專利名稱：一種桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法及其抗桔霉素單 克隆抗體的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桔霉素或桔青霉素是由青霉、曲霉、紅曲霉等絲狀真菌產(chǎn)生的毒素，具有嚴(yán)重肝腎 毒性以及致畸、致癌和致突變作用。近年來的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，許多食品和農(nóng)產(chǎn)品中都可檢測 到桔霉素，主要原因是與玉米、大米、面包、奶酪、蘋果、梨等農(nóng)產(chǎn)品或食品的霉變有關(guān)。因 此，桔霉素引起的食品安全問題越來越受到人們的關(guān)注。紅曲霉菌在我國的應(yīng)用源遠(yuǎn)流長，用紅曲菌發(fā)酵可生產(chǎn)多種中國傳統(tǒng)食品，如紅 曲酒、紅腐乳、紅曲米等。桔霉素是真菌的次級代謝產(chǎn)物，常伴隨在紅曲色素中產(chǎn)生，在大部 分紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中，桔霉素含量高達(dá)歐盟標(biāo)準(zhǔn)的幾十到幾百倍。出于食品安全的考慮，桔霉 素已被歐洲各國列為必檢毒素之一。酶聯(lián)免疫檢測法是目前最為靈敏、方便的方法。以單克隆抗體為基礎(chǔ)的酶免疫檢 測方法是桔霉素檢測發(fā)展的方向。桔霉素是小分子化合物，屬于半抗原，不能有效地刺激機 體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。桔霉素必須和大分子載體偶聯(lián)反應(yīng)后制成人工偶聯(lián)抗原才能激發(fā)有 效的免疫反應(yīng)。桔霉素分子量較小(250. 3Da)，結(jié)構(gòu)比較簡單，含有三個活性基團(tuán)，分別是(^ 位置的活潑氫、C7位置的羧基和C8位置的羥基。在偶聯(lián)反應(yīng)過程中如何保證抗原決定簇基 團(tuán)未被破壞，是關(guān)鍵性技術(shù)，制備免疫原性強、能刺激機體產(chǎn)生高親和力和高效價抗桔霉素 特異性抗體的人工抗原的難度較大。目前報導(dǎo)的用于桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原制備的方法有活性酯法、甲醛加成法和羰 基二咪唑法等?；钚怎シɡ昧私勖顾谻7位置的羧基基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，許楊等在專利《桔 霉素免疫層析檢測試紙及制備方法與應(yīng)用(CN1603823A)》中采用該法制備了桔霉素-蛋白 的人工抗原作為檢測抗原或免疫抗原，獲得的抗體在免疫層析檢測試紙中進(jìn)行應(yīng)用，但免 疫層析檢測試紙只能用定性檢測，定量檢測所用的試劑盒仍需從國外進(jìn)口，檢測費用極其 昂貴。甲醛加成法則利用了桔霉素C1位置的活潑氫進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，但該方法反應(yīng)的pH接 近蛋白的等電點，常引起蛋白的大量沉淀，降低了溶液中偶聯(lián)產(chǎn)物的得率。羰基二咪唑法則 利用了桔霉素C8位置的羥基進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，劉仁榮等在文獻(xiàn)(劉仁榮，余宙，何慶華等.抗 桔青霉素單克隆抗體的研制與鑒定.衛(wèi)生研究，2007，36 (2) 190-193)中報導(dǎo)采用該法制 備了桔霉素蛋白偶聯(lián)物并免疫小鼠，但未能獲得針對桔霉素的特異性抗體?？梢姡谂悸?lián)反 應(yīng)過程中如何保證抗原決定簇基團(tuán)未被破壞，是關(guān)鍵性技術(shù)。目前國內(nèi)尚無商品化的桔霉素ELISA檢測試劑盒，僅有能用于定性檢測的桔霉素 檢測試紙(許楊CN1603823A)，其主要原因是無法制備高親和力和高特異性的抗桔霉素抗 體，因此合成較強免疫原性的抗原，制備高親和力和高特異性的抗桔霉素抗體具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種反應(yīng)條件溫和、操作簡單的桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的 合成方法以及免疫原性強、能刺激機體產(chǎn)生高親和力和高效價抗桔霉素的高特異性抗體的 制備方法，可用于進(jìn)一步制備能對桔霉素檢測進(jìn)行定量分析的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒或試紙 卡。本發(fā)明采用雙交聯(lián)試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)為偶聯(lián)劑。桔霉素先與雙交聯(lián)試劑 進(jìn)行反應(yīng)，然后與大分子載體進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)后用甘氨酸進(jìn)行封閉，最后經(jīng)分離純化得到桔 霉素載體偶聯(lián)抗原。