專利名稱：一種微囊藻毒素的提取和純化方法
技術領域：
本發(fā)明方法涉及生化分離的技術領域，具體涉及一種微囊藻毒素的提取和純化方 法。本發(fā)明方法適用于從野外水華爆發(fā)時期的藍藻中提取兩種微囊藻毒素MC-RR和MC-LR， 并對其進行純化。
背景技術：
近十余年來，隨著水體污染和富營養(yǎng)化程度的加劇，我國淡水湖泊藍藻水華現(xiàn)象 越來越嚴重，其伴隨產生的毒素與人類健康的關系受到了越來越多的關注。其中微囊藻毒 素(microcystin，以下簡稱MC)是已發(fā)現(xiàn)的各種不同藍藻毒素中分布最廣、危害最為嚴重 的一類肝毒素，其通過強烈地抑制蛋白磷酸酶PPl和PP2A的活性而導致機體肝損傷。此類 毒素化學結構較穩(wěn)定，它能通過食物鏈給人體帶來潛在的危害。隨著對微囊藻毒素研究的廣泛開展，科研領域對微囊藻毒素的純標準樣品的需求 量越來越大。但受制于該毒素提取工藝耗時長、純品價格昂貴的問題，許多研究工作無法 深入開展。在這種背景下，研制開發(fā)微囊藻毒素純品成為亟需解決的問題。目前國內外從 微囊藻中提取純化微囊藻毒素的方法主要有采用薄層層析法進行分離(中國專利，一種微 囊藻毒素的提取純化方法，公開號CN1401660A，申請日2002. 9. 24)，該方法用乙酸溶液和 甲醇浸泡微囊藻，經除雜質、粗毒素的制備、毒素的分離、薄層層析技術等步驟提取和純化 微囊藻毒素，此方法存在薄層層析板僅能一次使用，成本較高且上樣量較低的缺點；衛(wèi)濤等 (微囊藻毒素的提取純化及制備方法研究.上海環(huán)境科學，27 (1)，2008)以天然水華藍藻為 原料，建立了以甲醇溶液提取、固相萃取和半制備色譜分離為主要步驟的微囊藻毒素提取、 純化和制備的方法。該方法雖價格相對較低且所制備的毒素純度較高，但在過柱時沒有充 分洗脫造成毒素大量損失。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種微囊藻毒素的提取和 純化方法，該方法以有毒的水華藍藻為原料，通過固相萃取和半制備色譜分離技術分離純 化兩種微囊藻毒素MC-RR和MC-LR，方法簡單，操作簡便，成本低廉。為達到上述目的，本發(fā)明方法的技術方案如下 一種微囊藻毒素的提取和純化方法，步驟依次如下 A、微囊藻毒素的提取
稱取藻粉，按30-40ml/g的比例加入60v/v%的甲醇溶解，8_20°C下200rpm搖床振蕩 lh，超聲促溶處理20min (功率無要求，溫度不超過30°C即可)，移入塑料離心管，20°C下 12000rpm，離心20min，傾出上清液；
然后，加60v/v%的甲醇重復提取一次；
合并兩次提取的上清液，用lmol/L硫酸調節(jié)上清液pH至4，靜置60min，移入離心管， 20°C下12000rpm，離心20min，傾出上清液，用稀氨水調節(jié)其pH至8 ；用旋轉蒸發(fā)儀，將上清液濃縮，即得粗提液；
B、微囊藻毒素的純化
將粗提液注入ODS柱，依次用20v/v%、30v/v%、40v/v%甲醇沖洗ODS柱； 用含有0. 02 v/v%TFA (三氟乙酸)的70 v/v%甲醇溶液洗脫，棄去洗脫液； 再用含有0. 02 v/v%TFA的70 v/v%甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，直至洗脫液無色； 將洗脫液旋轉蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)，用50v/v%甲醇溶解后在12000rpm下離心5min，上 清液為精提液；
C、微囊藻毒素MC-RR與MC-LR的分離
