專利名稱：從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取物的制備，主要涉及一種從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法。
背景技術(shù)：
石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖，治療胃腸道疾病和治療白內(nèi)障的作用，石斛 的藥用成分主要是石斛堿及多糖類物質(zhì)，對(duì)11種石斛的總生物堿進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)凡性 狀鑒別時(shí)具苦味的生物堿含量較高，其中金釵石斛總生物堿含量達(dá)O. 41 % 0. 64%，遠(yuǎn)較 其他種石斛高，其中主要為石斛堿、石斛次堿、6-羥基石斛等。其主要成分石斛堿則具有止 痛、解熱作用，可降低心率、血壓，減慢呼吸，使血糖中度升高，具有強(qiáng)壯作用并可解巴比妥 中毒。 石斛堿，1932年首次從中藥材金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl)中分離 得到，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C16H25N02，分子量為263，熔點(diǎn)134-136 °C ，易溶于乙醚、氯仿，難 溶于乙醇、水。目前，石斛堿的提取主要是按照文獻(xiàn)(T. 0kamoto， etal.The structure ofdendrobine. Chem. Pharm. Bull. 1964， 12 (4) :506-512 ;Y. I皿bushi， et al. Isolution andCharacterization of Alkaloids of the Chinese Drug "Chi-shi-hu，，. Chem. Pharm. Bull. 1964,12(10) :1175-1180)中的方法進(jìn)行，但該方法得到的石斛堿質(zhì)量不夠穩(wěn)定，含 的雜質(zhì)較多，回收率低，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從金釵石斛中提取純化得到質(zhì)量穩(wěn)定的高純度石斛堿 的方法。通過本發(fā)明方法可得到石斛堿含量不低于80%的穩(wěn)定提取物，并且將提取物進(jìn)一 步經(jīng)HPLC制備，可得到純度^ 95%的石斛堿。與以往的工藝相比，本發(fā)明的方法具有選擇 性高，反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，石斛堿收率和純度高的特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用 價(jià)值，為開發(fā)利用金釵石斛植物資源提供了新的途徑。 本發(fā)明是這樣構(gòu)成的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法由下列步驟實(shí)現(xiàn) (1)提取金釵石斛莖粗粉加入酸性有機(jī)溶劑提??； (2)過柱將步驟(1)所得提取液用離子交換樹脂進(jìn)行吸附和洗脫； (3)萃取將步驟(2)所得洗脫液調(diào)節(jié)pH，先后用氯仿和乙醚萃取，得石斛堿粗提
物； (4) HPLC制備將石斛堿粗提物進(jìn)行HPLC分離制備。
具體方法是由下列步驟實(shí)現(xiàn)的 (1)提取金釵石斛莖粗粉按W/V =1 : 3 15的料液比加入酸性有機(jī)溶齊U，加 熱提取1 5次，每次1 6小時(shí)，過濾，棄濾渣； (2)過柱將步驟(1)所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，通過經(jīng)預(yù)處理的陽(yáng)離 子交換樹脂，洗脫至無生物堿反應(yīng)為止；
(3)萃取將步驟(2)所得洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積氯仿 萃取，萃取液濃縮成浸膏后，用酸水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH，再用乙醚萃取，濃縮干燥后得石斛堿粗提 物； (4)HPLC制備將石斛堿粗提物溶解后進(jìn)行HPLC分離制備。
更加確定的方法是由下列步驟實(shí)現(xiàn) (1)提取金釵石斛莖粗粉按W/V = 1 : 8 12的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，于 微沸狀態(tài)下提取3次，每次2 4小時(shí)，過濾，棄濾渣； (2)過柱將步驟(1)所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離 子交換樹脂，先用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用堿性乙醇洗脫，至無生物堿反應(yīng)為止；
