專利名稱：棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編 碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物衰老是指一個器官或整個植物生命功能逐漸衰退的過程，是在自然死 亡前生理上的一系列衰退過程，是長期進(jìn)化和自然選擇的結(jié)果(李晴，朱玉賢，分子 植物育種，第1卷，第3期，2003年)。關(guān)于植物衰老的研究主要是集中在葉片衰老的 研究上。在葉片衰老過程中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化代謝以及基因表達(dá)調(diào)控等都發(fā)生很 多變化(G印stein S, Genome Biology, 5(3) 212，2004；Chandlee JM, Physiologia Plantarum, 113:1-8，2001; Nam HG, Trends Plant Sci, 8 (6) 272-277，2003)。關(guān)于葉片衰 老在生理學(xué)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已有不少報道(Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology, 6: 79—84，2003; Larry et al, Physiol Plant, 101: 746—753， 1997; Nam HG, Curr Opin Biotech, 8: 200-207, 1997; Smart CM, New Phyto1, 126: 419-448， 1994; Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58:115-36， 2007; Betania et al Trends Plant Sci，5(7) : 278-282. 2000)。NAC是高等植物中所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其命名來源于上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的 3個基因矮牽牛NAM基因、擬南芥ATAFl /2和CUC2基因(Aida M, et al, Plant Cell, 9 (6) 841 - 857,1997)。NAC轉(zhuǎn)錄因子最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是各成員的N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，整 個N端區(qū)域可劃分為5個亞結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E)，其中亞結(jié)構(gòu)域A、C、D高度保守，亞結(jié)構(gòu) 域C、D序列中含有核定位信號(nuclear localization signals, NLS)，可能與轉(zhuǎn)錄因子 核定位及啟動子上特定順式元件的識別有關(guān)(Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262 (6) 1047 - 1051，2000 ；Ooka H，et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。E 亞結(jié) 構(gòu)域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亞家族中高度保守(Ooka H, et al, DNA Res, 10 (6) 239 -247，2003)。C 端是轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)(transcrip tional activation regions, TARs)，具有高度的多樣性，該端的共同特點(diǎn)是一些氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷 氨酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率高。2003年，Ooka等通過全基因組分析，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)105個NAC 轉(zhuǎn)錄因子，在水稻中則發(fā)現(xiàn)75個NAC成員。通過比較NAC結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將它們分 成2個大族，3個亞族(0sNAC3，ATAF，NAM)。根據(jù)近幾年報道，NAC家族又被劃分為為5 個亞族(0sNAC3, ATAF, NAM, AtNAC3, NAP)。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物頂端分生組織及花器官分化(Sabl0WSki，et al，Cell, 92 (1) 93 - 103，1998)、側(cè)根形成(Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17 (11) 2993 - 3006，2005)、次生壁增厚(Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23) 3024 -3036，2000)等植物特定發(fā)育過程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53:383-397，2003)與非生物脅迫過程(Nogueira FT, Plant Science, 169: 93 - 106，2005)中均起著重要作用，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物衰老進(jìn)程也起著重要的調(diào)控作用(GU0 YF, GAN S, Plant Journal, 46(4): 601-612,2006)。研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生 長發(fā)育、器宮建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。相 較于MYB類、bZIP類及WRKY類的轉(zhuǎn)錄因子，NAC轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少。AtNAP是擬南芥NAC家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子。Guo等(GUO YF, GAN S, Plant Journal, 46(4): 601-612，2006)研究發(fā)現(xiàn)JiUP在調(diào)控擬南芥衰老過程中起著重要的作 用diU/M又在衰老葉片中表達(dá)，且JiU/7的表達(dá)量與葉片的衰老程度成正相關(guān)，變化趨勢 與衰老標(biāo)志基因幼似2相一致；擬南芥突變體a to即無論是在自然生長狀態(tài)下還是在黑暗 誘導(dǎo)狀態(tài)下均出現(xiàn)葉片衰老滯后表型；誘導(dǎo)似/7過表達(dá)時，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明顯的提前 衰老現(xiàn)象；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)水稻、四季豆的似P皆能異源互補(bǔ)擬南芥突變體atoa/7的滯綠表 型，說明NAP轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物衰老中起著重要的作用。棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，為人類提供衣著所必須的棉纖維。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展 與生活水平的提高，對棉纖維的需求量不斷提高，棉花產(chǎn)需缺口不斷擴(kuò)大。我們的耕地面積 十分有限，因而提高棉花單產(chǎn)成為解決棉花產(chǎn)需缺口的根本辦法。棉花每長成一個大鈴，需 要兩三片葉子進(jìn)行光合作用，制造營養(yǎng)，才能滿足生長需要。大田生產(chǎn)中，即便沒有病蟲危 害，且水肥供應(yīng)充足，棉花蕾鈴脫落率達(dá)6(Γ70%。棉花早衰是限制棉花產(chǎn)量的主要問題，解 決早衰是棉花高產(chǎn)育種的關(guān)鍵之一。以往對棉花衰老的研究多集中于植物生理學(xué)層面如激 素水平、清除活性氧酶等。棉花早衰主要是由棉花自身遺傳因素決定的生理生化作用引起 的，而從分子遺傳學(xué)角度研究和改造棉花早衰問題的研究還不多。本發(fā)明提供了一個與棉 花衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對于從分子遺傳學(xué)角度研究棉花衰老，以及通過遺傳工程改良棉 花的衰老特性都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種棉花衰老調(diào)控相關(guān)的NAP轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，來源于陸地棉(Gossypium hirsutum L.)，名稱為GhNAC7，是具有SEQ ID NO. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO. 2 的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO. 2的 氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID N0. 2衍生的蛋白質(zhì)。棉花GhNAC7轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，是下列核苷酸之一。1) SEQ ID NO. 1 所示的 DNA 序列。2)編碼SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中，SEQ ID NO. 1由861個堿基組成；SEQ ID N0. 2由286個氨基酸殘基組 成。本發(fā)明還包括所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還包括所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因的細(xì)胞系。本發(fā)明還包括所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因在棉花衰老調(diào)控分 子機(jī)制中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因在延緩植物衰老性
4狀改良中的應(yīng)用。


圖1為GhNAC7編碼序列全長擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖2為GhNAC7與其它植物衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹分析。圖3為GhNAC7與其它植物衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子序列同源性分析。圖4為黑暗處理4天時野生型擬南芥，atnap,互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株離體葉片表型。圖5為正常生長45天的狀態(tài)下野生型，atnap,互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的表型。
具體實施例方式實施例1、棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的獲得。1.1 RNA 提取
選用陸地棉作為材料，取自然衰老發(fā)生黃化的葉片材料約0. Igo液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移 到 1.5ml 離心管，加 ImlTRI
(invitrogen公司)，混勻后，室溫放置15分鐘，加0. 2ml氯仿異戊醇(24:1 )，劇烈搖動 15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小 心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分 鐘。溶解于適量的經(jīng)0. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。1. 2 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指 南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2μ g制備的總RNA，0. 5μ 1 RNase inhibitor，加 DEPC 處理過的去離子水至 8. 5 μ 1，2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室溫放置 lOmin，13000rpm 簡短離心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離 心5秒鐘，存放于_20°C待用
1. 3 RT-PCR擴(kuò)增GhNAC7編碼序列全長。根據(jù)必UC7基因序列，設(shè)計了兩條引物GhNAC7F(5，ATGGAAACAAAMCCAGCTCTGAC 3，)禾口 GhNAC7R (5' TTACTGAAATTGATACAGCATGGGA 3，) (SEQ ID NO. 3)作為 PCR 反應(yīng)的引 物。PCR反應(yīng)體系為50 μ 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s， 72°C延伸60s，循環(huán)38次。72°C充分延伸IOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 分離獲得一段約861bp的片斷?；厥詹⑶彝ㄟ^TA克隆至TAKARA pMD_19_T載體后，由上海 英駿公司測序，獲得GhNAC7編碼序列的全長。實施例2 棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7功能分析。2. 1序列比較分析
使用Genedoc軟件分析GhNAC7與其他物種的同源性。分析結(jié)果表明，GhNAC7不僅具 有NAC家族中保守的5個亞結(jié)構(gòu)域，而且E亞結(jié)構(gòu)域高度保守。擬南芥AtNAP、菜豆PvNAP、 大豆 GmNAP 的 GenBank 登錄號分別為NP_564966. 1，AAK84884. 1，AAY46121. 1。為了分析GhNAC7同其他物種衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NAP的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，用MEGA軟
