專利名稱：一種提取竹葉總黃酮的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雜環(huán)化合物，具體涉及雜環(huán)不氫化的雜環(huán)化合物，特別是涉及黃酮類 化合物的制備。
背景技術：
我國素有“竹子王國”之稱，竹葉來源豐富，分布地域廣。竹葉為禾本科竹亞科剛 YiM^Yi Phyllostachys heterocycla vat· pubescens 的卩十。卩十中含有豐富的HSI類U 合物，具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、調節(jié)血脂和血膽固醇、調節(jié)免疫、抗菌、抗病毒 等作用。且安全無毒，在功能食品和醫(yī)藥保健品、藥品等方面有著十分廣闊的應用前景。竹葉中的黃酮類化合物以碳苷黃酮為主，四種主要的竹葉碳苷黃酮分別是葒草苷 (Orientin)，異葒草苷(Homoorientin)Ji^U- (Vitexin)，異牡荊苷(Isoviextin)，黃酮 碳苷的生物活性已經被報道，但其在水和乙醇中的溶解度都不是很大，目前使用的主要提 取溶劑有乙醇、水，提取方法多采用煎煮法，回流法等，都是在完整植物細胞存在的情況下， 通過浸潤、滲透、溶劑進入組織細胞，溶解細胞內物質而使其擴散到溶劑中，提取過程中存 在巨大的傳質阻力，致使提取率普遍偏低。如“一種從竹葉中提取竹葉黃酮的生產方法”(公 開號為CN1907994)，系采用6 8倍量水，加熱到80 100°C，持續(xù)0. 5 1. 5小時。又如 “竹葉黃酮提取物的制備方法”(公開號為CN101391060)，系采用C1-C3的醇提取，成本高，且 竹葉中含有大量葉綠素，給后續(xù)操作帶來一定困難。再如“從竹葉中提取竹葉黃酮類系列產 品的生產工藝”(公開號為CN 1923828)，系采用水提取結合膜分離技術制得，工序較復雜， 宜發(fā)生膜堵塞現(xiàn)象，不適宜工業(yè)化大生產，且無法去除一些重金屬雜質。植物的有效成分往往包裹在細胞壁內，酶處理法可以水解破壞細胞壁結構，使有 效成分直接暴露出來，溶解、混懸或膠溶于提取溶劑中，以提高總黃酮的提取率。酶解法具 有反應溫和、得率高、成本低廉、操作簡單等優(yōu)點。超聲波的空化作用，能加速植物細胞壁破 裂，促進活性物質的釋放，提取效率高，時間短，雜質少，廣泛用于植物活性成分的提取。上 述酶解和超聲破壁的現(xiàn)代工藝已被引入提取植物總黃酮的技術方案中，但尚存在一些有待 改進的不足。如公開號為CN 101486745A的專利申請，該申請公開了 “一種富含黃酮類活性成 分的木豆葉提取物的誘導提取方法”，所述方法的技術方案是采用勻漿破碎酶解、恒溫酶 解、負壓空化提取、溶劑除雜和富集等技術，但操作復雜，提取率并不高，且在提取過程中應 用了多種易燃易爆有機試劑，不適合大生產使用。又如公開號為CN101524458的專利申請，該申請公開了 “土茯苓皂甙、黃酮類提取 物及其制備方法”，所述方法的技術方案包括以下步驟(1) 土茯苓原料藥材的處理，包括對 原料藥材進行真空干燥、粉碎和酶解；(2) 土茯苓皂甙和黃酮類化合物的提取，在超聲波輔 助下用乙醇回流提取后合并濃縮，用石油醚脫脂后分別用氯仿和乙酸乙酯萃取，回收溶劑 后真空干燥得到的土茯苓黃酮類提取物。上述專利申請方案所得提取物中含黃酮類化合物 30-80 %，但在酶解之后使用了大量易燃易爆有毒揮發(fā)性有機溶劑進行純化，不利于工業(yè)化大生產。再如公開號為CN101020720的專利申請，該申請公開了 “葛根多糖提取工藝”，所 述工藝方法的技術方案是，將葛根磨漿，在漿液中加入纖維素酶和蛋白酶進行酶解反應，同 時進行低強度超聲波處理，并用加入VC和木糖護色，然后濾除纖維，濾液進行離心分離出 淀粉，離心液真空濃縮后加入乙醇，再經離心分離出濕葛根多糖，再經干燥得到含葛根黃酮 的葛根多糖。該方法采用的是乙醇沉淀去除雜質的方法，成本高，提取物中黃酮等有效成分 損失大。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種改進的竹葉總黃酮的提取方法，該方法顯 著提高了竹葉總黃酮的提取率和純度。本發(fā)明解決上述問題的技術方案如下一種提取竹葉總黃酮的方法，該方法由以下步驟組成(1)超聲酶解取竹葉干燥、粉碎后加入10 20倍(質量體積倍)的質量濃度為 0. 05% 0. 15%的復合酶溶液，再將溶液的pH值調至4. 5 6，然后在40 60°C下超聲 (50KHZ，160W)處理0. 5 1. 5小時后迅速升溫至85 90°C，保持5min滅酶，濾過，收集濾 液，減壓濃縮至相對密度為1. 12 (60 0C )；其中，所述的復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合 物，二者的質量配比為1 1;(2)絮凝除雜于60°C條件下，先按SOmL殼聚糖膠體溶液/IOOOmL濃縮液的比例 往濃縮液中加入殼聚糖，充分攪拌，再按80mL 101果汁澄清劑水溶液/IOOOmL濃縮液的比 例加入101果汁澄清劑水溶液，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液；其中，所述的殼 聚糖膠體溶液是體積濃度為的醋酸溶液與殼聚糖混合制成的殼聚糖質量濃度為的 醋酸溶液，所述的101果汁澄清劑水溶液是水與101果汁澄清劑混合制成的的101果汁澄 清劑質量濃度為5%的水溶液。(3)過大孔樹脂柱將上清液過DlOl樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫 液濃縮，減壓干燥即得竹葉總黃酮。