應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，獲得穩(wěn)定分泌抗桔霉素單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過制備腹水和純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。具體的制備方法包括以下步驟 桔霉素的活化將0.5 IOmg桔霉素(購自美國sigma公司)溶解于0. 5 IOml 的0. 6mol/l氫氧化鈉溶液中，加入0. 5 IOml的2mg/ml硼氫化鈉溶液，搖勻后，再加入 0. 5 10 μ 1的雙交聯(lián)試劑，室溫下反應(yīng)4 10小時；桔霉素載體偶聯(lián)反應(yīng)加入30 600mg碳酸鈉，調(diào)節(jié)pH9. 0 11. 0，然后按桔霉素 與載體初始摩爾比為10/1 1000/1加入載體，混勻完全后，置于37°C振搖反應(yīng)，反應(yīng)24 48小時；甘氨酸封閉偶聯(lián)反應(yīng)后，加入100 2000mg甘氨酸進(jìn)行封閉，置于37°C振搖反 應(yīng)，反應(yīng)24 48小時；分離純化將反應(yīng)液取出，采用G-25凝膠柱洗脫或透析，收集洗脫液或透析袋內(nèi) 溶液，進(jìn)行紫外全波長掃描，檢測278nm和319nm波長的吸收值，計算偶聯(lián)比，并將偶聯(lián)物冷 凍干燥后，-20°C保存；動物免疫用制備的免疫抗原，免疫小鼠。首次免疫將免疫抗原與福氏完全佐劑 (按1 1體積比例)混合，進(jìn)行腹腔注射。此后，每隔2周加強免疫一次，將免疫抗原與福 氏不完全佐劑(按1 1體積比例)混合，免疫方法同首免，共免疫4次；細(xì)胞融合采用聚乙二醇(PEG)化學(xué)融合法取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì) 胞進(jìn)行融合；雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化采用有限稀釋法對陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培 養(yǎng)；抗桔霉素單克隆抗體的生產(chǎn)及純化采用動物體內(nèi)生產(chǎn)法接種雜交瘤細(xì)胞，制備 腹水。腹水采用正辛酸-硫酸銨鹽析法或PEG法進(jìn)行純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。純 化后的單克隆抗體經(jīng)檢測效價后分裝，置于-20°C保存。其中雙交聯(lián)試劑為(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，η = 2 12，(C2H3O)為環(huán)氧基團(tuán)，雙交 聯(lián)試劑優(yōu)選1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚。所用的蛋白載體為天然蛋白質(zhì)或含氨基的蛋白化 合物或糖化合物或高分子化合物，其分子量為20 1200Kda，包括牛血清白蛋白(BSA)或卵 清蛋白(OVA)或匙孔貝血藍(lán)蛋白(KLH)或其他帶有氨基的蛋白化合物或糖化合物或高分子 化合物中的一種。本方法的有益效果(1)本發(fā)明所提供的雙交聯(lián)化學(xué)合成法是一種新型的桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原制備方法，其優(yōu)點是可在桔霉素與載體蛋白之間形成一定長度的連接空間臂，減少桔霉素與蛋 白結(jié)合過程的空間位阻效應(yīng)，使交聯(lián)物結(jié)構(gòu)緊湊，同時保持一定的伸展和旋轉(zhuǎn)空間，有助于 改善所得抗體的特異性。而且雙環(huán)氧試劑分子中有多個氧原子，結(jié)合產(chǎn)物中不會引入疏水 基團(tuán)，不會降低產(chǎn)物的溶解度。該方法還具有制備條件溫和、操作簡便、過程可控等特點。(2)本發(fā)明所制備的桔霉素人工偶聯(lián)抗原具有較強的免疫原性，采用雜交瘤細(xì)胞 技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌高產(chǎn)抗桔霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并獲得大量特異性高、 親和力強的抗桔霉素單克隆抗體。本發(fā)明制備的抗桔霉素單克隆抗體特異性高、親和力強， 可用于進(jìn)一步制備能對桔霉素檢測進(jìn)行定量分析的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒或試紙卡。



附圖為桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的 制備方法流程示意圖。
