專利名稱：肌動蛋白解聚因子抗原表位、抗肌動蛋白解聚因子抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，涉及一種肌動蛋白解聚因子抗原表位、抗肌動蛋白解聚因子抗體，本發(fā)明還涉及分別含有所述抗原表位和抗體的組合物、以及所述抗體在檢測肌動蛋白解聚因子中的用途。
背景技術(shù)：
肌動蛋白解聚因子(actindepolymerizing factor/cofilin，ADF/cofilin)屬于肌動蛋白結(jié)合蛋白(actin-binding protein)家系。迄今為止，可以在所有的真核細(xì)胞中檢測到ADF/cofilin。它們能調(diào)節(jié)(纖)絲狀肌動蛋白細(xì)胞骨架(F-actin cytoskeleton), 影響細(xì)胞的各種生理功能。不同的生物有不同的ADF/cofilin，但其功能基本相似。ADF/ cofilin可以使(纖)絲狀肌動蛋白(F-actin)解聚合，而且這種解聚合活性是可逆的， ADF/cofilin切割F-actin并且能提高球狀肌動蛋白(G-actin)離開纖維突出端(pointed end)的能力，其作用受很多因素調(diào)控。肌動蛋白對生物正常細(xì)胞形態(tài)維持、胞質(zhì)分裂、胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞器運動及植物的頂端生長起著重要的作用。一旦破壞生物體細(xì)胞肌動蛋白的動態(tài)平衡，生物或多或少表現(xiàn)出形態(tài)異常。研究表明，肌動蛋白解聚因子解聚和切割肌動蛋白，肌動蛋白解聚因子的過表達(dá)會破壞肌動蛋白的動態(tài)平衡。肌動蛋白動態(tài)平衡一旦遭到破壞，就有可能影響植物正常生長。肌動蛋白解聚因子在植物體內(nèi)的動態(tài)變化，是影響肌動蛋白的動態(tài)平衡的重要因素。水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物生長發(fā)育、逆境反應(yīng)等基礎(chǔ)研究的模式植物。水稻基因組測序工作的成果極大地推動了水稻相關(guān)研究的進(jìn)展，篩選并提出了適合水稻肌動蛋白解聚因子基因肌動蛋白解聚因子。肌動蛋白解聚因子基因0s07t0484200-01，通過生物信息學(xué)分析，位于水稻第七條染色體上，DNA序列全長1514bp，cDNA序列全長420bp，編碼139個氨基酸組成的肌動蛋白解聚因子蛋白。通過 RAP-DB數(shù)據(jù)庫比對分析，肌動蛋白解聚因子0s07t0484200-01為一種肌動蛋白解聚因子蛋白。目前還沒有關(guān)于該基因和蛋白等相關(guān)的報道。目前對肌動蛋白解聚因子全長抗原產(chǎn)生的抗體的研究為空白。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件會有超過30%的概率不能預(yù)測到抗原決定簇(Chang HT, Liu CH, Pai Tff.Estimation and extraction of B—cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches. J Mol Recognit. 2008 Nov-Dec ；21 (6) :431-41), 該軟件對全長抗原的抗原決定簇預(yù)測存在著特異性問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明人在通過ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件預(yù)測得到多個抗原表位序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了大量的實驗和不懈的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)測的36個抗原表位中有一個抗原表位序列CKFKFQELKTRRG(SEQID NO 3)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特
3異性。由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個方面涉及一種肌動蛋白解聚因子抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明的抗原表位可以通過常規(guī)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成得到，也可以在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)得到；優(yōu)選的是化學(xué)合成。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含SEQ ID NO 3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位，任選地，可以含有免疫佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑等。