本發(fā)明上述方法中，所述的超聲酶解的最佳條件為復合酶溶液的加入量為竹葉 干粉的15倍(質量體積倍)；復合酶溶液的質量濃度為1%;竹葉干粉與復合酶溶液混合的 溶液的PH值調至5 ；超聲處理的溫度為50°C，時間為1小時。本發(fā)明方法較現(xiàn)有技術具有下列優(yōu)點(1)眾所周知，竹葉內含有纖維素和木質素，而葉片的表面則含有果膠質；纖維素 和木質素與果膠質是兩類特性不同的物質，而不同的酶的降解作用又不相同。本發(fā)明所述 的復合酶正是基于上述因素而設計的，利用纖維素酶充分降解竹葉內的纖維素和木質素， 利用果膠酶充分降解葉片表面的果膠質，同時結合超聲波的作用，既能激活酶的活性又能 加速黃酮的溶出，從而使竹葉總黃酮的提取率顯著提高。(2)由于竹葉經過超聲酶解后，提取液中存在顆粒較大的懸浮顆粒、重金屬離子及 各種鞣質和色素等大分子不穩(wěn)定性雜質而嚴重影響提取物的純度和品質。因此，本發(fā)明先 加入殼聚糖，利用其吸附架橋和對負電荷的中和作用，除去中藥提取液中懸浮顆粒重金屬 離子，然后加入101果汁澄清劑，利用101果汁澄清劑的吸附和聚凝的雙重作用，使所述的大分子雜質快速聚凝沉淀；同時，所述的101果汁澄清劑對溶液中的殘留殼聚糖也同樣具 有吸附和聚凝作用，進一步消除了殘留的殼聚糖對提取物品質的影響。(3)此外，本發(fā)明所述方法還具有過程操作簡單、耗時少、成本低和安全無毒的優(yōu)
點ο


圖1為異葒草苷標準曲線。
具體實施例方式例 11、提取竹葉總黃酮(1)先做前期的準備工作，即，將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果 膠酶加入水制備成濃度為0. 1 %的復合酶溶液；取殼聚糖0. Sg,加入到SOmL濃度為1 %醋 酸溶液中配成殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液，備用；取101果汁澄清劑4g，加入到 SOmL蒸餾水中配成101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到5. 0，然后 在50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄 清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品22g。2、竹葉總黃酮的純度測定(1)對照品儲備溶液的制備精密稱取異葒草苷對照品15mg，加入50%乙醇制成 濃度為0. 15mg異葒草苷/lmL50%乙醇的溶液作為對照品備用。(2)標準曲線的繪制準確吸取對照品 0. 5mL，1. OmL,，2. OmL, 3. OmL, 4. OmL, 5. OmL 分別置于6個IOmL的容量瓶中，再向每個容量瓶中加入濃度為5%的NaNO2溶液0. 3mL搖 勻，放置6min后加濃度為10 %的Al (NO3) 3溶液0. 3mL搖勻，再放置6min后加入濃度為4% 的NaOH溶液4mL，然后用50%乙醇定容至IOmL并搖勻，放置IOmin后置比色皿中在波長 400 600nm之間測定吸收光譜，在最大吸收波長為505nm條件下分別測得每個容量瓶中對 照品的吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)值，吸光度為縱坐標(Y)值，在直角坐標系中 繪制出6個對應點的坐標，然后進行線性回歸得到相關系數(shù)為r = 0. 9997的標準曲線為Y =13. 34X+0. 008，標準曲線見圖1。(3)樣品中總黃酮的含量測定精密稱取竹葉總黃酮粗品20mg置于25mL量瓶中， 加濃度為50%的乙醇定容，濾過；精密量取續(xù)濾液ImL置于IOmL量瓶中，加濃度為50%的 乙醇定容；然后從IOmL的量瓶中精密量取5mL，并按上述步驟(2)所述的方法，依次加入 NaNO2, Al (NO3) 3和NaOH溶液，再用50%乙醇定容至IOmL得到待測樣品并測定吸光度(本 例的測定結果為0.403)；最后，將所測得的吸光度值代入方程Y= 13. 34X+0. 008，再根據 待測樣品的制備過程計算出待測樣品中總黃酮的量(本例所得22g竹葉總黃酮粗品中含總黃酮的量為[(0. 403-0. 008)/13. 34] X 2X 10X 25X 22000/20 = 16285. 6mg)，即得竹葉總 黃酮粗品中總黃酮的含量。本例所得22g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為16. 2856/22 = 74%。例 2(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為 0. 15%的復合酶溶液；按例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液和101 果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入10倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到4. 5，然后 在40°C下超聲(50KHZ，160W)處理0. 5h后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄 清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品18g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 18g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為68%。