(3)萃取將步驟(2)所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等 體積氯仿萃取3-4次；濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿；將所得金釵石斛生物 總堿用酸水復(fù)溶后，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥可得 石斛堿含量不低于80%的提取物； (4)HPLC制備將石斛堿粗提物用3倍量甲醇溶解，然后進(jìn)行HPLC分離制備可得 石斛堿含量不低于95%的提取物。 在本方法的步驟(1)中金釵石斛莖粗粉與酸性有機(jī)溶劑料液比為W/V = 1 : 10 ; 酸為鹽酸、硫酸，有機(jī)溶劑為乙醇，pH為4 ;提取時(shí)間為2小時(shí)。 步驟(2)中酸水pH為4，酸為鹽酸、硫酸；陽(yáng)離子交換樹脂為731型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子
交換樹脂；堿為氨水，調(diào)堿性乙醇pH = 10，乙醇濃度為80%。 步驟(3)堿為氨水，調(diào)pH至10 ;酸為鹽酸、硫酸，調(diào)pH至4。 步驟(4)制備條件為，柱填料為C180DS柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為223nm，流動(dòng)相為甲醇水 =80 : 20 ;柱溫為35tV流速為lml/min，收集保留時(shí)間2. 4±0. 1分鐘組分。
揮干流動(dòng)相后即得含量^ 95%的石斛堿。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有以下特點(diǎn) (1)由于金釵石斛中生物堿為弱堿，用酸性乙醇浸提，這時(shí)不論生物堿是以鹽的形 式存在或以堿的形式存在，一般都可以被浸出。而且由于稀醇能浸透植物組織內(nèi)部，故提取 效率較高。 (2)提取物采用HPLC分離前，先用陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理，可除掉大部分雜質(zhì)，避 免干擾，使上樣量得到很大提高，并減少對(duì)色譜柱的污染。 (3)與傳統(tǒng)方法相比較，HPLC制備大大簡(jiǎn)化物質(zhì)的分離純化步驟，快速、高效，適 合工業(yè)化生產(chǎn)中定性定量分析。 本發(fā)明所得的穩(wěn)定提取物石斛堿(純度>95%)可以作為提取和其他制劑含量測(cè) 定的對(duì)照品。 申請(qǐng)人:進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，對(duì)提取方法進(jìn)行了研究。經(jīng)過檢驗(yàn)，本發(fā)明方法提取率
高，工業(yè)大生產(chǎn)切實(shí)可行。 實(shí)驗(yàn)例純度檢查 高效液相色譜參數(shù)色譜柱C180DS柱；流動(dòng)相甲醇水=70 : 30 (圖1、圖2)，
甲醇:水=90 : 10(圖3);溫度35。C ;流速:lml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)223nm。 采用高效液相色譜法，以面積歸一化法計(jì)算，本發(fā)明方法可得到石斛堿含量不低于80%的穩(wěn)定提取物，并且將提取物進(jìn)一步經(jīng)HPLC制備，可得到純度^ 95%的石斛堿。


圖1為分離所得石斛堿的純度檢查圖譜；
圖2為石斛堿粗提物高效液相純度檢查圖譜；
圖3為HPLC分離所得石斛堿純度檢查圖譜；
圖4為制備石斛堿的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例l: 取金釵石斛莖，用藥材干重10倍的pH = 3的酸性乙醇在微沸狀態(tài)下提取2小時(shí)， 浸提3次，提取液濃縮成浸膏，加氨水調(diào)節(jié)pH = 10，用等體積氯仿萃取3-4次，濃縮萃取液， 冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿，含量為68. 4% 。將所得金釵石斛生物總堿用pH = 4的酸 水復(fù)溶后，加氨水調(diào)節(jié)pH二 10，用等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥，即得 石斛堿，石斛堿含量66. 1 % 。
本發(fā)明的實(shí)施例2: 取金釵石斛莖，用藥材干重10倍的pH = 3的酸性乙醇在微沸狀態(tài)下提取2小時(shí)， 浸提3次，提取液濃縮成浸膏，用pH = 4的酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離子交換樹脂， 先用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用70%堿性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，加氨水調(diào)節(jié) pH= 10，用等體積氯仿萃取3 4次，濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿，含量為 81. 0%。將所得金釵石斛生物總堿用pH = 4的酸水復(fù)溶后，加氨水調(diào)節(jié)pH = IO，用等體積 乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥，即得石斛堿，石斛堿含量82.7%。
