專利名稱：一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法。
背景技術：
雷帕霉素(Rapamycin, RPM, RAPA)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是31元環(huán)組成的三烯大環(huán)內酯化合物，含有特殊的α、二酮乙哌啶酸胺分子掩蓋的半羧酮，其分子式為C51H79O13，分子量為991KD。它是在1975年由加拿大Ayerst研究所從吸水鏈霉菌 Strepomyces hygroscopicus 中分離出來的。Vezinia等于1975年發(fā)現(xiàn)它具有抗真菌作用，以后Tanaka等又發(fā)現(xiàn)它是一種極有前途的免疫抑制劑并具有抗腫瘤作用。Tanaka等研究表明，雷帕霉素具有很強的抗移植排斥反應，可與環(huán)孢素協(xié)同延長移植物存活時間，能逆轉正在進行的移植排斥反應，還有預防和治療實驗性自身溶血性貧血的作用。因此雷帕霉素的市場前景非常廣闊。然而如中國發(fā)明專利申請公布說明書CNlO 1486976A所述的西羅莫司為胞內產物，一般西羅莫司產生菌效價只有200 μ g/ml左右，發(fā)酵副產物較多，導致后序提取時的層析分離比較困難，工作較為復雜，發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液經過濾得菌體后經甲醇萃取濃縮后，再通過一系列純化工藝如色譜層析、萃取、結晶等獲得西羅莫司純品，產品收率低于20%。所以該公布說明書公開了一種吸水鏈霉菌及其應用的技術方案，提供了一種高單位的西羅莫司產生菌，效價為600 μ g/ml以上，但是產品收率只達到了 30 35%。楊國新等在《海峽藥學》(2007年，第19卷第17期，2546頁)一文公開了高純度西羅莫司的制備的技術方案，該方法為a)發(fā)酵液經離心后得到菌絲體，菌絲體用兩倍量體積的95%酒精分別浸泡兩次，離心棄菌絲渣，合并酒精浸泡液，減壓濃縮去除酒精，殘留液用等體積的乙酸乙酯分別萃取兩次，合并乙酯層并用飽和氯化鈉溶液洗滌1次，經無水硫酸鈉干燥Ih后，過濾，減壓濃縮除去乙酯得上柱物，上柱物溶于適當體積的洗脫劑(乙酯-石油醚洗脫系統(tǒng))，200 300目硅膠柱層析，分段收集，HPLC檢測，合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經乙醚結晶，洗晶，干燥得西羅莫司結晶；b)經上述制備的西羅莫司結晶溶于少量的洗脫劑，硅膠O00 300目)柱層析分離，分部收集，分離過程用高效液相跟蹤檢測，合并含西羅莫司的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液經乙醚結晶，洗晶，重結晶得高純度西羅莫司樣品，純度達到99. 8%以上，單雜小于0.05%。然而該方法的技術方案主要是針對發(fā)酵-16L的小試工藝，經過兩步硅膠柱層析之后得到的雷帕霉素結晶品純度達到質量標準，但是單個雜質含量沒有達到特殊用途的質量要求，所以文獻中提到經過兩步硅膠柱層析之后需要進行兩個平行試驗，且在硅膠層析中采用特定的含5%水的丙酮-石油醚混合溶劑系統(tǒng)進行硅膠柱層析時，得到的高純度西羅莫司樣品中RRT = 1. 19雜質的含量穩(wěn)定在0.05%以下(HPLC)，樣品純度可提高0.2%，高達99.8%，文獻資料中RRT = 0. 79 雜質的含量雖然有所下降，但是該雜質仍然高于0.1%。美國專利公布說明書US20100029933A1 公開了 Pure form of rapamyc in and a process for recovery and purification thereof的技術方案，該方法使從發(fā)酵液中純化得到的雷帕霉素純品純度達到98.8%，總的雜質含量小于1.2%，單雜低于0. 15%。提純方案包括a)用疏水性溶劑萃取發(fā)酵液中的雷帕霉素并濃縮；b)加入親水性的溶劑分離雜質； c)將步驟b得到的產物中吸附到惰性載體上，用堿和酸連續(xù)洗滌，然后洗脫；d)收集步驟c 得到的洗脫液或直接用步驟b中含有雷帕霉素的溶液，上樣硅膠柱，收集洗脫液；e)將步驟 d得到的產物結晶；f)溶解步驟e的結晶品，進行疏水作用或反相色譜；并g)重結晶得到高純度的雷帕霉素。但是利用該方法純化雷帕霉素的產率不高，在一個具體的實施例中可以得知Ilkg的雷帕霉素發(fā)酵液最后的純品只有6g，稱取3g純品進一步純化結晶得到2. 5g。從以上幾個專利文獻資料的提取純化工藝中，我們可以得知雷帕霉素的純度提高到了 99. 8%以上，或者是單雜以及總雜的含量也降低到了 0. 15%和1. 2%以下，但是其提取純化過程冗長繁雜，收率很低。

發(fā)明內容
為了提高雷帕霉素純度，降低雷帕霉素中的雜質含量，同時提高雷帕霉素的收率，本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法。本發(fā)明中所用的含有雷帕霉素的發(fā)酵液，是通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物菌株吸水鏈霉菌(Mr印omyces hygroscopicus ACCC No. 40417)得到的。本發(fā)明的技術方案包含以下步驟a.用丙酮或乙醇抽提發(fā)酵液過濾后得到的菌絲體，得到抽提液后，真空濃縮得濃縮抽提液；b.用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液過濾后得到的上清液，控制發(fā)酵上清液的溫度為 15°C 35°C和pH為5. 