例 3(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為 0. 05%的復合酶溶液；按例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液和101 果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入20倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到6. 0，然后 在60°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. 5h后迅速升溫至85°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄 清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品20g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 20g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為70%。例4 (比較例)(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為 0. 的復合酶溶液。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到5. 0，然后 在50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)加入適量乙醇，使含醇量達60 80%，靜置冷藏12小時，取上清液回收乙醇， 濃縮，濾過，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品15g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 15g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為30%。將本例與例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝
6除雜改用乙醇沉淀去除雜質，所得粗品的純度就明顯降低。例5 (比較例)(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為 0. 的復合酶溶液；按例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到5. 0，然后 在50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)于60°C時條件下，加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，
取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品25g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 25g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為38%。將本例與例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝 除雜步驟中的101果汁澄清劑澄清的步驟略去，所得粗品的純度也明顯降低。例6 (比較例)(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取等量的纖維素酶和果膠酶加入水制備成濃度為 0. 的復合酶溶液。按例1相同的方法配制出101果汁澄清劑濃度為5%的101果汁澄清 劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的復合酶溶液，再將溶液的pH值調到5. 0，然后 在50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減 壓濃縮至相對密度為1. 12(60°C )。(3)于60°C時條件下，加入101果汁澄清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心
分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品26g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 26g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為33%。將本例與例1相比可見，超聲酶解和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將絮凝 除雜步驟中的殼聚糖澄清的步驟略去，所得粗品的純度也明顯降低。例7 (比較例)(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取纖維素酶加入水制備成濃度為0. 