專利名稱：一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。
背景技術(shù)：
水蛭素是由65個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，相對分子量為7000、等電點為3. 9、 可溶于水、生理鹽水及吡啶，不溶于乙醇、乙醚、丙酮及苯。因此，水蛭素的提取、分離和純 化，可按其物理和化學(xué)性質(zhì)以及一般蛋白質(zhì)純化的基本原理進(jìn)行。根據(jù)分子大小、溶解性、 吸附性、所帶電荷以及配基特殊親合力大小等特征，采用生理鹽水提取，乙醇分級沉淀和透 析法提取粗品、用凝膠色譜法、離子交換色譜法、高效液相層析、等電聚焦和親和層析法等 進(jìn)行精品的分離純化。天然水蛭素首先被發(fā)現(xiàn)于水蛭的唾液里，水蛭吸血時被分泌出來。以往觀點認(rèn)為， 水蛭的唾液腺才含水蛭素，事實上，水蛭素遍布水蛭全身各部分，只是水蛭素含量多少而已。國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)在采集原料時多采用剁掉水蛭頭部、或者人工外力擠壓水蛭，這兩 種方法均只側(cè)重于水蛭頭部的唾液腺分泌物，而忽略了其他部位分泌液。在提取抗凝血 物質(zhì)時主要采用生理鹽水提取，乙醇分級沉淀和透析法提取精制。所得產(chǎn)品的得率一般在 20%以下，抗凝活性維持在100AT-U/g左右，而且活性指標(biāo)不穩(wěn)定，也無法形成批量生產(chǎn)提 取，只能為少量臨床的應(yīng)用和實驗室提供一些研究數(shù)據(jù)。提取技術(shù)藝術(shù)的落后嚴(yán)重制約了 水蛭素在醫(yī)藥領(lǐng)域上的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。該方法 不需人工擠壓水蛭，既簡化了采集工序，又可反復(fù)多次采集活體水蛭分泌液的效果。最終水 蛭素得率在30%以上，活性單位在600AT-U/g至1000AT-U/g。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的一種從天然水蛭中提取抗凝活性水蛭素 的方法，該方法包括如下步驟1. 1將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩 種或多種物質(zhì)進(jìn)行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液，刺激液中各物質(zhì)的重量百分濃 度為0. 01 5%，其中酶濃度在100U 300U/ml。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭 重量比刺激液體積為1 1 5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液。分泌 液經(jīng)過16000 20000r/min離心分離，獲得水蛭素粗品。1. 2水蛭素粗品經(jīng)0. 2微米不銹鋼膜微濾，再經(jīng)10000 3000道爾頓分子量的有 機膜超濾，再進(jìn)行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為1 6 10加入藥 用淀粉調(diào)配，經(jīng)噴霧干燥，得水蛭素成品。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于1、采用所述刺激液，能夠刺激水蛭全身分泌大量分泌液，并且活體水蛭可多次刺激產(chǎn)分泌液，反復(fù)利用。該方法較之傳統(tǒng)的外力擠壓水蛭或者直接剁掉水蛭頭部方法，原料
利用率高。2、采用10萬道爾頓分子量的超濾柱進(jìn)行超濾法提取，使所獲得的水蛭素抗凝活 性單位在 600AT-U/g 至 1000AT-U/g。
具體實施例方式實施例1將5g氯化鈉、0. 3g 一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、5g賴氨酸、100U酶活量的中性蛋白 酶、150U酶活量的木瓜蛋白酶，充分溶解于IOOOmL去離子水中，配制成刺激液。將活體水蛭 稱重后置于容器中，按水蛭重量的1. 25倍加入所述刺激液，放置1小時刺激水蛭分泌分泌 液。刺激完畢后將活體水蛭撈出繼續(xù)飼養(yǎng)以便重復(fù)使用。分泌液依次經(jīng)過20000r/min離 心分離、10000道爾頓分子量的有機膜超濾、反滲透納濾濃縮，最后按固體比液體的重量體 積比為1 6 10加入藥用淀粉調(diào)配，經(jīng)過噴霧干燥，得水蛭素成品。實施例2將15g氯化鈉、0. 2g—水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、300U酶活量的木瓜蛋白酶，充分 溶解于IOOOmL去離子水中，配制成刺激液。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量的 1. 25倍加入所述刺激液，放置1小時刺激水蛭分泌分泌液。刺激完畢后將活體水蛭撈出繼 續(xù)飼養(yǎng)以便重復(fù)使用。分泌液依次經(jīng)過18000r/min離心分離、7000道爾頓分子量的有機膜 超濾、進(jìn)行反滲透納濾濃縮，最后按固體比液體的重量體積比為1 6 10加入藥用淀粉 調(diào)配，經(jīng)過噴霧干燥，得水蛭素成品。實施例3將25g氯化鈉、0. Ig—水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、0. 5g賴氨酸、250U酶活量的中性蛋 白酶，充分溶解于IOOOmL去離子水中，配制成刺激液。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水 蛭重量的1. 25倍加入所述刺激液，放置1小時刺激水蛭分泌分泌液。刺激完畢后將活體水 蛭撈出繼續(xù)飼養(yǎng)以便重復(fù)使用。分泌液依次經(jīng)過17000r/min離心分離、4000道爾頓分子量 的有機膜超濾、反滲透納濾濃縮，最后按固體比液體的重量體積比為1 6 10加入藥用 淀粉調(diào)配，經(jīng)過噴霧干燥，得水蛭素成品。
權(quán)利要求
一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1.1將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種物質(zhì)進(jìn)行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液，刺激液中各物質(zhì)的重量百分濃度為0.01～5％，其中酶濃度在100U～300U/ml，將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液體積為1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液，分泌液經(jīng)過16000～20000r/min離心分離，獲得水蛭素粗品。1.2水蛭素粗品經(jīng)0.2微米不銹鋼膜微濾，再經(jīng)10000～3000道爾頓分子量的有機膜超濾，再進(jìn)行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為1∶6～10加入藥用淀粉調(diào)配，經(jīng)噴霧干燥，得水蛭素成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從活體天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法，其特征在 于，所述天然水蛭為活體天然水蛭。
全文摘要
一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法，將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種物質(zhì)進(jìn)行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液，刺激液中各物質(zhì)的重量百分濃度為0.01～5％，其中酶濃度在100U～300U/ml。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液體積為1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液，分泌液經(jīng)過16000～20000r/min離心分離得水蛭素粗品，經(jīng)0.2微米不銹鋼膜微濾，再經(jīng)10000～3000道爾頓分子量的有機膜超濾，再進(jìn)行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為1∶6～10加入藥用淀粉調(diào)配，經(jīng)噴霧干燥，得水蛭素成品。最終水蛭素提取得率在30％以上，產(chǎn)品活性單位穩(wěn)定在600AT-U/g至1000AT-U/g。
文檔編號C07K1/34GK101974085SQ20101052668
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者蘇國強 申請人:南寧市金貝生物技術(shù)有限責(zé)任公司