0 7. 0，分離乙酸乙酯相得萃取液，真空濃縮得濃縮萃取液；c.將a中的濃縮抽提液和b中的濃縮萃取液合并得濃縮液，并加入到裝有大孔樹脂的床層進行吸附，用丙酮和水的混合溶液作為洗滌劑洗滌大孔樹脂，控制洗滌劑的溫度為15 35°C和pH為5. 0 8. 0，用丙酮和水的混合溶液作為洗脫劑洗脫大孔樹脂，控制洗脫劑的溫度為15 35°C和pH為5. 0 8. 0，收集洗脫液并真空濃縮，得濃縮洗脫液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的濃縮洗脫液，經無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水后真空濃縮得濃縮液，上樣硅膠柱進行層析分離，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗滌劑洗滌硅膠柱， 正庚烷和丙酮混合溶液作為洗脫劑洗脫硅膠柱，收集洗脫液并真空濃縮得濃縮液；e.將步驟d得到的濃縮液溶于石油醚或乙醚中結晶，結晶過程控制溫度為5 25°C、時間為1 M小時，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空濃縮后用乙醚重結晶，結晶過程控制溫度為5 10°c、時間為10 20小時，干燥得到雷帕霉素純品。本發(fā)明對步驟a中丙酮或乙醇的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述丙酮或乙醇的體積用量為菌絲體體積的5 10倍。本發(fā)明對步驟a中抽提的次數(shù)進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述抽提次數(shù)為2 4次。本發(fā)明對步驟b中乙酸乙酯的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述乙酸乙酯的體積用量為上清液體積的0. 2 1倍。本發(fā)明對步驟b發(fā)酵上清液的溫度進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述發(fā)酵上清液的溫度為22 28V。
本發(fā)明對步驟b發(fā)酵上清液的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述發(fā)酵上清液的pH為 5. 5 6. 5o本發(fā)明對步驟c中大孔樹脂進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述所用的大孔樹脂為X-5、 DiaionHP20 或 SP825。本發(fā)明對步驟c大孔樹脂的體積進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述大孔樹脂與濃縮液的體積比為1 5 1 20，更優(yōu)選地，大孔樹脂與濃縮液的體積比為為1 8 1 15。本發(fā)明對步驟c中洗滌劑進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑中丙酮占混合溶液體積的30% 55%，更優(yōu)選地，丙酮占混合溶液體積的40% 50%。本發(fā)明對步驟c中洗滌劑的溫度進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑的溫度為22 28°C。本發(fā)明對步驟c中洗滌劑的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑的pH為6. 5 7. 5。本發(fā)明對步驟c洗滌劑的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑的體積用量為大孔樹脂體積的1 4倍。本發(fā)明對步驟c中洗脫劑進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑中丙酮占混合溶液體積的70% 85%，更優(yōu)選地，丙酮占混合溶液體積的75% 80%。本發(fā)明對步驟c中洗脫劑的溫度進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑的溫度為22 28°C。本發(fā)明對步驟c中洗脫劑的pH進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑的pH為6. 5 7. 5。本發(fā)明對步驟c中洗脫劑的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑的體積用量為大孔樹脂體積的1. 2 1. 8倍。本發(fā)明對步驟d中乙酸乙酯的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述乙酸乙酯的體積用量為濃縮洗脫液體積的1 4倍。本發(fā)明對步驟d中萃取濃縮洗脫液的次數(shù)進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述乙酸乙酯萃取濃縮洗脫液的次數(shù)為2 3次。本發(fā)明對步驟d中硅膠進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述所用的硅膠粒徑為200-300目。本發(fā)明對步驟d中硅膠的體積裝量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述硅膠的體積裝量為脫水后真空濃縮得到的濃縮液體積的6 10倍。