取精提液注入半制備色譜儀，約IOmin時收集MC-RR峰，約14min時收集MC-LR峰，分 別合并MC-RR、MC-LR洗脫液，移入圓底燒瓶，旋轉蒸發(fā)至干固，分別加入甲醇溶液溶解；
D、微囊藻毒素MC-RR與MC-LR的定量與保存
采用HPLC-UV測定步驟C所提取的微囊藻毒素的質量和純度。將步驟C最后獲得的MC-RR和MC-LR的甲醇溶液揮干溶劑，鋁箔包裹，_80°C保存。本發(fā)明方法與現(xiàn)有的微囊藻毒素提純方法相比，具有以下優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明方法的技術方案中，原料采用的自然環(huán)境水華發(fā)生時產生的藍藻，藻粉處理過 程簡單，原料成本可以忽略不計。操作過程中采用的操作相對簡單，藻粉的預處理對實驗人 員要求較低。ODS柱采用反相C18填料，可重復使用且對除雜效果的影響較低，增加了填料的利 用率，降低了成本，操作簡單并且分離的毒素的純度很高，ODS柱依次采用20v/v%，30v/v%， 40v/v%的甲醇溶液淋洗，70v/v%的甲醇溶液洗脫，此部分主要為色素，棄去。最后再用70v/ v%的甲醇溶液洗脫，能夠最大限度地洗脫微囊藻毒素，這樣可以收集到純度更高的MC-RR， MC-LR ；
采用半制備色譜儀更進一步純化了所提取的微囊藻毒素，采用HPLC定量測定所提取 的微囊藻毒素，純度均在97%以上，符合科研工作對毒素純度的要求。


圖1為實施例1中的MC-LR與MC-RR分離純化的半制備色譜圖； 圖2為實施例1中的MC-RR的HPLC-UV圖3為實施例1中的MC-LR的HPLC-UV圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明方法做進一步說明。本發(fā)明方法中用到的藻粉均為藍藻干粉，為2006年于云南滇池野外收集的水華 藍藻經干燥、粉碎后常溫保存，其外觀藍綠色或略帶黃綠色，氣味略帶藻腥味。實施例1
一種微囊藻毒素的提取和純化方法，操作步驟如下 1、稱取3. OOOg藻粉，放入250ml錐形瓶，加入90ml 60v/v%的甲醇溶解， 8°C下200rpm搖床振蕩Ih，再20°C超聲促溶處理20min后，移入4支40ml塑料離心管， 200C T 12000rpm，離心 20min ；
42、傾出上清液合并至200ml燒杯，步驟1中得到的4份沉淀共用50ml60v/v%甲醇浸 泡清洗，隨后將50ml清洗液全部移入原250ml錐形瓶中，8°C下200rpm搖床振蕩Ih，再20°C 超聲促溶處理20min后，移入2支40ml塑料離心管，在20°C下12000rpm離心20min，傾出 上清液合并于上述的200ml燒杯中；
3、用lmol/L硫酸調節(jié)上述6份合并的上清液至pH3.7，靜置60min(生成了大量絮狀 沉淀)后，移入離心管，20°C下12000rpm離心20min，傾出上清液于200ml燒杯，用稀氨水 (14wt%)調節(jié) pH 至 7. 8 ；
4、用旋轉蒸發(fā)儀，將步驟3最后得到的溶液濃縮至2(T30ml，加水至40ml，即得粗提
液；
(取100 μ L粗提液梯度稀釋10、100、1000倍，用HPLC測定稀釋粗提液中兩種微囊藻毒
素的含量)。MC-RR，MC-LR標準品購于日本和光純藥(Wako)公司。色譜柱5C18-AR-II，Type waters，4. 6*150mm，5 μ m ； 柱溫35. 0°C
