專利名稱：一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人干擾素α 2b的發(fā)酵后處理工藝。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細 胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時還可增強自然殺 傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能 力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋 巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、 調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。干擾素按制作方法不同，可分為利用基因工程生產(chǎn)的重組 干擾素和人天然干擾素兩大類。人天然干擾素分為三種多肽IFN-a、IFN-β及IFN-γ。 IFN-α和IFN-β分別由白細胞和成纖維細胞產(chǎn)生，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，并且結(jié)合相同的受 體。而IFN-Y主要由T淋巴細胞分泌，對酸不穩(wěn)定，結(jié)合的受體與前兩者不同，IFN-Y的免 疫刺激活性在三者中最強。IFN-β和IFN-γ只由單個基因編碼，而IFN-α由至少23個不 同基因，群聚在第9對染色體上，編碼產(chǎn)生多于15種的功能蛋白?；蚬こ谈蓴_素再按基 因表達分子結(jié)構(gòu)和抗原性可分為α、β、Y型，同一型內(nèi)按氨基酸組成差異再分20多個亞 型α 1、α 2、α 3……在同一亞型內(nèi)又因氨基酸的差異而細分，如α 2 有三種α 2a、α 2b、 α 2c。人天然干擾素是通過分別刺激淋巴母細胞和人體白細胞，然后提純制備而得。目前 市場供應(yīng)的只有由類淋巴母細胞產(chǎn)生的干擾素(IFN)…α Ni，是天然的多亞型的混合物。臨 床用的主要是重組制劑，有α 2a、α 2b和α 2c。人干擾素α作為21世紀抗病毒、抗癌癥 最為廣泛的藥物之一，臨床應(yīng)用的需求量越來越高，如何使人干擾素α大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 成為了重要課題。早期人白細胞干擾素α是用生長在組織培養(yǎng)物種的人細胞系表達的或是通 過從血液供體中收集的人白細胞生產(chǎn)的，美國專利US4680261，US5503828, US5391713， US4732683,US4696899,US5789551和歐洲專利ΕΡ0945463詳細地闡述了這些方法。這些方 法生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量低，存在污染風(fēng)險，不適合工業(yè)化放大生產(chǎn)。20世紀70年代后期，隨著基因工程技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展，人干擾素α可以通過基 因重組的方式生產(chǎn)，然而目前重組人干擾素α的生產(chǎn)純化大多用到親和抗體柱或液相反 相柱，純化成本高，生產(chǎn)工藝難于工業(yè)化放大等缺點；如美國專利US5710027、US5661009U、 US4765903、US5196323、和中國專利 CN100390198C、CN1876811A 等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種重組人干擾素α 2b的發(fā)酵后處理工藝。本發(fā)明采 用微濾和超濾替代硫酸銨沉淀和離心，無需大規(guī)模采用離心機，減少了設(shè)備成本，并降低了 能耗，同時也避免大量使用硫酸銨，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染；本工藝采用常規(guī)的疏水 及體積排阻層析柱，無需采用反相層析柱和昂貴的單克隆親和柱，避免有機溶劑的使用和親和層析柱上脫落的單克隆抗體的污染，提高了產(chǎn)品的臨床安全性；本生產(chǎn)工藝穩(wěn)定簡單， 適合大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)過程安全可控，生產(chǎn)效率高，顯著的降低能耗，無環(huán)境污染，有顯著的 經(jīng)濟效益，生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量標準符合2010版中國藥典標準。為了達成上述目的，本發(fā)明的解決方案是一種重組人干擾素α 2b的發(fā)酵后處理工藝，從表達人干擾素α 2b的工程菌中提 取重組人干擾素α 2b，包括如下步驟1)重組人干擾素α 2b酵母發(fā)酵液中菌體的去除，2) 發(fā)酵上清中目的蛋白質(zhì)的濃縮和緩沖液的替換，3)疏水層析初步純化，4)體積排阻層析純 化。