1 %的復合酶 溶液；按例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃 度為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的酶溶液，再將溶液的pH值調到5.0，然后在 50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減壓濃 縮至相對密度為1. 12(60°C)。(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄 清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮， 減壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品12g，按例所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得12g竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為62%。將本例與例1相比可見，絮凝除雜和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將超聲 酶解步驟中的復合酶改用單一的纖維素酶，竹葉總黃酮的得率就明顯降低。例8 (比較例)(1)將竹葉干燥并粉碎成粗粉；取果膠酶加入水制備成濃度為0. 1 %的復合酶溶 液；按例1相同的方法配制出殼聚糖濃度為的殼聚糖膠體溶液和101果汁澄清劑濃度 為5%的101果汁澄清劑水溶液，備用。(2)取竹葉粗粉1000g，加入15倍的酶溶液，再將溶液的pH值調到5.0，然后在 50°C下超聲(50KHZ，160W)處理1. Oh后迅速升溫至90°C，保持5min滅酶，濾過，濾液減壓濃 縮至相對密度為1. 12(60°C)。(3)于60°C時條件下，先加入殼聚糖膠體溶液80mL，充分攪拌，再加入101果汁澄 清劑水溶液80mL，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液。(4)將上清液過DlOl大孔樹脂柱，用體積濃度為50%的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減 壓干燥，稱重，得竹葉總黃酮粗品I0g，按例1所述的竹葉總黃酮的純度測定方法，測得所得 IOg竹葉總黃酮粗品的總黃酮含量為60%。。將本例與例1相比可見，絮凝除雜和大孔樹脂純化的步驟完全相同，只是將超聲 酶解步驟中的復合酶改用單一的果膠酶，竹葉總黃酮的得率也明顯降低。
權利要求
一種提取竹葉總黃酮的方法，該方法由以下步驟組成(1)超聲酶解取竹葉干燥、粉碎后加入10～20倍的質量濃度為0.05％～0.15％的復合酶溶液，再將溶液的pH值調至4.5～6，然后在40～60℃下超聲處理0.5～1.5小時后迅速升溫至85～90℃，保持5min滅酶，濾過，收集濾液，減壓濃縮至相對密度為1.12；其中，所述的復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物，二者的質量配比為1∶1；(2)絮凝除雜于60℃條件下，先按80mL殼聚糖膠體溶液/1000mL濃縮液的比例往濃縮液中加入殼聚糖，充分攪拌，再按80mL 101果汁澄清劑水溶液/1000mL濃縮液的比例加入101果汁澄清劑水溶液，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液；其中，所述的殼聚糖膠體溶液是體積濃度為1％的醋酸溶液與殼聚糖混合制成的殼聚糖質量濃度為1％的醋酸溶液，所述的101果汁澄清劑水溶液是水與101果汁澄清劑混合制成的的101果汁澄清劑質量濃度為5％的水溶液。(3)過大孔樹脂柱將上清液過D101樹脂柱，用體積濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥即得竹葉總黃酮。
2.根據權利要求1所述的一種提取竹葉總黃酮的方法，其特征在于，所述的超聲酶解 的最佳條件為復合酶溶液的加入量為竹葉干粉的15倍；復合酶溶液的質量濃度為1%;竹 葉干粉與復合酶溶液混合的溶液的PH值調至5 ；超聲處理的溫度為50°C，時間為1小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取竹葉總黃酮的方法，該方法由以下步驟組成取竹葉干燥、粉碎后加入10～20倍的質量濃度為0.05％～0.15％的復合酶溶液，再將溶液的pH值調至4.5～6，然后在40～60℃下超聲處理0.5～1.5小時后迅速升溫至85～90℃，保持5min滅酶，濾過，收集濾液，減壓濃縮至相對密度為1.12；其中，所述的復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物，二者的質量配比為1∶1；于60℃條件下，先按80mL殼聚糖膠體溶液/1000mL濃縮液的比例往濃縮液中加入殼聚糖，充分攪拌，再按80mL 101果汁澄清劑水溶液/1000mL濃縮液的比例加入101果汁澄清劑水溶液，充分攪拌，靜置過夜，離心分離，取上清液；將上清液過D101樹脂柱，用體積濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥即得竹葉總黃酮。
文檔編號C07D407/04GK101973984SQ20101050632
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權日2010年10月13日
發(fā)明者劉強, 劉莉 申請人:南方醫(yī)科大學