專利名稱：核酸分子MIP3αANA6及其在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域。具體涉及一些能抑制人MIP3CI表達(dá)的核酸分子及其 在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前免疫排斥反應(yīng)是各種組織器官移植失敗的首要原因，免疫排斥通過樹突狀細(xì) 胞和效應(yīng)細(xì)胞起作用，應(yīng)用免疫抑制劑是其主要的治療方法，皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢素A和他可 莫司是較常用的藥物，是在免疫應(yīng)答反應(yīng)時發(fā)揮作用，只能針對效應(yīng)細(xì)胞起作用，因此雖有 一定的治療效果但卻效果不佳，對于高危患者，激素治療常常無效。同時與MIP3CI相關(guān)的 全身其它免疫性疾病銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、腎小管腎炎、克羅恩氏病和潰 瘍性結(jié)腸炎等的治療尚未找到特效藥。本研究設(shè)計并合成的核酸分子，能特異性地有效抑 制人MIP3ci基因表達(dá)，在免疫應(yīng)答啟動階段及效應(yīng)階段，針對樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞同時 起作用，以阻斷組織器官的免疫排斥反應(yīng)，并制備免疫抑制相關(guān)藥物，有效地治療與ΜΙΡ3 α 相關(guān)的全身其它免疫性疾病。核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6是參考GenBank數(shù)據(jù)庫人CCL20 mRNA (NM_004591)序列，利用美國 Ambion公司網(wǎng)站提供的 siRNA Target Finder (http:// www. Ambion. com/tehlib/misc/siRNA_finder hml)，根據(jù)RNAi設(shè)計原則設(shè)計，由北京賽百盛生 物試劑公司化學(xué)合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一些用于抑制人MIP3 α基因表達(dá)的核酸分子。本發(fā)明的另一個目的是提供了上述核酸分子的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供了一些用于抑制人ΜΙΡ3 α基因表達(dá)的核酸分子，它們具有 特異性抑制人MIP3CI的表達(dá)從而達(dá)到免疫抑制的作用，所述核酸分子為雙鏈核酸分子，其 DNA序列如下
正義鏈 Sl :5，-ATATATTGTGCGTCTCCTC-3，； 反義鏈 S2 :5’ -GAGGAGACGCACAATATAT-3，。上述核酸分子在本發(fā)明中被稱為ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6。其中A、T、G、和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶 核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6”指具有抑制人ΜΙΡ3 α基因表達(dá)，并且含 有與Sl或/和S2序列高度同源的核酸序列。該術(shù)語還包括與Sl或/和S2序列的同源性 至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括Sl或S2的核酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于) 若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地1-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以 及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為10個以內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，Sl或 S2后(3’端)加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。
3
在發(fā)明中，MIP3 α ΑΝΑ6的序列是Sl或/和S2。或者，在發(fā)明中，ΜΙΡ3αΑΝΑ6的序列包括Sl或/和S2。本發(fā)明還提供了一種重組載體，它含有序列中含有Sl和/或S2的核酸分子。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。例如，選用市售的載 體，然后將含有本發(fā)明ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6核酸序列中含有Sl和/或S2，可操作地連接于表達(dá)調(diào)控 區(qū)域序列，形成重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒及PSUPER等表達(dá)載體系統(tǒng)。慢病 毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，不僅具有感染分裂靶細(xì)胞并整合其基因組中，尤其具有感染多種 非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤 其是基因治療的研究。本發(fā)明中還提供了一種宿主細(xì)胞，它含有序列包括中含有Sl和/或S2的核酸分子。