所述的步驟1)中，采用微濾技術(shù)，選用中空纖維膜管，替換緩沖液為PH值 6. 3士0. 1的20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，并添加濃度為0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，濃度 為 0. 03% 的 Tween80。所述的微濾采用0. 45um中空纖維膜管。所述的步驟2)中，采用超濾技術(shù)，選用中空纖維膜管，替換緩沖液為pH值 6. 5士0. 1的20mM磷酸緩沖液(PBNa)，并添加濃度為0. 5% Vc和0. 05% Tween80。所述的超濾采用5K中空纖維膜管。所述的步驟3)中疏水層析洗脫緩沖液采用緩沖液A和緩沖液B，利用疏水層析 柱進行純化，疏水填料選用Octyl Sepharose 4FastFlow(GE公司)，緩沖液A為pH值 6. 5 士0. 05的20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0. 8M(NH4) 2S04，濃度為0. 02%二甲基亞 砜(DMSO)，緩沖液B為pH值6.5士0. 05的20mM HEPES和濃度為0. 02%二甲基亞砜。所述的步驟4)中采用緩沖液C，利用體積排阻交換柱進行體積排阻層析，具體選 用 Superdex 75 (GE 公司)，緩沖液 C 為 pH 值 7. 0 士 0. 1 的 20mM PBNa。本發(fā)明的有益效果為(1)微濾和超濾中使用了行之有效的穩(wěn)定保護劑，在微濾 和超濾過程中會伴隨著劇烈的攪拌和剪切，重組人干擾素α 2b容易發(fā)生不同程度的氧化 和聚集，影響后續(xù)的處理，增加了純化的難度，因此本發(fā)明通過一系列的實驗研究發(fā)現(xiàn)，在 微濾替換緩沖液中添加0. 5%VcU0mM EDTA和0. 03% Tween 80，在超濾替換緩沖液中添加 0.5% Vc和0.05% Tween 80，可以有效的阻止目的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化和聚集，并且Tween 80 明顯降低微濾和超濾膜的蛋白吸附量，顯著提高回收率。(2)獨特的疏水純化步驟，通過對疏水純化的摸索實驗，意外的發(fā)現(xiàn)采用pH值 6. 5 士0. 05的20mM HEPES并添加0. 02%二甲基亞砜的緩沖液，可以顯著提高疏水純化的分 離效率，一步疏水純化就可以達到捕獲目的蛋白和去除大部分雜質(zhì)的目的，疏水純化后干 擾素α 2b的純度大于95%以上，消除了發(fā)酵的波動，為后續(xù)的純化奠定了良好的基礎(chǔ)。(3)工藝簡單可控，適合大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)過程安全可控，生產(chǎn)效率高，純化得率高 (最終純化得率40% )，顯著的降低能耗，無環(huán)境污染，有顯著的經(jīng)濟效益。(4)通過本發(fā)明純化方法得到的原液，質(zhì)量標準達到2010版中國藥典的標準， 反相色譜純度達到95%以上，SDS-PAGE純度法達到98%以上，殘余工程菌蛋白含量低于 0. 005%，低于國家標準的10分之1，細菌內(nèi)毒素每毫克低于0. 25EU，僅相當于國家標準的 120 分之 1 (標準為 10EU/300 μ g)。(5)高載量、高流速處理大體積樣品，大大縮短工藝時間，可進行大規(guī)模生產(chǎn)工 藝單批規(guī)?？蛇_到IOOg以上。
本發(fā)明的另一個明顯優(yōu)勢是避免使用反相層析柱和單克隆層析柱。乙腈和甲醇 經(jīng)常作為反相層析柱純化洗脫試劑，以達到蛋白質(zhì)精細純化，獲得高純度的目的蛋白質(zhì)。當 在規(guī)?；a(chǎn)中使用進行蛋白的純化時，乙腈和甲醇等有機溶劑的用量很大，它們都屬于 有毒性的溶劑，大量使用有機溶劑帶來一系列的問題不僅價格昂貴，生產(chǎn)成本過高；樣品 中的殘余溶劑可能帶來安全性隱患；廢水的處理會產(chǎn)生大量的環(huán)保處理費用；如排放到環(huán) 境中，將對環(huán)境帶來污染。無需采用昂貴的單克隆親和柱，顯著地降低了生產(chǎn)成本，并避免 了親和層析柱上脫落的單克隆抗體的污染，提高了產(chǎn)品的臨床安全性；本工藝在不降低任 何收率和純度指標的情況下，避免使用有機溶劑和單克隆層析柱，優(yōu)點突出。


圖1是本發(fā)明疏水層析純化洗脫圖譜；圖2是本發(fā)明疏水層析純化電泳圖譜；圖3是本發(fā)明疏水層析純化HPLC-RPC檢測圖譜；圖4是本發(fā)明體積排阻精純洗脫圖譜；圖5是本發(fā)明重組人干擾素α 2b的SDS-PAGE電泳純度檢測結(jié)果圖譜；圖6是本發(fā)明重組人干擾素α 2b的HPLC-RPC純度檢測結(jié)果圖譜；圖7是本發(fā)明重組人干擾素α 2b表觀分子量的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖譜；圖8是本發(fā)明重組人干擾素α 2b的MS分子量檢測結(jié)果圖譜。
