專利名稱：FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥領(lǐng)域。尤其是FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的制備、高效結(jié) 合肽結(jié)構(gòu)序列的確認(rèn)以及其作為先導(dǎo)分子可望在腫瘤等相關(guān)疾病治療藥物研發(fā)和診斷中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病。在與腫瘤相關(guān)的各類轉(zhuǎn)錄因子 中，F(xiàn)ox家族蛋白成員眾多。根據(jù)DNA結(jié)合區(qū)的同源性，已在不同種屬中證實了 100多個 Fox家族成員，分屬于17個亞族。Fox家族蛋白生物學(xué)功能廣泛，涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期 調(diào)控、糖和脂類代謝、衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程，其突變和表達異常與發(fā)育畸形、代 謝性疾病以及腫瘤發(fā)生等多種疾病有關(guān)。FoxMl作為Forkhead家族的一個特殊成員在腫瘤等活躍的分裂細(xì)胞中大量表達， 是控制包括增殖、成熟、死亡在內(nèi)的整個細(xì)胞生命周期的重要基因之一，與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移 密切相關(guān)。目前，國內(nèi)外對FoxMl的研究尚處于起步階段。本發(fā)明在原核重組表達和分離 純化制備FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的基礎(chǔ)上，利用噬菌體隨機肽庫篩選和獲得靶向FoxMIc 的高效結(jié)合肽分子及結(jié)構(gòu)序列，對于進一步開展靶向FoxMIc小分子多肽先導(dǎo)藥物的發(fā)現(xiàn) 與利用具有重要的意義和價值。本發(fā)明國內(nèi)外未見相關(guān)報道與專利。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的如上缺點或不足，本發(fā)明的目的在于創(chuàng)建一種FoxMIc的DNA結(jié)合 蛋白原核表達與制備、高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取途徑，采用如下的方法
FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法，包含 (1)、 利用PQE30原核高效表達系統(tǒng)，將編碼FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的DNA片段與pQE30質(zhì)粒 重組，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PQE-D并轉(zhuǎn)化原核宿主菌M15，所得宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)表達并通過親和 層析純化及BCA法定量，制備獲得FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白；
(2)、以FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白為篩選靶標(biāo)，利用噬菌體隨機十二肽庫篩選技術(shù)，通 過“吸附一洗脫一擴增”的循環(huán)篩選獲得富集噬菌體，經(jīng)4輪篩選，將最后一輪篩選富集的 噬菌體鋪板獲得靶向FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列；
所述靶向FoxMIc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的富集噬菌體至少含有以下一種多肽結(jié)構(gòu)序列 第一組WHL/q/d/n ；第二組DLY，DLLY, DHYN，DLNY ；第三組SSLWN/E ；第四組HLDY，HLYE, YHLE, LYHDD, YHLEE ；第五組FYNL，NYFL ；第六組YPH，YPL, YPS ；所述結(jié)合肽多肽結(jié)構(gòu)序列 分子對接在FoxMl上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測主要是Arg-Arg (R-R，aa :254，256)和Glu-Thr-S er-Ala-Asn-Gly-Lys (E-T- S-A-N-G-K, aa :298_304)。本發(fā)明的目的還在于，所述結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列作為先導(dǎo)分子用于腫瘤等相關(guān)
3疾病的治療藥物研發(fā)和診斷。采用本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，以FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)原核重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達獲得的蛋 白為靶標(biāo)，從噬菌體隨機肽庫中篩選和獲得一組靶向FoxMlc的高效結(jié)合多肽。所獲多肽 含以下結(jié)構(gòu)序列第一組WHL/q/d/n ；第二組DLY，DLLY，DHYN，DLNY ；第三組SSLWN/E ；第四 組HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE ；第五組FYNL，NYFL ；第六組YPH，YPL，YPS。并與 FoxMl 蛋白的重要結(jié)構(gòu)域Arg-Arg (R-R, aa 254,256)和Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys (E-T-S-A
-N-G-K，aa 298-304)良好對接。本發(fā)明所獲得的全序列或多肽結(jié)構(gòu)序列可望作為先 導(dǎo)分子用于腫瘤治療藥物的研發(fā)和用于腫瘤等疾病的診斷。


