU/ml的mIL-2維持而不加任何刺激物。將溶 于完全弗氏佐劑(CFA)的mInsB5_14經(jīng)腹腔免疫小鼠，每7天免疫1次，共免疫2次，于末次 免疫后的第3天，采用密度梯度離心法從免疫小鼠脾臟中分離SPMC，按前述方法進行培養(yǎng)， 用mInsB5_14刺激1個周期后，按實驗分組加入負載相應(yīng)肽的同源BMDC，于第2個周期的第 3天，按實驗分組加入終濃度為10 u g/ml的相應(yīng)肽或終濃度為5 u g/ml的ConA，再加入高 爾基阻斷劑0.7 iil，6小時后用胞內(nèi)因子染色試劑盒(eBioscience公司)對CTL表面分子 CD3、CD8以及胞內(nèi)因子IFN-Y進行染色，按照試劑盒說明書操作，用流式細胞儀測定，檢測 經(jīng)不同肽刺激的mInsB5_14特異性CTL中分泌IFN- Y的T細胞(即CD3+CD8+IFN- y +T細胞) 所占的百分率。結(jié)果如圖7所示，APL組分泌IFN- y的能力明顯低于天然表位組(P < 0. 01)，陰 性對照組分泌IFN-y的能力與天然表位組相當，證實候選APL mInsB5_14H6F是具有特異性 負調(diào)作用的APL，在HLA-A*0201背景下能夠顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水 平。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
胰島素B鏈HLA A*0201限制性CTL表位改造肽配體，其特征在于由His Leu Cys Gly Pro Phe Leu Val Glu Gla所示的氨基酸序列組成，是將鼠源胰島素B鏈HLA A*0201限制性CTL表位mInsB5 14的第6位組氨酸替換為苯丙氨酸而得。
2.權(quán)利要求1所述胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體的獲得方法，其 特征在于包括以下步驟a、利用計算機模擬技術(shù)建立胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB5_14與 HLA-A*0201分子的二元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，再進一步建立上述二元復(fù)合物與T細胞抗原受體 的三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，分析天然表位mInsB5_14中潛在的T細胞抗原受體主要作用位點；b、對步驟a所得天然表位mInsB5_14*潛在的T細胞抗原受體主要作用位點進行單氨基 酸殘基突變，獲得一系列天然表位mInsB5_14的候選改造肽配體，對這些候選改造肽配體進 行計算機分析，從中篩選出與HLA-A2分子親和力高于天然表位、且空間構(gòu)象和天然表位接 近的候選改造肽配體；c、合成步驟b篩選出的候選改造肽配體，通過細胞功能實驗從中鑒定出在HLA-A*0201 背景下能夠顯著下調(diào)天然表位mInsB5_14特異性CTL應(yīng)答水平的改造肽配體，即得權(quán)利要求 1所述胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體。
3.權(quán)利要求1所述胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體在制備I型糖 尿病治療性負調(diào)肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了胰島素B鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體(APL)及其獲得方法和應(yīng)用，該APL的氨基酸序列為HLCGPFLVEA，是將天然表位mInsB5-14的第6位組氨酸替換為苯丙氨酸而得；其獲得方法是先建立TCR-HLA-A*0201-mInsB5-14復(fù)合物模型，確定mInsB5-14中潛在的TCR作用位點并對其進行單氨基酸突變，從中篩選出與HLA-A*0201分子親和力高于天然表位且空間構(gòu)象和天然表位接近的候選APL，再進一步通過細胞功能實驗從中鑒定出能顯著下調(diào)mInsB5-14特異性CTL應(yīng)答水平的APL，即得；本發(fā)明APL可用于制備I型糖尿病治療性負調(diào)肽疫苗。
文檔編號C07K7/06GK101974071SQ20101029230
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者吳玉章, 王書峰, 王莉, 舒馳, 陳曉玲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)