本發(fā)明對步驟d中洗滌劑進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑中正庚烷和丙酮的體積比為6 1 4 1。本發(fā)明對步驟d中洗滌劑的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗滌劑的體積用量為硅膠體積的4 6倍。本發(fā)明對步驟d中洗脫劑進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑中正庚烷和丙酮的體積比為3 1 1 1。本發(fā)明對步驟d中洗脫劑的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述洗脫劑的體積用量為硅膠體積的3 5倍。本發(fā)明對步驟e中結晶所用石油醚或乙醚的體積用量進行了優(yōu)選，優(yōu)選地，上述結晶所用的石油醚或乙醚的體積用量為濃縮液體積的2 5倍。
HPLC檢測分析雷帕霉素的方法引入美國專利公布說明書US20100029933A1公開的檢測方法，表1為HPLC分析的梯度洗脫方法，HPLC條件如下色譜柱安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C8，內徑-3. 5 μ m，直徑_4· 6mm，長度 _150mm流速1.5ml/min檢測波長287nm進樣量20μ 1流動相緩沖鹽A-乙腈，緩沖鹽B_2mM KH2PO4溶液柱溫45°C藥品溶劑乙腈表IHPLC分析的梯度洗脫方法
權利要求
1.一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法，其特征在于它包含如下步驟a.用丙酮或乙醇抽提發(fā)酵液過濾后得到的菌絲體，得到抽提液后，真空濃縮得濃縮抽提液；b.用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液過濾后得到的上清液，控制發(fā)酵上清液的溫度為15°C 35°C和pH為5. 0 7. 0，分離乙酸乙酯相得萃取液，真空濃縮得濃縮萃取液；c.將步驟a中的濃縮抽提液和步驟b中的濃縮萃取液合并得濃縮液，并加入到裝有大孔樹脂的床層進行吸附，用丙酮和水的混合溶液作為洗滌劑洗滌大孔樹脂，控制洗滌劑的溫度為15 35°C和pH為5. 0 8. 0，用丙酮和水的混合溶液作為洗脫劑洗脫大孔樹脂，控制洗脫劑的溫度為15 35°C和pH為5. 0 8. 0，收集洗脫液并真空濃縮，得濃縮洗脫液；d.用乙酸乙酯萃取c得到的濃縮洗脫液，經無水硫酸鈉或無水硫酸鎂脫水后真空濃縮得濃縮液，上樣硅膠柱進行層析分離，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗滌劑洗滌硅膠柱，正庚烷和丙酮混合溶液作為洗脫劑洗脫硅膠柱，收集洗脫液并真空濃縮得濃縮液；e.將步驟d得到的濃縮液溶于石油醚或乙醚中結晶，結晶過程控制溫度為5 25°C、 時間為1 M小時，干燥得到雷帕霉素粗品。f.丙酮溶解雷帕霉素粗品，真空濃縮后用乙醚重結晶，結晶過程控制溫度為5 10°C、 時間為10 20小時，干燥得到雷帕霉素純品。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔樹脂為X-5、DiaionHP20或 SP825。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟積的30% 55%。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟積的40% 50%。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟積的70% 85%。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述的步驟積的75% 80%。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所用的硅膠粒徑為200-300目。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟d洗滌劑中正庚烷與丙酮的體積比為6 1 4 1。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟d洗脫劑中正庚烷與丙酮的體積比為3 1 1 1。c洗滌劑中丙酮占混合溶液體 c洗滌劑中丙酮占混合溶液體 C洗脫劑中丙酮占混合溶液體 C洗脫劑中丙酮占混合溶液體
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種從發(fā)酵液中提純雷帕霉素的方法。為了提高雷帕霉素的純度，降低雷帕霉素中的雜質含量，同時提高雷帕霉素的收率，本發(fā)明運用菌絲體抽提、發(fā)酵液萃取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及冷卻結晶和重結晶技術從發(fā)酵液中提取純化得到雷帕霉素純品，純度大于99.3％，單雜小于0.10％，收率提高到53～60％。本發(fā)明提高雷帕霉素純度、降低雜質含量的同時提高了收率，而且操作方便、工藝簡單，在工業(yè)化大生產中有很高的實用價值。
文檔編號C07D498/18GK102443012SQ201010505168
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權日2010年10月13日
發(fā)明者趙麗麗, 趙志全 申請人:山東新時代藥業(yè)有限公司