發(fā)明的還一方面涉及一種肌動蛋白解聚因子抗原表位-載體復(fù)合物；其中，所述肌動蛋白解聚因子抗原表位為SEQ ID NO :3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位，所述載體可以是鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、BSA或酪蛋白等。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗肌動蛋白解聚因子抗體，所述抗肌動蛋白解聚因子抗體能夠特異性地結(jié)合SEQ ID NO :3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位。所述抗肌動蛋白解聚因子抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體可以得自各種常規(guī)制備多克隆抗體的動物，例如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以根據(jù)SEQ ID NO :3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位制備單克隆抗體，具體操作可以參見本領(lǐng)域的技術(shù)手冊，也可以參考文獻(xiàn)例如Nature 1975 Kohler&Milstein Vol256，p495。本發(fā)明的還一方面涉及一種含有抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體的血清(簡稱多抗血清)，其通過使用SEQ ID NO :3所示的抗原表位免疫動物制得。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體制備方法，包括將 SEQ ID NO :3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位作為抗原免疫動物的步驟。任選地，所述免疫步驟可以加入佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐劑，等等。本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體制備方法，包括如下步驟1)將SEQ ID NO 3所示的肌動蛋白解聚因子抗原表位作為抗原免疫動物；2)取血，離心收集多抗血清；和3)純化步驟2)中的多抗血清，得到抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種肌動蛋白解聚因子檢測劑，其包含本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體。肌動蛋白解聚因子的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)如下MANSASGLAVNDE |CKFKFQELKTRRG|: FRFIVFKIDDKAMEIKVERLGQTAEGYEDFAATLPADEC
RYAVYDLDFVTDENCQKSKIFFFSWSPDTARTRSKMLYASSKDRFRRELDGIQCEIQATDPSEMSLDIIRARAH(SE Q ID NO 2)其中加框的序列為SEQ ID NO :3本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體在制備檢測肌
4動蛋白解聚因子的藥物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測肌動蛋白解聚因子的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體的步驟。具體地，包括如下步驟1)將待測樣品與本發(fā)明的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體孵育，使所述的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體與待測樣品中的肌動蛋白解聚因子特異性結(jié)合，由此形成免疫復(fù)合物；和2)檢測是否存在免疫復(fù)合物。上述檢測肌動蛋白解聚因子的方法可以檢測肌動蛋白解聚因子的有無、對其進(jìn)行半定量(例如western blot方法)；在有肌動蛋白解聚因子標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，還可以通過 ELISA方法對肌動蛋白解聚因子進(jìn)行定量檢測。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述肌動蛋白解聚因子為水稻的肌動蛋白解聚因子。具體的，所述水稻為水稻93-11。發(fā)明的有益效果1)抗原獲得方便。本發(fā)明采用化學(xué)合成多肽的方法獲得抗原，合成了 13個氨基酸的抗原決定簇，保證了抗體的特異性，避免了抗原制備的繁瑣。2)抗體制備簡單，收獲量大。取合成的抗原1-ang免疫新西蘭大白兔，每隔14天加強(qiáng)免疫一次；第2次加強(qiáng)免疫后7天耳靜脈取血，離心收集多抗血清，獲得大量的多克隆抗體。3)抗體的特異性強(qiáng)。用抗原免疫獲得的多克隆抗體特異性強(qiáng)，其多抗血清的效價信息為KLH > 25600，裸肽> 12800，抗體和抗原的結(jié)合靈敏，為科學(xué)研究肌動蛋白解聚因子蛋白的表達(dá)情況提供了堅實的基礎(chǔ)。