流動相水(含0. 05v/v%TFA)和甲醇(含0. 05v/v%TFA)體積比1:1 ； 流速lml/min ；紫外-檢測器波長238nm ；進樣體積10 μ 1 ； 測得3. OOOg藻粉的粗提液中約含MC-RR 3. 09lmg, MC-LR 1. 945mg。5、每IOml粗提液注入一個ODS (5g C18粉填料，20mL VARIAN塑料管)柱，依次用 20v/v%甲醇30ml、30v/v%甲醇20ml、40v/v%甲醇IOml沖洗每個ODS柱；再用含有0. 02v/ v%TFA的70 v/v%甲醇溶液IOml洗脫，棄去洗脫液(這一步洗下的不是目標物)；然后用含 0. 02v/v%TFA的70 v/v%甲醇溶液30ml洗脫，收集洗脫液，直至洗脫液無色；
6、將步驟5中收集的洗脫液混合后，移入200ml圓底燒瓶，旋轉蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)；
7、加入1.5ml 50v/v%甲醇溶液清洗圓底燒瓶，溶解固形物后，用移液器移入離心管， 12000rpm離心5min，上清液為精提液；
8、取精提液200μ L，直接注入waters半制備色譜儀收集MC-RR和MC-LR峰(見圖1)， 收集完后，分別合并從半制備色譜儀上收集到的MC-RR、MC-LR洗脫液，移入圓底燒瓶，旋轉 蒸發(fā)至干固，均加入1. 5ml 50 ν/ν %甲醇溶解；
Waters半制備色譜儀的檢測條件 色譜柱300*7. 8mml. D C18 15 μ m 300A 檢測器波長238nm AUF 2. 000 柱溫35 °C 流動相甲醇相(含0. 05v/v%TFA的純甲醇) 水相(含0. 05v/v%TFA的純水)
時間(min)流速(ml/min)水相(ν/V % )甲醇相(0. 002. 90505018. 002. 90287218. 012. 90010025. 002. 90505029. 992. 90505030. 000. 0050509、分別取ΙΟΟμ L步驟8最后得到的MC-RR、MC-LR的甲醇溶液，梯度稀釋10、100、1000 倍，用HPLC-UV (方法同步驟4)測定稀釋液中微囊藻毒素的含量并計算純度； MC-RR，MC-LR標準品購于日本和光純藥(Wako)公司； 最后，通過色譜峰面積歸一化法計算得到的微囊藻毒素的純度， 所得MC-RR純度約98. 5%,質量約430 μ g (見圖2)； MC-LR純度約97. 7%，質量約150 μ g (見圖3)。10、將步驟8得到的MC-RR和MC-LR的甲醇溶液分別通過旋轉蒸發(fā)儀揮干溶劑后， 鋁箔包裹，-80°C保存。實施例2
一種微囊藻毒素的提取和純化方法，操作步驟如下
1、稱取3.OOg藻粉，放入250ml錐形瓶，加入100ml 60v/v%的甲醇溶解，15°C下200rpm 搖床振蕩Ih，再25°C超聲促溶處理20min后，移入4支40ml塑料離心管，20°C下12000rpm， 離心20min ；
2、傾出上清液合并至200ml燒杯，步驟1中得到的4份沉淀共用50ml60v/v%甲醇浸泡 清洗，隨后將50ml清洗液全部移入原250ml錐形瓶中，15°C下200rpm搖床振蕩lh，再25°C 超聲促溶處理20min后，移入2支40ml塑料離心管，在20°C下12000rpm離心20min，傾出 上清液合并于上述的200ml燒杯中；
3、用lmol/L硫酸調節(jié)上述6份合并的上清液至pH4. 1，靜置60min后，移入離心管， 20°C下12000rpm離心20min，傾出上清液于200ml燒杯，用稀氨水(14wt%)調節(jié)pH至8. 2 ；
4、用旋轉蒸發(fā)儀，將步驟3最后得到的溶液濃縮至2(T30ml，加水至40ml，即得粗提
液；
5、每IOml粗提液注入一個ODS(5g C18粉填料，20mL VARIAN塑料管)柱，每個ODS柱 依次用20v/v%甲醇30ml、30v/v%甲醇20ml、40v/v%甲醇IOml沖洗；再用含有0. 02v/ v%TFA的70v/v%甲醇溶液IOml洗脫，棄去洗脫液；然后用含0. 02v/v%TFA的70v/v%甲醇 溶液30ml洗脫，收集洗脫液，直至洗脫液無色；