具體實施例方式實施例1 桔霉素-牛血清白蛋白(CIT-BSA)免疫抗原的制備0. 5毫克桔霉素溶于0. 5毫升氫氧化鈉(0. 6摩爾/升)中，加入0. 5毫升硼氫化 鈉溶液(2毫克/毫升)，再加入0. 5微升1，4- 丁二醇二縮水甘油醚進(jìn)行活化，室溫下振搖 反應(yīng)4小時；加入31. 8毫克碳酸鈉，調(diào)節(jié)pH至9. 0，加入5毫克牛血清白蛋白，37V偶聯(lián)反 應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束，加入100毫克的甘氨酸進(jìn)行封閉，置于37°C振搖反應(yīng)48小時。將反 應(yīng)產(chǎn)物溶液過G-25層析柱進(jìn)行純化，用磷酸鹽緩沖液(0. 01摩爾/升，pH 7. 4)洗脫，收集 的第一個洗脫峰即為目標(biāo)產(chǎn)物CIT-BSA。偶聯(lián)產(chǎn)物CIT-BSA采用紫外全波長掃描儀進(jìn)行分 析，偶聯(lián)抗原CIT-BSA的紫外圖譜同時出現(xiàn)兩個特征吸收峰(278nm和326歷)，其中278nm 處的吸收峰與BSA的特征吸收峰相一致，在319 326nm存在明顯肩部，與CIT吸收峰319nm 對比，存在一定的位移，計算得CIT/BSA的偶聯(lián)比為8. 16。實驗結(jié)果表明，雙交聯(lián)法成功合 成了 CIT-BSA偶聯(lián)抗原。實施例2 桔霉素卵清蛋白(CIT-OVA)檢測抗原的制備10毫克桔霉素溶于10毫升氫氧化鈉(0. 6摩爾/升)中，加入10毫升硼氫化鈉(2 毫克/毫升)，再加入10微升1，4- 丁二醇二縮水甘油醚進(jìn)行活化，室溫下振搖反應(yīng)10小 時；加碳酸鈉調(diào)節(jié)PH至9. 0，加入43毫克卵清蛋白，37V偶聯(lián)反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束，加入 200毫克的甘氨酸進(jìn)行封閉，置于37°C振搖反應(yīng)48小時。將反應(yīng)產(chǎn)物溶液采用0. 01mol/L PBS (pH 7.4)緩沖液中4°C透析2天，中間更換透析液3次。收集的透析袋中的反應(yīng)液即為 目標(biāo)產(chǎn)物CIT-0VA。偶聯(lián)產(chǎn)物CIT-OVA采用紫外全波長掃描儀進(jìn)行分析，偶聯(lián)產(chǎn)物CIT-OVA 在279nm有明顯的特征吸收峰，對應(yīng)于0VA(279nm)的吸收峰，而319 328nm之間的吸收 峰是偶聯(lián)產(chǎn)物中CIT的特征吸收峰，計算得CIT/0VA的偶聯(lián)比為5. 80。實驗結(jié)果表明，雙交 聯(lián)法成功合成了 CIT-OVA偶聯(lián)抗原。實施例3 桔霉素-匙孔貝血藍(lán)蛋白(CIT-KLH)檢測抗原的制備
5毫克桔霉素溶于5毫升氫氧化鈉(0. 6摩爾/升)中，加入5毫升硼氫化鈉溶液 (2毫克/毫升)，再加入5微升1，4- 丁二醇二縮水甘油醚進(jìn)行活化，室溫下振搖反應(yīng)8小 時；加碳酸鈉調(diào)節(jié)PH至10. 0，加入30毫克匙孔貝血藍(lán)蛋白，37V偶聯(lián)反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié) 束，加入1000毫克的甘氨酸進(jìn)行封閉，置于37°C振搖反應(yīng)48小時。將反應(yīng)產(chǎn)物溶液過G-25 層析柱進(jìn)行純化，用磷酸鹽緩沖液(0. 01摩爾/升，pH 7. 4)洗脫，收集的第一個洗脫峰即為 目標(biāo)產(chǎn)物CIT-KLH。偶聯(lián)產(chǎn)物CIT-KLH采用紫外全波長掃描儀進(jìn)行分析，偶聯(lián)抗原CIT-BSA 的紫外圖譜同時出現(xiàn)兩個特征吸收峰(278nm和326nm)，其中278nm處的吸收峰與KLH的特 征吸收峰相一致，在319 326nm存在明顯肩部，與CIT吸收峰319nm對比，存在一定的位 移，計算得CIT/KLH的偶聯(lián)比為52. 3。實驗結(jié)果表明，雙交聯(lián)法成功合成了 CIT-KLH偶聯(lián)抗 原。實施例4 利用PEG法制備抗桔霉素單克隆抗體 (1)、小鼠免疫選6只8 10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射CIT-BSA偶聯(lián)抗原0. 5 毫升/只 次，首次免疫將免疫抗原與福氏完全佐劑(按體積1 1比例)混合，進(jìn)行腹腔 注射。此后，每隔2周加強免疫一次，將免疫抗原與福氏不完全佐劑(按體積1 1比例) 混合，免疫方法同首免，共免疫4次。(2)、多克隆抗體的測定斷尾取血，將血樣置4°C過夜，3000rpm離心lOmin，收集 上清，此即抗血清。采用CIT-OVA作為檢測抗原，對抗血清中抗CIT的多抗的效價進(jìn)行檢測。 采用間接非競爭ELISA檢測多抗的效價，采用間接競爭ELISA檢測抗血清中抗體的特異性。 本發(fā)明制備的多克隆抗體的效價達(dá)到1 1.1X105，競爭ELISA法檢測結(jié)果表明，本發(fā)明制 備的CIT-BSA抗原免疫小鼠獲得的抗桔霉素多克隆抗體的特異性高，IC5tl達(dá)到lOOng/mL。