本發(fā)明的實(shí)施例3: 取金釵石斛莖，用藥材干重10倍的pH = 3的酸性乙醇在微沸狀態(tài)下提取2小時(shí)， 浸提3次，提取液濃縮成浸膏，用pH = 4的酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離子交換樹脂，先 用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用70%堿性乙醇洗脫，洗脫液濃縮至不含乙醇為止，加氨水調(diào) 節(jié)pH二 10，用等體積氯仿萃取3 4次，濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿，含 量為85. 3%。將所得金釵石斛生物總堿用pH = 4的酸水復(fù)溶后，加氨水調(diào)節(jié)pH = IO，用 等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥，即得石斛堿粗提物。再用3倍量甲醇溶 解，然后進(jìn)行HPLC分離純化，收集保留時(shí)間2. 7±0. 1分鐘組分，揮干流動(dòng)相后，即得含量為 95. 5%的石斛堿。
本發(fā)明的實(shí)施例4: 取金釵石斛莖粗粉按W/V = 1 : 6的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，加熱提取1次，每 次1小時(shí)，過濾，棄濾渣；所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，通過經(jīng)預(yù)處理的陽(yáng)離子交換 樹脂，洗脫至無生物堿反應(yīng)為止；所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)PH，用 等體積氯仿或乙醚萃取，得石斛堿粗提物；將石斛堿粗提物溶解后進(jìn)行HPLC分離制備。
本發(fā)明的實(shí)施例5: 取金釵石斛莖粗粉按W/V = 1 : 14的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，加熱提取5次， 每次6小時(shí)，過濾，棄濾渣；所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，通過經(jīng)預(yù)處理的陽(yáng)離子交
5換樹脂，洗脫至無生物堿反應(yīng)為止；所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)PH，用等體積氯仿或乙醚萃取，得石斛堿粗提物；將石斛堿粗提物溶解后進(jìn)行HPLC分離制備。
本發(fā)明的實(shí)施例6: 取金釵石斛莖粗粉按W/V = 1 : 8的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，于微沸狀態(tài)下提取3次，每次2小時(shí)，過濾，棄濾渣；所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離子交換樹脂，先用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用堿性乙醇洗脫，至無生物堿反應(yīng)為止；所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積氯仿萃取3次；濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿；將所得金釵石斛生物總堿用酸水復(fù)溶后，加堿調(diào)節(jié)PH，用等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥可得石斛堿含量不低于80%的提取物；HPLC制備將石斛堿粗提物用3倍量甲醇溶解，然后進(jìn)行HPLC分離制備可得石斛堿含量不低于95%的提取物。
本發(fā)明的實(shí)施例7: 取金釵石斛莖粗粉按W/V二 1 : 12的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，于微沸狀態(tài)下提取3次，每次4小時(shí)，過濾，棄濾渣；所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離子交換樹脂，先用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用堿性乙醇洗脫，至無生物堿反應(yīng)為止；所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積氯仿萃取4次；濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿；將所得金釵石斛生物總堿用酸水復(fù)溶后，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥可得石斛堿含量不低于80%的提取物；HPLC制備將石斛堿粗提物用3倍量甲醇溶解，然后進(jìn)行HPLC分離制備可得石斛堿含量不低于95%的提取物。
權(quán)利要求