圖1 使用抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體對肌動蛋白解聚因子在水稻不同組織的免疫印跡檢測結(jié)果。圖2 多抗檢測的肌動蛋白解聚因子的一級質(zhì)譜圖。圖3 多抗檢測的肌動蛋白解聚因子的二級質(zhì)譜圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 候選抗原表位1的預(yù)測水稻肌動蛋白解聚因子對應(yīng)的基因是0s07g0485100，GenBank登錄號 ΝΡ_001059648. 1。讀碼框序列如下ATGGCGAATTCTGCGTCAGGGCTGGCGGTGAACGACGAGTGCAAGTTCAAGTTCCAGGAGCTGAAGACG AGGAGGGGGTTCAGGTTCATCGTGTTCAAGATCGACGACAAGGCCATGGAGATCAAGGTGGAGAGGCTCGGGCAGACTGCCGAGGGCTACGAGGACTTCGCCGCCACCCTCCCCGCCGACGAGTGCCGCTACGCCGTCTACGACCTCGACTTCG TCACCGACGAGAACTGCCAGAAGAGCAAGATCTTCTTCTTCTCCTGGTCGCCTGACACGGCGAGGACAAGGAGCAAG ATGCTGTACGCGAGCTCCAAGGACAGGTTCAGGAGGGAGCTGGACGGAATCCAGTGCGAGATTCAGGCCACAGACCC CAGCGAGATGAGCCTCGACATCATCAGAGCCAGAGCTCACTGA(SEQ ID NO 1)所編碼的水稻肌動蛋白解聚因子全長序列如下MANSASGLAVNDECKFKFQELKTRRGFRFIVFKIDDKAMEIKVERLGQTAEGYEDFAATLPADECRYAV YDLDFVTDENCQKSKIFFFSWSPDTARTRSKMLYASSKDRFRRELDGIQCEIQATDPSEMSLDIIRARAH(SEQID NO 2)然后根據(jù)SEQ ID NO :2，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件對水稻肌動蛋白解聚因子基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原表位的預(yù)測。本實施例中使用了 ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件提供的五種方法Mandard、 KarpIus> Emini> Amphiphi> Pellequer,以及這五禾中方法的綜合方法 cons_Sta_Kar_Emi_ Amp_Pel，所有參數(shù)選擇默認(rèn)。具體方法可以參考Odorico M, Pellequer J L. BEPITOPE predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins[J]. J Mol Recognit，2003，16(1) :20_22。一共預(yù)測得到了 12個候選的抗原表位，用BLASTP對水稻蛋白質(zhì)庫進(jìn)行唯一性檢測后選出目標(biāo)片段，其選出的多肽序列為CKFKFQELKTRRG。然后將上述片段在水稻蛋白質(zhì)庫(RAP-DB數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址:http://rapdb. dna. affrc. go. jp/)進(jìn)行唯一性檢索(蛋白序列比對)，確定了這個片段在水稻蛋白質(zhì)庫中的唯一性。實施例2 抗原表位1的化學(xué)合成對SEQ ID NO 3所示的多肽序列進(jìn)行化學(xué)合成(由吉爾生化公司合成)，得到肌動蛋白解聚因子的抗原表位1。實施例3 抗原表位I-KLH復(fù)合物的制備采用戊二醛連接法，將實施例2中合成的抗原表位1的N端與交聯(lián)載體蛋白-鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)交聯(lián)，得到抗原表位I-KLH復(fù)合物。