5件建立了 GhNAC7同其他物種NAP的系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果表明GhNAC7同大豆GmNAP的親緣關(guān)系 最近。菜豆 (kidney bean),截形苜蓿(medicago), 大豆(soybean),擬南芥 (arabidopsis),
馬鈴薯野生種(nightshade)，楊樹(populus)，小麥(wheat)，水稻(rice)，番茄(tomato)， 矮牽牛(petunia)，馬鈴薯(potato)的NAP序列登錄號分別為AAK84884，AC140030_19. 1， AAY46121, NP_564966. 1，AAU90314, gwl. Χ.1066. 1，AAU08785, NP_912423, AAU43923, AAM34773, AAU12055。2. 2 GhNAC7 的功能分析。2. 2. 1互補(bǔ)擬南芥atoa/7植物表達(dá)載體構(gòu)建
以一對正反向引物NOS-F和N0S-R，以帶有NOS終止子的pCAMBIA1301載體為模板，將 231bp的NOS終止子PCR擴(kuò)增出來，加A后連入pMD19_T載體，測序驗證序列準(zhǔn)確無誤。再 用PstI和HindIII酶將NOS終止子片段酶切下來，亞克隆到雙元載體pPZP221的多克隆位 點(diǎn)中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，得到的工程載體命名為PPZP221-N0S。將GhNAC7的完整編碼區(qū)用分別添加了 EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)的引物Ghl-F和 Ghl-R通過PCR擴(kuò)增出來，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，連接到pBluescript II KS(+)克隆載體后測序驗證序列的正確性，得到的工程載體命名為pSK-GhNAC7。以一對正反向引物Gh2_F和Gh2_R擴(kuò)增Ji似/^基因ATG上游約2K的啟動子片段， 加A后連入pMD19-T載體，測序驗證。用SacI和EcoRI內(nèi)切酶將啟動子片段酶切下來，連 接到用相同酶酶切的pSK-GhNAC7載體上，得到pSK-pAtNAP-GhNAC7工程載體。用SacI 和 SalI 酶將 pSK_pAtNAP_GhNAC7 上的 VAtNAP·. \GhNAC7 片段酶 切下來，克隆到用相同的兩種酶同時酶切的PPZP221-N0S載體上，得到最終的 pPZP22l-P^#^-GhNAC7-N0S 互補(bǔ)載體。NOS-F 5' TCACTGCAGGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTT 3'
NOS-R 5' CTCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC 3' (SEQ ID N0. 4)
Ghl-F 5' GAGGAATTCATGGAAACAAAAACCAGCTCTGAC 3'
Ghl-R 5' GCGTCGACTTACTGAAATTGATACAGCATGGGA 3' (SEQ ID N0. 5)
Gh2-F 5' ACGAGCTCCGTCATCTCATCCTAATCCTCAT 3'
Gh2-R 5' GCGAATTCGATTTTCAGACAATTTAGAAAACAATC 3，(SEQ ID Ν0· 6)。2.2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。2. 2. 2. 1 LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
1)在含利福霉素40yg/ml，鏈霉素100yg/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C培養(yǎng) 48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福霉素40μ g/ml，鏈霉素100yg/ml的YEB液體培養(yǎng)基中28 °C培 養(yǎng)至 OD6tltl 0. 5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm，4°C10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7. 0洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體于3ml10%甘油中，分裝到1.5ml離心管中，每管40 μ 1。2. 2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1) 200ng質(zhì)粒DNA，W 40 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化 U 1. 8 KV2)電擊后添加800μ 1 SOC液體培養(yǎng)基，280C培養(yǎng)Ih ；
3)4000rpm，10分鐘收集菌體，懸浮于200μ1 SOC中，涂在含100 yg/ml壯觀霉素，利 福平40 μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)48h_72h。2. 2. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化。2. 2. 3. 1擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
權(quán)利要求
一種棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于是SEQ ID NO: 2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白質(zhì)。
2.棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO: 1所示的核苷酸序列，或者為編碼SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.含有如權(quán)利要求2所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因的表達(dá)載體。
4.含有如權(quán)利要求2所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因的細(xì)胞系。
5.如權(quán)利要求2所述棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的編碼基因在延緩植物葉片衰老 性狀改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的棉花衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，來源于陸地棉，名稱為GhNAC7,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。棉花衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1所示，或者為；編碼SEQIDNO.2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的基因可用于棉花抗衰老分子機(jī)制研究，并可用于延緩植物葉片衰老性狀改良，為今后通過基因工程延緩棉花葉片衰老從而提高棉花產(chǎn)量提供理論依據(jù)。
文檔編號C07K14/415GK101979408SQ20101052384
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者梁寧菁, 蒯本科, 邱凱, 魏強(qiáng) 申請人:復(fù)旦大學(xué)