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”主要是真核哺乳動物細(xì)胞。常用的有293FT細(xì)胞， HaCaT細(xì)胞，HIEC細(xì)胞等。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核酸分子MIP3CIANA6的制備方法，即按照 MIP3 α ΑΝΑ6的序列，將各個核糖核酸分子依次脫水縮合。本發(fā)明的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的核 酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6序列通?？梢杂萌斯ず铣苫蛎附夥ǖ姆椒ǐ@得。本發(fā)明還提供了上述的核酸分子MIP3ciANA6在制備抑制人MIP3ci的表達(dá)的藥物 中的應(yīng)用以及在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。體內(nèi)和體外結(jié)果均驗證，本發(fā)明的ΜΙΡ3αΑΝΑ6可明顯削弱ΜΙΡ3α的表達(dá)。實(shí)驗 證明，ΜΙΡ3 α (GeneBank, ΝΜ_004591)通過趨化抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移以促使免疫 反應(yīng)的發(fā)生，因此，削弱ΜΙΡ3 α的表達(dá)就同時從免疫應(yīng)答的啟動階段和效應(yīng)階段發(fā)揮抑制 降低免疫反應(yīng)的作用。本發(fā)明的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6及其類似物，在治療給藥時，可有不同的效果。通 常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中。配制好的藥物 組合物可以通過包括(但并不限于)局部給藥、口服、皮下或皮內(nèi)的常規(guī)途徑進(jìn)行給藥。本發(fā)明中，所述的免疫抑制藥物是含有效治療量的核酸分子ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6和藥學(xué) 上可接受的載體介質(zhì)聯(lián)用。這類藥物組合含有治療有效劑量的化合物和藥學(xué)上可接受的賦 形劑或載體介質(zhì)。這類載體介質(zhì)包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其 組合。給藥方式應(yīng)與藥物制劑相匹配。本發(fā)明的核酸分子MIP3ciANA6可以被制成霜劑、緩 釋片、膠囊和針劑形式，其藥物組合物可通過常規(guī)或特定的方法進(jìn)行制備。藥物組合物如霜 劑、片劑、膠囊、針劑和溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量為lOng/cm2 10 μ g/ cm2 (局部外用)和1 μ g/kg 20mg/kg體重，是治療的有效量。此外，本發(fā)明的MIP3 α ΑΝΑ6 還可與其他治療劑一起使用。本發(fā)明中，所述藥物可以是霜劑、緩釋片、膠囊和針劑。本發(fā)明為全身其它免疫性疾病的治療和緩解提供了新的途徑和手段。


圖 1 為 GAPDH 的 RT-PCR 產(chǎn)物；圖2為MIP3 α的RT-PCR產(chǎn)物；其中圖1、圖2中的NI為對照組，1為濃度為IOnmol的 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6短發(fā)夾RNA，2為濃度為20nmol的MIP3 α ΑΝΑ6短發(fā)夾RNA，3為濃度為IOOnmol 的 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6 短發(fā)夾 RNA ；
圖3為慢病毒感染人角質(zhì)形成細(xì)胞熒光及可見光X 100 ； 圖4為ΜΙΡ3 α穩(wěn)定干擾細(xì)胞克隆熒光及可見光X 200 ； 圖5為人胚腎細(xì)胞熒光及可見光X 100 ；
圖6為HaCaT及各陽性細(xì)胞克隆的熒光定量PCR反應(yīng)曲線，其中A組為引物是GAPDH 的反應(yīng)擴(kuò)增曲線；B組為ΜΙΡ3 α穩(wěn)定干擾細(xì)胞克隆的CCL20反應(yīng)擴(kuò)增曲線C組為HaCaT 的CCL20反應(yīng)擴(kuò)增曲線；X軸表示PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，Y軸表示熒光信號的強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)染人角質(zhì)形成細(xì)胞抑制ΜΙΡ3 α mRNA的表達(dá)
1.選擇生長狀態(tài)良好的HaCaT細(xì)胞，按3.0 X IO4細(xì)胞/cm2接種于24孔板中，經(jīng)24 h 培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約60%-80%時用于轉(zhuǎn)染，用PBS緩沖液洗兩次，加900 μ L的新鮮無血清DK
培養(yǎng)基·