具體實施例方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。1)重組人干擾素α 2b酵母發(fā)酵液菌體的去除取重組人干擾素α 2b的發(fā)酵液，采用連續(xù)流加的方式，連續(xù)流加pH值6. 3的20mM Tris,0. 5% Vc, IOmM EDTA，0. 03% Tween80緩沖液，采用0. 45um中空纖維微濾膜管，微濾 替換20倍。料液流速為lm/s，操作壓力為0. 4MPa，溫度為10_20°C，微濾透過通量為2. 5L/ m2 · h02)目的蛋白質(zhì)的濃縮和緩沖液的替換取微濾后的發(fā)酵上清液，采用對半稀釋的方式添加PH值6. 5的20mM PBNa, 0. 5% Vc, 0. 05% TweenSO緩沖液，采用5K中空纖維超濾膜管，替換32倍。料液流速為lm/s，操作 壓力為0. 6MPa，溫度為10-20°C，微濾透過通量為1. 5L/m2 · h。3)疏水層析純化超濾樣品，添加3M (NH4) 2S04至終濃度為0. 8M，用5 %氨水調(diào)pH值6. 5。Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水凝膠層析柱(Φ 100mm) 0.5M NaOH在位清洗30min，超純水洗 脫3柱床體積，使用緩沖液A :20mM HEPES，0. 8M硫酸銨，0. 02% DMSO(pH 6. 5，)平衡5柱床 體積。發(fā)酵上清(含0.8M(NH4)2S04)按10mg/ml上柱，使用緩沖液A再平衡3柱床體積，換 緩沖液B :20mM HEPES,0. 02% DMSO(pH 6. 5)，0%緩沖液B至100%緩沖液B、50柱床梯度 洗脫，分部收集樣品。取樣SDS-PAGE電泳，余樣4°C放置備用。由洗脫圖譜(圖1)可見，有3個洗脫主峰，由電泳結(jié)果(圖2)可見，第2個洗脫峰樣為重組人干擾素α 2b(純度大于98%)，其它樣品含有較多雜質(zhì)蛋白；反相純度大于 95% (見圖3)。圖2是本實施例重組人干擾素α 2b SDS-PAGE(15%膠濃度，考馬斯亮藍染 色)電泳檢測結(jié)果泳道2是3#樣品，泳道3是2#樣品，泳道4是1#樣品；圖3是2#的 反相檢測圖譜。結(jié)果表明2#為目的樣，SDS-PAGE純度大于98% (見圖2)，反相純度大于 95% (圖 3)。4)體積排阻精度純化疏水純化樣品，用5K超濾器超濾濃縮成50mg/ml的濃度。Superdex 75凝膠層析 柱(Φ50πιπι)0. 5Μ NaOH在位清洗30min，超純水洗脫3柱床體積，20mM PBNa pH7. 0緩沖液C 平衡3柱床體積。疏水純化后超濾樣品按5%柱床體積上樣，20mM PBNa pH7.0洗脫，分部 收集樣品。取樣SDS-PAGE電泳，余樣4°C放置備用。由洗脫圖譜(圖4)可見，只有1個洗脫主峰。Superdex 75純品用0. 2um過濾除 菌，4°C放置備用。本實施例還對重組人干擾素α 2b進行了性質(zhì)分析1)采用SDS-PAGE電泳檢測重組人干擾素α 2b的純度按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄IV C《SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳法》測定樣品表觀分子量。積層膠濃度5%，分離膠濃度15% ；樣品上樣量20μ g，電 壓100V-200V，銀染顯色。電泳結(jié)果見圖5所示。圖5是本實施例重組人干擾素α 2b SDS-PAGE(15%膠濃度，銀染)電泳純度檢測結(jié)果；泳道1上樣量30ug，泳道2上樣15ug，泳 道3上樣量5ug，泳道4上樣量1. 5ug,泳道5上樣量0. 25ug。結(jié)果表明純度大于98%。2)采用HPLC-RPC檢測重組人干擾素α 2b的純度按《歐洲藥典》5.0 版之 IFN-α 2 原液(Interferon Alfa-2Concentrated Solution)的HPLC-RPC C18純度檢測方法進行本樣品的純度檢測。采用美國Waters公司 的HPLC系統(tǒng)，主機型號600，雙波長檢測器型號2487，數(shù)據(jù)處理軟件為Empower 2。檢測結(jié) 果見圖6，圖6是本實施例重組人干擾素α 2b HPLC-RPC檢測結(jié)果。結(jié)果表明樣品純度大 于 95%。3)重組人干擾素α 2b表觀分子量的檢測按《中華人民共和國藥典》2005年版三部附錄IV C《SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 法》測定樣品表觀分子量。積層膠濃度5%，分離膠濃度15%。樣品上樣量1 μ g，電壓 100V-200V，銀染顯色。電泳結(jié)果見圖7。