一種從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于由下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)提取金釵石斛莖粗粉加入酸性有機(jī)溶劑提??；(2)過柱將步驟(1)所得提取液用離子交換樹脂進(jìn)行吸附和洗脫；(3)萃取將步驟(2)所得洗脫液調(diào)節(jié)pH，先后用氯仿和乙醚萃取，得石斛堿粗提物；(4)HPLC制備將石斛堿粗提物進(jìn)行HPLC分離制備。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于由下列 步驟實(shí)現(xiàn)(1) 提取金釵石斛莖粗粉按W/V =1 : 3 15的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，加熱提 取1 5次，每次1 6小時(shí)，過濾，棄濾渣；(2) 過柱將步驟(1)所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，通過經(jīng)預(yù)處理的陽(yáng)離子交 換樹脂，洗脫至無生物堿反應(yīng)為止；(3) 萃取將步驟(2)所得洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積氯仿萃取， 萃取液濃縮成浸膏后，用酸水復(fù)溶，調(diào)節(jié)PH，再用乙醚萃取，濃縮干燥后得石斛堿粗提物；(4) HPLC制備將石斛堿粗提物溶解后進(jìn)行HPLC分離制備。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于由下列 步驟實(shí)現(xiàn)(1) 提取金釵石斛莖粗粉按W/V = 1 : 8 12的料液比加入酸性有機(jī)溶劑，于微沸 狀態(tài)下提取3次，每次2 4小時(shí)，過濾，棄濾渣；(2) 過柱將步驟(1)所得提取液濃縮成浸膏，用酸水溶解，過經(jīng)過預(yù)處理的陽(yáng)離子交 換樹脂，先用蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)，再用堿性乙醇洗脫，至無生物堿反應(yīng)為止；(3) 萃取將步驟(2)所得堿性乙醇洗脫液濃縮至無醇味為止，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積氯仿萃取3 4次；濃縮萃取液，冷凍干燥可得金釵石斛生物總堿；將所得金釵石斛生物總堿用酸水復(fù)溶后，加堿調(diào)節(jié)pH，用等體積乙醚萃取至乙醚無色為止，濃縮、冷凍干燥可得石斛堿含量不低于80%的提取物；(4) HPLC制備將石斛堿粗提物用3倍量甲醇溶解，然后進(jìn)行HPLC分離制備可得石斛 堿含量不低于95%的提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于步驟(1)中金釵石斛莖粗粉與酸性有機(jī)溶劑料液比為w/v二 i : 10;酸為鹽酸、硫酸，有機(jī)溶劑為乙醇，pH為4;提取時(shí)間為2小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于步驟(2)中酸水PH為4，酸為鹽酸、硫酸；陽(yáng)離子交換樹脂為731型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂；堿為氨水，調(diào)堿性乙醇pH = 10，乙醇濃度為80%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于步驟(3) 堿為氨水，調(diào)pH至10 ;酸為鹽酸、硫酸，調(diào)pH至4。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，其特征在于步驟(4) 制備條件為，柱填料為C180DS柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為223nm，流動(dòng)相為甲醇水=80 : 20 ;柱溫為 35tV流速為lml/min，收集保留時(shí)間2. 4±0. 1分鐘組分。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一種從金釵石斛中提取純化石斛堿的方法，該方法先用酸性乙醇提取，然后將提取物通過陽(yáng)離子交換樹脂富集純化，再用有機(jī)溶劑萃取，最后采用HPLC分離制備；通過本發(fā)明方法可得到石斛堿含量不低于90％的穩(wěn)定提取物，并且將提取物進(jìn)一步經(jīng)HPLC制備，可得到純度≥95％的石斛堿；與以往的工藝相比，本發(fā)明的方法具有選擇性高，反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，石斛堿收率和純度高的特點(diǎn)；采用HPLC進(jìn)行分離制備，可減少石斛堿的損失，并可獲得結(jié)構(gòu)類似的相關(guān)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，為開發(fā)利用金釵石斛植物資源提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C07D491/18GK101735231SQ20101030049
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者劉嬋, 吳芹, 石京山 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院