2.取4yLLipofectamine 2000 Reagent到無血清DK培養(yǎng)基中終體積為50 μ L，室 溫孵化5min，分別取濃度為20um的經(jīng)上海生物工程有限公司合成的短發(fā)夾RNA (shRNA) 結(jié)構(gòu)的核酸分子MIP3 α ΑΝΑ6正反義雙鏈(10 nmol/L -100 nmol/L)加入到50uL無血清DK 培養(yǎng)基中。將上述兩種溶液混合，室溫靜置20min后加入鋪有細(xì)胞的24孔板。3.于37°C及5%C02條件中培養(yǎng)6_8h后，將培養(yǎng)基改為含有終濃度均為lOOng/ml 的TNF- α和IL-I β的新鮮DK培養(yǎng)基繼續(xù)于37°C及5%C02條件中培養(yǎng)。4. 24h后，收集細(xì)胞RNA。紫外分光光度計檢測RNA濃度，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測RNA純度。5.分別取Iug的RNA行20uL體系的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再分別取2uL的逆轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn) 行PCR反應(yīng)，設(shè)置GAPDH為內(nèi)參，對MIP3 α mRNA進(jìn)行半定量。結(jié)論以人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)為對照，轉(zhuǎn)染了 MIP3 α ANA6_shRNA片段的 HaCaT細(xì)胞MIP3 α mRNA水平均有下調(diào)，其MIP3 α mRNA抑制率高達(dá)73. 4% 85. 3%。這種細(xì) 胞可作為制備具有抑制人MIP3 α的表達(dá)的皮膚的生物材料
實(shí)施例2 pSUPER-MIP3 α ΑΝΑ6對人胚腎細(xì)胞表達(dá)ΜΙΡ3 α的干擾效益 實(shí)驗步驟
1.標(biāo)準(zhǔn)6孔板中，將人胚腎細(xì)胞(293FT)每孔按3 X IO4細(xì)胞/cm2接種，培養(yǎng)24h后用 于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為60%-80%，用PBS緩沖液洗兩次，加1700 μ L的新鮮含10%小牛 血清的DMEM培養(yǎng)基；將4. 0 μ g質(zhì)粒DNA (含核酸分子MIP3 α ΑΝΑ6 DNA片段)加入150mM NaCl 中終體積為 150 μ L,另取 8 μ L jetPEI transfection reagent 到 150mM NaCl 中終 體積150 μ L，室溫孵化5min ；將上述兩種溶液混合，室溫靜置20min后加入鋪有細(xì)胞的6孔 板，于37°C及5%C02條件中培養(yǎng)。共轉(zhuǎn)染2孔細(xì)胞，設(shè)置3組重復(fù)實(shí)驗。并以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 的293細(xì)胞為對照組。2. 24h后倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，并去除原培養(yǎng)基，1孔中加入新鮮的含 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基2ml，另一孔中加入含100ug/ml的TNF- α和IL-1 β的總體積
5為2ml的含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)于37°C及5%C02條件中培養(yǎng)。3. 24h后收集細(xì)胞上清，用于MIP3aELISA實(shí)驗檢測ΜΙΡ3α蛋白表達(dá)的變化情況； 并提取細(xì)胞總RNA，行熒光定量PCR (以GAPDH為內(nèi)參)檢測ΜΙΡ3 a mRNA相對表達(dá)量的變 化情況。結(jié)論
A.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率達(dá)80%左右，熒光顯微鏡下可見大量表達(dá)GFP熒光的 293FT細(xì)胞。B.經(jīng)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞MIP3 a mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染細(xì) 胞顯著降低，抑制率約80%以上。C.經(jīng)MIP3a ELISA實(shí)驗檢測轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞MIP3 α蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn) 染細(xì)胞明顯下降，抑制率約75%以上。實(shí)施例3 MIP3 α穩(wěn)定干擾細(xì)胞克隆的體外效應(yīng) 實(shí)驗步驟
1.選擇生長狀態(tài)良好的人角質(zhì)形成細(xì)胞，按3.OXlO4細(xì)胞/cm2接種于24孔板中，經(jīng) 24 h培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約60%-80%時用于轉(zhuǎn)染，用PBS緩沖液洗兩次；
2.用含核酸分子MIP3aANA6DNA片段的慢病毒pHSER上清500 μ L及終濃度8mg/ L Ploybrene感染24孔板中人角質(zhì)形成細(xì)胞，于37°C及5%C02條件培養(yǎng)；48h后更換新鮮 RMPI1640 (10%CS),于37°C及5%C02條件培養(yǎng)。第6天觀察GFP (綠色熒光)熒光，計算轉(zhuǎn) 染效率。3.G418壓力培養(yǎng)5-8周后篩選出得到MIP3ci穩(wěn)定干擾細(xì)胞克隆，將陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。4.陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)于6孔板中，3. OX IO4細(xì)胞/cm2的密度，培養(yǎng)48h后加入細(xì) 胞因子濃度均為100 μ g/L的細(xì)胞因子TNF- a、IL-I β，培養(yǎng)24h后，收集RNA，用于MIP3 a 實(shí)時熒光定量PCR檢測。培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清，用于MIP3 a ELISA檢測和體外趨化朗 格漢斯細(xì)胞(LC)實(shí)驗。結(jié)論