6、將步驟5中收集的洗脫液混合后，移入200ml圓底燒瓶，旋轉蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)；
7、加入1.5ml 50v/v%甲醇溶液清洗圓底燒瓶，溶解固形物后，用移液器移入離心管， 12000rpm離心5min，上清液為精提液；
8、取精提液200μ L，注入waters半制備色譜儀(實驗條件同實施例1)，收集MC-RR和 MC-LR峰，收集完后，分別合并從半制備色譜儀上收集到的MC-RR、MC-LR洗脫液，移入圓底 燒瓶，旋轉蒸發(fā)至干固，均加入1. 5ml 50 ν/ν %甲醇溶解；
9、分別取IOOyL步驟8最后得到的甲醇溶解試樣，梯度稀釋10、100、1000倍，用 HPLC-UV測定稀釋液中微囊藻毒素的含量和純度；
色譜柱5C18-AR-II , Type waters ,4. 6*150mm , 5 μ m,
柱溫35. 0°C流動相水(含0. 05v/v%TFA)和甲醇(0. 05v/v%TFA)體積比1:1 ；
流速lml/min ；紫外-檢測器238nm液相進樣體積10 μ 1
通過色譜峰面積歸一化法計算得到的微囊藻毒素的純度；
MC-RR純度約98. 1%,質量約468 μ g ；
MC-LR純度約97. 3%，質量約160 μ g。
10、將步驟8得到的MC-RR和MC-LR的甲醇溶液分別通過旋轉蒸發(fā)儀揮干溶劑后， 鋁箔包裹，-80°C保存。實施例3
一種微囊藻毒素的提取和純化方法，操作步驟如下
1、稱取3.OOg藻粉，放入250ml錐形瓶，加入120ml 60v/v%的甲醇溶解，20°C下200rpm 搖床振蕩Ih，再30°C超聲促溶處理20min后，移入4支40ml塑料離心管，20°C下12000rpm， 離心20min ；
2、傾出上清液合并至200ml燒杯，步驟1中得到的4份沉淀共用50ml60v/v%甲醇浸泡 清洗，隨后將50ml清洗液全部移入原250ml錐形瓶中，20°C下200rpm搖床振蕩lh，再30°C 超聲促溶處理20min后，移入2支40ml塑料離心管，在20°C下12000rpm離心20min，傾出 上清液合并于上述的200ml燒杯中；
3、用lmol/L硫酸調節(jié)上述6份合并的上清液至pH4.0，靜置60min后，移入離心管， 20°C下12000rpm離心20min，傾出上清液于200ml燒杯，用稀氨水(14wt%)調節(jié)pH至8. 0 ；
4、用旋轉蒸發(fā)儀，將步驟3最后得到的溶液濃縮至2(T30ml，加水至40ml，即得粗提
液；
5、粗提液過ODS柱(5gC18粉填料，20mL VARIAN塑料管)，每10 ml粗提液對應一個 ODS柱，每個ODS柱依次用20v/v%甲醇30ml、30v/v%甲醇20ml、40v/v%甲醇IOml沖洗；用 含有0. 02v/v%TFA的70v/v%甲醇溶液IOml洗脫，棄去洗脫液；然后用含0. 02v/v%TFA的 70v/v%甲醇溶液30ml洗脫，收集洗脫液，直至洗脫液無色；
6、將步驟5中收集的洗脫液混合后，移入200ml圓底燒瓶，旋轉蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)；
7、加入1.5ml 50v/v%甲醇溶液清洗圓底燒瓶，溶解固形物后，用移液器移入離心管， 12000rpm離心5min，上清液為精提液；