圖7是本實施例重組人干擾素α 2b表觀分子量 SDS-PAGE (15%膠濃度，銀染)電泳圖；泳道1上樣量2ug，泳道2上樣量lug。電泳結(jié)果與 理論值吻合。4)蛋白質(zhì)MS分子量檢測采用德國BRUKER公司Autoflex III T0F/T0F質(zhì)譜儀，MALDI-T0FMS法測定重組人 干擾素α 2b的分子量?；|(zhì)采用芥子酸(Sinapinicacid，SA, C11H12O5, MW 224. 22 ；)，蛋白 分子量標準品采用 BRUKER 公司之 Protein Calibration Standard II (Part No. 207234)， 分析軟件為 flexAnalysis Ver. 3. 0. 54. 0.。檢測結(jié)果重組人干擾素α 2b的MS分子量為19257. 469Dalt0n(見圖8所示)， 圖8是本實施例重組人干擾素α 2b質(zhì)譜結(jié)果；結(jié)果表明與理論值吻合。5)內(nèi)毒素含量和殘余工程菌蛋白含量測定
殘余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于國家標準的10分之1，細菌內(nèi)毒素每毫克 低于0. 25EU，僅相當于國家標準的120分之1。
權(quán)利要求
一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于從表達人干擾素α2b的工程菌中提取重組人干擾素α2b，包括如下步驟1)重組人干擾素α2b酵母發(fā)酵液中菌體的去除，2)發(fā)酵上清中目的蛋白質(zhì)的濃縮和緩沖液的替換，3)疏水層析初步純化，4)體積排阻層析純化。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所述 的步驟1)中，采用微濾技術(shù)，選用中空纖維膜管，替換緩沖液為PH值6.3士0. 1的20mM三羥 甲基氨基甲烷(Tris)，并添加濃度為0. 5%的Vc，IOmM的EDTA，濃度為0. 03%的Tween80。
3.如權(quán)利要求2所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所述 的微濾采用0. 45um中空纖維膜管。
4.如權(quán)利要求1所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所述 的步驟2)中，采用超濾技術(shù)，選用中空纖維膜管，替換緩沖液為pH值6. 5士0. 1的20mM磷 酸緩沖液，并添加濃度為0. 5% Vc和0. 05% Tween80o
5.如權(quán)利要求4所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所述 的超濾采用5K中空纖維膜管。
6.如權(quán)利要求1所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所述 的步驟3)中疏水層析洗脫緩沖液采用緩沖液A和緩沖液B，利用疏水層析柱進行純化，緩沖 液 A 為 pH 值 6. 5 士0. 05 的 20mM HEPES，0. 8M (NH4)2SO4,濃度為 0. 02%二甲基亞砜，緩沖液 B 為PH值6. 5 士0. 05的20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸和濃度為0. 02%二甲基亞砜。
7.如權(quán)利要求1所述的一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，其特征在于所 述的步驟4)中采用緩沖液C，利用體積排阻交換柱進行體積排阻層析，緩沖液C為pH值 7. 0 士 0. 1 的 20mM PBNa。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組人干擾素α2b的發(fā)酵后處理工藝，從表達人干擾素α2b的工程菌中提取重組人干擾素α2b，包括如下步驟1)酵母發(fā)酵液中菌體的去除，2)發(fā)酵上清中目的蛋白質(zhì)的濃縮和緩沖液的替換，3)疏水層析初步純化，4)體積排阻層析純化。本發(fā)明減少了設(shè)備成本、生產(chǎn)成本、降低了能耗、減少環(huán)境污染，提高了產(chǎn)品的臨床安全性；同時本發(fā)明工藝穩(wěn)定簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)過程安全可控，生產(chǎn)效率高，顯著的降低能耗，無環(huán)境污染，有顯著的經(jīng)濟效益，生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量標準符合2010版中國藥典標準。
文檔編號C07K14/56GK101974084SQ201010294158
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者孫黎, 尹鳳紅, 張茜, 汪鐵兵, 肖清江, 蘇詩蟠 申請人:廈門特寶生物工程股份有限公司