A.慢病毒感染6 d后大量人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，陽性率達(dá)90.0%。B. G418壓力篩選出得到MIP3 α穩(wěn)定干擾細(xì)胞克隆表達(dá)較強(qiáng)的GFP熒光。C.經(jīng)熒光定量PCR檢測陽性細(xì)胞克隆的MIP3 a mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯 著降低，抑制率約77. 2% 81. 3%。D.經(jīng)MIP3a ELISA實(shí)驗檢測陽性細(xì)胞克隆的MIP3 α蛋白質(zhì)水平的變化較未轉(zhuǎn) 染細(xì)胞明顯降低，抑制率約70. 0% 90. 7%。E.實(shí)驗組陽性細(xì)胞克隆48h上清體外趨化2h后，趨化朗格漢斯細(xì)胞遷移到下室 的細(xì)胞數(shù)約為0. 3X 104，對照組則為2X104，表明核酸分子MIP3aANA6具有顯著下調(diào)趨化 朗格漢斯細(xì)胞遷移的效應(yīng)。與本申請有關(guān)的序列表
<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
<120> Title 核酸分子MIP3a ANA6及其在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用
<160> 2
6<210> 1
<211> Length:19
SequenceName :ΜΙΡ3 α ΑΝΑ6 <212> Type :DNA <213> OrganismName !Artificial <400> MIP3αANA6
5’ -ATATATTGTGCGTCTCCTC-3’19
<210> 2
<211> Length:19
SequenceName :MIP3 α ANA6 <212> Type :DNA <213> OrganismName !Artificial <400> MIP3αANA6
5’ -GAGGAGACGCACAATATAT-3'19
權(quán)利要求
具有特異性抑制人MIP3α的表達(dá)的核酸，為雙鏈核酸分子，其DNA序列如下 正義鏈S15’ ATATATTGTGCGTCTCCTC 3’；反義鏈S25’ GAGGAGACGCACAATATAT 3’。
2.—種核酸分子，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
3.—種重組載體pSUPER，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
4.一種重組載體pHSER，其特征在于，它的序列中含有Sl和/或S2。
5.一種細(xì)胞HaCaT，它的序列中含有Sl和/或S2。
6.權(quán)利要求1或2任一種核酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán)利要求1或2任一核 酸分子的序列，將各核糖核酸基團(tuán)或者脫氧核糖核酸基團(tuán)依次脫水縮合。
7 權(quán)利要求1或2所述的核酸分子在制備抑制人MIP3α的表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的核酸分子在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3或4所述的重組載體在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5所述的細(xì)胞在用于制備具有免疫抑制的生物材料中的應(yīng)用，所述生物 材料為人在皮膚。
全文摘要
本發(fā)明屬于反義核酸藥物領(lǐng)域，涉及MIP3αANA6及其在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用。機(jī)體的免疫應(yīng)答在自身免疫性疾病、組織器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本發(fā)明提供了一種用于制備免疫抑制藥物的反義核酸分子MIP3αANA6，為雙鏈核酸分子，其DNA序列的正義鏈為5′-ATATATTGTGCGTCTCCTC-3′，反義鏈為5′-GAGGAGACGCACAATATAT-3′。在加有炎性細(xì)胞因子的培養(yǎng)條件下，MIP3αANA6可以顯著減少多種細(xì)胞表達(dá)MIP3αmRNA和產(chǎn)生MIP3α蛋白質(zhì)，它通過阻止抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移發(fā)揮免疫抑制作用。本發(fā)明為治療MIP3α相關(guān)性免疫疾病提供了一種新的反義核酸藥物。
文檔編號C07H21/02GK101979561SQ201010525039
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者彭代智, 王麗華, 董征學(xué) 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院