8、取精提液200μ L，注入waters半制備色譜儀(實驗條件同實施例1)，收集MC-RR和 MC-LR峰，收集完后，分別合并從半制備色譜儀上收集到的MC-RR、MC-LR洗脫液，移入圓底 燒瓶，旋轉蒸發(fā)至干固，均加入1. 5ml 50 ν/ν %甲醇溶解；
9、分別取IOOyL步驟8最后得到的甲醇溶解試樣，梯度稀釋10、100、1000倍，用 HPLC-UV測定稀釋液中微囊藻毒素的含量和純度；
色譜柱:5C18-AR-II, Type waters, 4. 6*150mm,5ym, 柱溫35. 0°C
流動相水(含0. 05v/v%TFA)和甲醇(0. 05v/v%TFA)體積比為為1 1 流速0. 5ml/min ；紫外-檢測器238nm進樣體積:10μ 1 ； 通過色譜峰面積歸一化法計算得到的微囊藻毒素的純度； MC-RR純度約97. 1%,質量約457 μ g ； MC-LR純度約97. 3%，質量約173 μ g。10、將步驟8得到的MC-RR和MC-LR的甲醇溶液分別通過旋轉蒸發(fā)儀揮干溶劑后， 鋁箔包裹，-80°C保存。
權利要求
一種微囊藻毒素的提取和純化方法，步驟如下①、稱取藍藻藻粉，按30 40ml/g的比例加入60v/v%的甲醇溶解8 20℃下200rpm搖床振蕩1h，再超聲促溶處理20min后，移入離心管，離心使固液分離；②、傾出上清液，步驟①中得到的沉淀再用60v/v%的甲醇重復提取一次，合并兩次提取的上清液；③、調節(jié)步驟②得到的上清液的pH至4，靜置60min后，移入離心管，離心后，傾出上清液，調節(jié)上清液的pH至8；④、將步驟③最后得到的溶液濃縮，每3g藻粉得到40ml粗提液；⑤、每10ml粗提液注入一個ODS柱，每個ODS柱依次用20v/v%甲醇30ml、 30v/v%甲醇20ml、40v/v%甲醇10ml沖洗；再用含有0.02v/v%三氟乙酸的70v/v%甲醇溶液10ml洗脫，棄去洗脫液；然后用含0.02v/v%三氟乙酸的70v/v%甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，直至洗脫液無色；⑥、將步驟⑤中收集的洗脫液混合后，旋轉蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)；⑦、按每3g藻粉原料加入1.5ml 50v/v%甲醇溶液溶解步驟⑥得到的固形物，離心后的上清液為精提液；⑧、精提液注入waters半制備色譜儀，收集MC RR和MC LR峰，收集完后，分別合并從半制備色譜儀上收集到的MC RR和MC LR洗脫液，移入圓底燒瓶，旋轉蒸發(fā)至干固，均加入甲醇溶解；⑨、將步驟⑧得到的MC RR和MC LR的甲醇溶液分別揮干溶劑后，鋁箔包裹， 80℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微囊藻毒素的提取和純化方法，是一種以收獲于野外的水華藍藻的干粉為原料，從中提取高純度的微囊藻毒素MC-RR與MC-LR的方法，步驟如下A、甲醇粗提微囊藻毒素MC-RR與MC-LR；B、粗提液過ODS柱精提微囊藻毒素MC-RR與MC-LR；C、半制備色譜儀分離微囊藻毒素MC-RR與MC-LR；D、微囊藻毒素MC-RR與MC-LR保存。本發(fā)明方法原料來源廣，成本低，操作過程簡單，并且所提取出的微囊藻毒素的純度均在97%以上，符合科研工作對毒素純度的要求。
文檔編號C07K1/14GK101955517SQ20101052484
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2010年10月29日
發(fā)明者吳來燕, 國曉春, 張偉, 張大文, 戴明, 梁高道, 王文靜, 謝平 申請人:中國科學院水生生物研究所