圖1 噬菌體隨機肽庫篩選所獲序列匯總表。圖2 單克隆結(jié)合肽噬菌體針對FoxMlc蛋白的親和力測定表。圖3多肽結(jié)構(gòu)序列與FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)位點的分子對接預(yù)測表。圖4 =FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白親和純化咪唑洗脫數(shù)據(jù)圖。圖5 =FoxMlc結(jié)合肽結(jié)構(gòu)序列的Clustal W分析圖。
具體實施例方式本發(fā)明建立了 FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)目的蛋白的原核重組誘導(dǎo)表達質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu) 建、蛋白誘導(dǎo)表達、親和層析分離純化的制備方法，并以其為靶標(biāo)，利用噬菌體隨機肽庫篩 選、親和力測定以及計算機模擬分子對接等技術(shù)獲得了一組與目的蛋白FoxMlc的DNA結(jié) 合區(qū)蛋白的高效結(jié)合多肽和多肽結(jié)構(gòu)序列，同時預(yù)測了其在FoxMl上的分子對接靶點。本 發(fā)明通過如下思路和途徑實現(xiàn)了 FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列 的獲得及用途1)構(gòu)建FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白原核重組誘導(dǎo)表達系統(tǒng)；2)宿主菌M15 的轉(zhuǎn)化和大量誘導(dǎo)表達以獲得FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)目的蛋白；3)利用親和層析技術(shù)，通 過與M-NTA高結(jié)合力的蛋白吸附并洗脫，獲得高純度目的蛋白，并通過BCA法定量；4)以 FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白為靶標(biāo)，進行噬菌體隨機十二肽庫的篩選和小分子高效結(jié)合多肽 的獲得，共獲得18條不同序列；5)通過生物信息分析、多重序列比對以及模擬分子對接等 方法確認(rèn)篩選獲得的序列的原始創(chuàng)新性以及重要多肽結(jié)構(gòu)序列，并預(yù)測了其在FoxMl上分 子對接的目標(biāo)靶點，確認(rèn)以下多肽結(jié)構(gòu)序列第一組WHL/q/d/n ；第二組DLY，DLLY, DHYN, DLNY ；第三組SSLWN/e ；第四組HLDY，HLYE, YHLE, LYHDD, YHLEE ；第五組FYNL，NYFL ；第六 組YPH，YPL, YPS。發(fā)現(xiàn)其在FoxMl上的分子對接可能靶點是Arg-Arg (R-R，aa :254，256) 和 Glu-Thr-Ser-Ala-Asn-Gly-Lys(E-T-S-A-N-G-K，aa
=298-304) ；6)采用親和力反篩測定等方法確認(rèn)篩選得到的多肽對FoMl的較高親和力 和專一性；7)所述結(jié)合肽及所含多肽結(jié)構(gòu)序列作為先導(dǎo)分子用于腫瘤等相關(guān)疾病的治療 藥物研發(fā)和診斷以及其它用途:A 如同現(xiàn)行的多肽藥物，用于腫瘤等疾病治療；B 如同現(xiàn) 有商品化的HA、6X組氨酸等分子標(biāo)簽方式，將其構(gòu)建于蛋白質(zhì)表達載體中，通過Western 等免疫檢測方法，用于蛋白質(zhì)表達的分子檢測等。下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的描述，但其不代表為本發(fā)明的唯一實施方 式。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明以下的技術(shù)步驟。l)FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白原核重組誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的構(gòu)建；2)蛋白誘導(dǎo)表達、親和層析與純化；3)靶向目的蛋白的噬菌體隨機肽 庫篩選和小分子結(jié)合多肽的獲得；4)靶向目的蛋白的結(jié)合肽結(jié)構(gòu)序列的確定、親和力測定 及模擬分子對接。以下予以詳述。(一)FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白原核重組誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的構(gòu)建 1、人類FoxMlc轉(zhuǎn)錄因子的克隆
根據(jù)人FoxMlc全長cDNA序列特征，設(shè)計DNA結(jié)合區(qū)的PCR引物并進行PCR擴增。上、 下游引物分別為Dl: 5' -AGATCTAAGATGAGTTCTGATGGACTGGGC-3'，D2: 5' -CTCGAGGAG CTCTGGATTCGGTCGTTTC-3‘。將擴增的DNA結(jié)合區(qū)片段連接pMD19_T，電轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α并
酶切鑒定。2、人類FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白原核重組誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的構(gòu)建
① 經(jīng)質(zhì)粒提取，利用BamH I及Bgl II將DNA結(jié)合區(qū)片段從克隆載體pMD19_T上雙 酶切下，瓊脂糖凝膠電泳確定，利用膠回收試劑盒回收相應(yīng)片段。將回收片段與同樣雙酶切 并回收的表達載體PQE30相連接，電轉(zhuǎn)化宿主菌M15。②提取重組質(zhì)粒，酶切并瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定，重組菌種凍存于-70°C。(二)蛋白誘導(dǎo)表達、親和層析與純化
1、重組宿主菌的誘導(dǎo)表達、細(xì)胞破碎與蛋白獲得