(3)、細(xì)胞融合取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按5 1細(xì)胞數(shù)量比例與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0進(jìn)行融合，以50% (體積)PEG6000作融合劑。細(xì)胞重懸浮于50毫升HAT培養(yǎng)液中， 接種于5塊含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0. 1毫升，置37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。用間接非競爭ELISA對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體進(jìn)行檢測。檢測抗原采用雙交聯(lián)法制 備CIT-OVA抗原，陽性對照為陽性血清，陰性對照為SP2/0細(xì)胞的上清液，陽性孔的判定標(biāo) 準(zhǔn)為(測定孔值-空白值)/(陰性孔值-空白值)>2.1。(4)、雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化采用有限稀釋法對陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆 化培養(yǎng)。制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用HT培養(yǎng)液稀釋至每mL大概含50、10和5個細(xì) 胞。分別將三種密度的雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔0.1毫升。置 37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)8天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體。對陽性單克 隆再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，經(jīng)過4次克隆化，檢測到100%的克隆分泌特異性抗體。將陽性克隆 擴(kuò)大培養(yǎng)，保種后置于-80°C保存。本發(fā)明篩選得到一株穩(wěn)定分泌抗桔霉素單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞H2-F8。(5)、抗桔霉素單克隆抗體的生產(chǎn)及純化采用動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法。每只 BALB/C小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0. 5毫升，10天后可供腹腔注射雜交瘤細(xì)胞。收集雜交 瘤細(xì)胞，離心，去上清液，加入不完全1640培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2 X IO6個/毫升，每只小 鼠腹腔注射0. 5毫升。10天后觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，等到腹部明顯膨大，即可抽取腹水。 腹水采用4% PEG6000(體積濃度)進(jìn)行純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。測定其抗體效價后分裝并置-20°C下凍存。(6)、抗桔霉素單克隆抗體的鑒定得到的抗桔霉素單克隆抗體采用間接非競爭ELISA分析，效價為1 2. 70X 105。該單抗重鏈約65KDa，輕鏈為25KDa，親和力為 4. 17X IO8LAiol。該單抗具有很強的特異性，與其他毒素(AFBpOTAdOlZEN)的交叉反應(yīng) 率均小于等于0. 015%。采用間接競爭ELISA檢測抗桔霉素單克隆抗體的特異性，IC50達(dá)到 0.03ng/mLo實施例5 利用正辛酸-硫酸銨鹽析法制備抗桔霉素單克隆抗體按照實施例5所述的步驟制備腹水，用正辛酸_硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化，取2ml腹 水，用0. 06mol/L醋酸鹽調(diào)節(jié)ρΗ4· 5，加入5ml 5%辛酸，離心(10000r/min，30min)，收集上 清夜，棄去沉淀。上清液用5mol/LNaOH調(diào)至PH7. 4，在加入35%飽和硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，離 心(5000r/min、15min)，棄去上清液，收集沉淀，重復(fù)兩次。沉淀物用2ml PBS緩沖液溶解， 4°C下PBS緩沖液中透析2天，中間更換透析液3次，收集的透析袋中的抗體即為抗桔霉素 的單克隆抗體，測定其抗體效價后分裝并置_20°C下凍存。抗桔霉素單克隆抗體的鑒定得 到的抗桔霉素單克隆抗體采用間接非競爭ELISA分析，效價為1 1.90X 105。
權(quán)利要求