具體實施步驟如下 將5mg合成多肽加入7mg KLH中，邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的3g/L戊二醛溶液 lml，室溫孵育池。以pH8. 5的硼酸緩沖液透析Mh，得到抗原表位I-KLH復(fù)合物。實施例4 多抗血清的制備取l_2mg實施例3中制備的抗原表位1-KLH復(fù)合物，免疫新西蘭大白兔，每隔14 天加強(qiáng)免疫一次 ’第2次加強(qiáng)免疫后7天，耳靜脈取血，分離血清(5000rpm離心IOmin)，收集上清，測效價。同時按照相同的步驟，用抗原表位1 (SEQ ID NO 3)作為對照。具體步驟如下取Ι-aiig實施例3中制備的抗原表位I-KLH復(fù)合物與等量的完全福氏佐劑充分乳化，形成油水包，于兔頸部和背部皮下多點注射，每點約100 μ g。2周后加強(qiáng)免疫，劑量同前，用不完全福氏佐劑充分乳化后，于兔背部皮下多點注射；以后隔2周加強(qiáng)免疫1次；從第2次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫7天后，經(jīng)耳靜脈取血測定抗體的效價。其中，耳靜脈取血進(jìn)行效價檢測(ELISA法)的步驟如下在96孔板上，每孔加入50μβ/πι1磷酸酪氨酸100μ 1，4°C過夜后，進(jìn)行包被，洗滌。 將兔抗磷酸酪氨酸免疫血清分別稀釋為1 100，1 500,1 2500,1 3200,1 12800，1 25600，每孔各加100μ 1，37°C保溫30min，洗滌。各加入1 100稀釋的羊抗兔Ig酶酶結(jié)合物 100μ 1，37°C保溫 30min，洗滌。加入 TMB100 μ 1，20min 后，加 2mol/l 的 H2S04 終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測定A490nm值，高于免疫前血清10倍的為陽性。上述結(jié)果已經(jīng)符合要求，遂于末次加強(qiáng)免疫7天后頸動脈放血，收集血樣。將收集的血樣在3-4°C下靜置3-4小時，然后5000rpm離心10分鐘，收集血清，得到多抗血清(耳靜脈檢測效價符合要求KLH > 25600，裸肽> 1觀00后，頸動脈取的血樣不必再檢測效價)。 無菌分裝保存于-80°C備用。實施例5 抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體(多抗)的制備將實施例5中制備的多抗血清進(jìn)行純化，制得多克隆抗體(多抗)。將抗原表位CKFKFQELKTRRG(SEQ ID NO 3)多肽與溴化氰活化的kpharose 4B偶聯(lián)，制備多肽親和層析柱。將制備的多抗血清加入到以上制備的層析柱中，放置于4°C孵育過夜后，洗脫抗體，即得到抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體(多抗)。實施例6 多抗針對肌動蛋白解聚因子的特異性檢驗選取水稻93-11不同發(fā)育階段和不同部位的組織，提取總蛋白質(zhì)，用Bradford法測定樣品水稻總蛋白含量，選取水稻不同發(fā)育階段和不同部位的組織，提取總蛋白質(zhì)，每個樣品上樣IOyg水稻總蛋白，利用制備的多克隆抗體檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，免疫印跡(Western blotting)可檢測到與預(yù)期分子量(16kDa)接近的條帶，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)存在二聚體和單聚體，所以目標(biāo)條帶是32kD和16Kd，與目標(biāo)蛋白質(zhì)16KD是兩倍和一倍的關(guān)系，后面通過實驗對此進(jìn)行了驗證。該蛋白質(zhì)在水稻的不同組織中都表達(dá)量的不同，可進(jìn)一步研究肌動蛋白在水稻中的動態(tài)平衡?？偟鞍踪|(zhì)樣品的制備用液氮研磨上述新鮮水稻組織至粉末狀，分裝到預(yù)冷離心管中，每300μ 1粉末加入800μ 1蛋白質(zhì)裂解液(62. 5mmol/L ρΗ7· 4 Tris .HCl，10%甘油， 2% SDS，20mmol/LNaF，2mmol/L EDTA，lmmol/L PMSF,5% β -巰基乙醇)，迅速混勻并置于冰上，冰水混合物中孵育10分鐘，約每2分鐘震蕩混勻1次。4°C，12000r/min離心15分鐘。取上清，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-70°C保存。得到水稻總蛋白。Western 印記將提取的上述水稻蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE (12% )，SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜。使用實施例7中制備的多抗1，以1 1000稀釋后室溫孵育 3 小時，TTBS(2mmol/LTris · HCl ρΗ7· 6，13. 