①將5 ml LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的重組菌接種到含抗生素(50 mg / L) LB的 500 ml培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)表達并收集菌液200ml ；
②4°C，7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀菌體；
③菌體加IOml破碎緩沖液(pH7. 4的50mM磷酸緩沖液，含0. 5M NaCl，0. 5mg/ ml溶菌酶，ImM PMSF。其中溶菌酶、PMSF現(xiàn)加)；
④混合菌體在冰水浴中超聲破碎4秒X 99次，檢測pH，并用0. 5M NaOH調(diào)節(jié) 并穩(wěn)定PH在7-8 ；
⑤破碎菌液4°C，12000g離心15分鐘，上清和沉淀分別留樣，PAGE電泳初步 檢測蛋白存在與含量。2、重組蛋白的親和純化
①1. 6 X 20cm 的 Ni-NTA Agarose FF 裝柱，柱床體積為 IOml ；
②用緩沖液1平衡2-5個床體積，流速為2ml/min ；
③將全部細(xì)胞破碎液(50 mM PBS, pH7. 4，0. 5M NaCl)用0. 45 μ m濾膜過濾， 上樣，流速為lml/min ；
④用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2ml/min ；
⑤分別用含50、100、200、400mM咪唑的緩沖液3進行梯度洗脫，流速為2ml/ min，確定親和純化梯度洗脫的最佳咪唑濃度為200mM，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢 測融合蛋白的分子量大小和純度，見圖4 ；
⑥用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/ min，柱子置于4 8°C保存。附
緩沖液1 :50mM, ρΗ7· 4的PBS緩沖液；
緩沖液2 0. 5Μ咪唑的50mM，pH7. 4的PBS緩沖液。
權(quán)利要求
FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法，包含 (1)、利用pQE30原核高效表達系統(tǒng)，將編碼FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的DNA片段與pQE30質(zhì)粒重組，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pQE D并轉(zhuǎn)化原核宿主菌M15，所得宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)表達并通過親和層析純化及BCA法定量，制備獲得FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白；(2)、以FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白為篩選靶標(biāo)，利用噬菌體隨機十二肽庫篩選技術(shù)，通過“吸附－洗脫－擴增”的循環(huán)篩選獲得富集噬菌體，經(jīng)4輪篩選，將最后一輪篩選富集的噬菌體鋪板獲得靶向FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列；所述靶向FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的富集噬菌體至少含有以下一種多肽結(jié)構(gòu)序列第一組WHL/Q/D/N ；第二組DLY，DLLY，DHYN，DLNY；第三組SSLWN/E ；第四組HLDY，HLYE，YHLE，LYHDD，YHLEE；第五組FYNL，NYFL；第六組YPH，YPL，YPS；所述結(jié)合肽多肽結(jié)構(gòu)序列分子對接在FoxM1上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測主要是Arg Arg(R R, aa254，256) 和Glu Thr Ser Ala Asn Gly Lys(E T S A N G K，aa298 304)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之FoxMlc的DNA結(jié)合區(qū)蛋白高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲 取方法，其特征在于，所述親和層析技術(shù)通過與M-NTA高結(jié)合力的蛋白吸附并洗脫，獲得 高純度目的蛋白，梯度洗脫的最佳咪唑濃度200mM。
3.由權(quán)利要求1或2所得結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的用途，其特征在于，所述結(jié)合肽及多 肽結(jié)構(gòu)序列作為先導(dǎo)分子用于腫瘤等相關(guān)疾病的治療藥物研發(fā)和診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法和目標(biāo)物的用途。以FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)原核重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達獲得的蛋白為靶標(biāo)，從噬菌體隨機肽庫篩選和獲得一組靶向FoxM1c的高效結(jié)合多肽。包括FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建，誘導(dǎo)表達和蛋白純化制備；基于FoxM1c的DNA結(jié)合區(qū)蛋白的噬菌體隨機肽庫篩選與分析。經(jīng)4輪篩選，獲得富集靶向FoxM1c的結(jié)合肽噬菌體和多肽結(jié)構(gòu)序列。目標(biāo)物作為先導(dǎo)分子用于腫瘤等相關(guān)疾病的治療藥物研發(fā)和診斷。
文檔編號C07K1/22GK101974069SQ20101051547
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者崔健, 茆燦泉, 郭泰林 申請人:西南交通大學(xué)