一種桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成方法，其特征在于，桔霉素先與雙交聯(lián)試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)反應(yīng)，然后與大分子載體進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)后用甘氨酸封閉，最后經(jīng)分離純化得到桔霉素-載體偶聯(lián)抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法，其特征在于， 包括以下步驟(1)桔霉素的活化將0.5 IOmg桔霉素溶解于0. 5 IOml的0. 6mol/l氫氧化鈉溶 液中，加入0. 5 IOml的2mg/ml硼氫化鈉溶液，搖勻后，再加入0. 5 10 μ 1的雙交聯(lián)試 齊U，室溫下反應(yīng)4 10小時；(2)桔霉素-載體偶聯(lián)反應(yīng)加入30 600mg碳酸鈉，調(diào)節(jié)pH9.0 11. 0，然后按桔 霉素與載體初始摩爾比為10/1 1000/1加入載體，混勻完全后，置于37°C振搖反應(yīng)，反應(yīng) 24 48小時；(3)甘氨酸封閉偶聯(lián)反應(yīng)后，加入100 2000mg甘氨酸進(jìn)行封閉，置于37°C振搖反 應(yīng)，反應(yīng)24 48小時；(4)分離純化將反應(yīng)液取出，采用G-25凝膠柱洗脫或透析，收集洗脫液或透析袋內(nèi)溶 液，進(jìn)行紫外全波長掃描，檢測278nm和319nm波長的吸收值，計算偶聯(lián)比，并將偶聯(lián)物冷凍 干燥后-20°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法，其特征 在于，所述的雙交聯(lián)試劑(C2H30)-(CH2)n-(C2H30)，n = 2 12，(C2H30)為環(huán)氧基團(tuán)，雙交 聯(lián)試劑優(yōu)選1，4_ 丁二醇二縮水甘油醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法，其特征 在于，所用大分子載體為天然蛋白質(zhì)或含氨基的蛋白化合物、糖化合物、高分子化合物，其 分子量為20 1200Kda。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法，其特征 在于，所用大分子載體為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或匙孔貝血藍(lán)蛋白(KLH)。
6.一種由權(quán)利1所述桔霉素_蛋白偶聯(lián)抗原制備的抗桔霉素單克隆抗體的制備方法， 其特征在于，應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，獲得穩(wěn)定分泌的抗桔霉素單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過制備腹水和純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用雜 交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，采用的細(xì)胞株為小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用小 鼠動物體內(nèi)生產(chǎn)法制備腹水，采用正辛酸_硫酸銨鹽析法或PEG法對腹水進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原的雙交聯(lián)化學(xué)合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法用桔霉素先與雙交聯(lián)試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)進(jìn)行反應(yīng)，然后與載體進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)后用甘氨酸進(jìn)行封閉，最后經(jīng)分離純化得到桔霉素載體偶聯(lián)抗原。應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，獲得穩(wěn)定分泌的抗桔霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過制備腹水和純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。本發(fā)明制備條件溫和、操作簡且過程可控，所獲得的抗桔霉素單克隆抗體特異性高、親和力強，可用于進(jìn)一步制備桔霉素檢測的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒或試紙卡。
文檔編號C07K1/14GK101845094SQ20101030135
公開日2010年9月29日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者李泳寧, 汪媛媛, 郭養(yǎng)浩 申請人:福州大學(xué)