6mmol/L NaCl，0· 1% Tween-20)洗膜 3 次， 每次5分鐘。之后加入以1 15000稀釋的兔源多抗(廠家貨號中杉觀2301)，室溫孵育 1小時，TTBS洗膜3次，每次5分鐘。加ECL Pluc顯色劑顯色，暗室曝光5分鐘。結(jié)果如圖 1所示，在PVDF膜上看到16kDa附近的一條特異性條帶，這與預(yù)測分子量(16kDa)幾乎完全一致。需要說明的是，盡管水稻全蛋白中可能有很多分子量與其相似的蛋白，但是與多抗特異性結(jié)合的就只有肌動蛋白解聚因子一個。關(guān)于特異性的預(yù)測SEQ ID N0:3經(jīng)過 http://rice. ρlantbiology· msu. edu/blast. shtml (與實施例 1 中的 http://rapdb. dna. affrc.go.jp/作用相同，目的是再次檢驗唯一性)的檢查，確定此多肽序列特異，該序列在水稻總蛋白中唯一確定肌動蛋白解聚因子。
此外，為了進(jìn)一步證明檢測到的兩條條帶的確是肌動蛋白解聚因子二聚體和肌動蛋白解聚因子，將上述9個表位分別提取的總蛋白進(jìn)行第二次SDS-PAGE電泳，得到SDS膠， 然后在上面選取與western blot上的目標(biāo)條帶(16kDa)對應(yīng)的條帶，用Trypsin酶消化后打質(zhì)譜，通過對一級質(zhì)譜圖(圖2、和二級質(zhì)譜圖(圖幻的聯(lián)合搜索，可以推測是肌動蛋白解聚因子，western blot的預(yù)測是通過實驗證實的。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種肌動蛋白解聚因子抗原表位，其由SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列組成。
2.一種組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的肌動蛋白解聚因子抗原表位，任選地，還含有用于免疫的佐劑。
3.—種肌動蛋白解聚因子抗原表位-載體復(fù)合物，其中，所述肌動蛋白解聚因子抗原表位為權(quán)利要求1所述的肌動蛋白解聚因子抗原表位，所述載體選自鑰孔戚血藍(lán)素、BSA、 以及酪蛋白。
4.一種抗肌動蛋白解聚因子抗體的制備方法，包括使用權(quán)利要求1的肌動蛋白解聚因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物的步驟；任選地，所述抗肌動蛋白解聚因子抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體；具體地，所述制備方法包括如下步驟1)將權(quán)利要求1所述的肌動蛋白解聚因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物免疫動物得到的血樣進(jìn)行離心，得到多抗血清；和2)純化步驟1)中的多抗血清，得到抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體。
5.一種多抗血清，其由權(quán)利要求1的肌動蛋白解聚因子抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物免疫動物制得。
6.一種抗肌動蛋白解聚因子抗體，其能夠特異地結(jié)合權(quán)利要求1所述的肌動蛋白解聚因子抗原表位，任選地，其為多克隆抗體或者單克隆抗體。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求6所述的抗肌動蛋白解聚因子抗體。
8.—種肌動蛋白解聚因子檢測劑，其包含權(quán)利要求6所述的抗肌動蛋白解聚因子抗體。
9.權(quán)利要求6所述的抗體在制備檢測肌動蛋白解聚因子的藥物中的用途。
10.一種檢測肌動蛋白解聚因子的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6所述的抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體的步驟；具體地，所述肌動蛋白解聚因子為水稻的肌動蛋白解聚因子。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及肌動蛋白解聚因子抗原表位、抗肌動蛋白解聚因子抗體及其用途。具體地，所述肌動蛋白解聚因子抗原表位具有SEQ ID NO3所示的序列。本發(fā)明還涉及一種抗肌動蛋白解聚因子多克隆抗體，所述多克隆抗體與上述抗原表位特異性結(jié)合。所述多克隆抗體具有高的特異性和效價。本發(fā)明還涉及所述多克隆抗體的制備方法和用途、含有該多克隆抗體的組合物、以及檢測肌動蛋白解聚因子的方法。
文檔編號C07K7/08GK102206253SQ20101052032
公開日2011年10月5日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者劉國振, 張利, 徐寧志, 林梁, 潘秦 申請人:深圳華大基因科技有限公司