專利名稱：抗伏馬菌素單鏈抗體的篩選及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗伏馬菌素單鏈抗體的篩選及應(yīng)用，與抗體篩選技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
伏馬菌素(Fumonisin)是上世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一種由串珠鐮刀菌(Fusarium verticillioides)和多育鐮刀菌(Fusarium proliferate)等真菌產(chǎn)生的水溶性霉菌毒素，是一類由不同多氫醇和丙三羧酸組成結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。1988年Gelderblom首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬菌素。隨后，Laurenf等在1989年又從伏馬菌素中分離出伏馬菌素Bl (FBI)和伏馬菌素B2 (FB2)。伏馬菌素是一組相關(guān)的極性代謝產(chǎn)物，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素有11種，分為A、B、C、P組，其中B組分布最廣，毒性最強(qiáng)。伏馬菌素Bl (英文簡稱FB1，下同)的產(chǎn)生菌串珠鐮刀菌(Fusarium verticillioides)和多育鐮刀菌(Fusarium proliferatum)等真菌為非專性、非宿主特異性的病原菌，能夠污染玉米、高粱、小麥、水稻和豆類等糧食作物及某些飼料，因而伏馬菌素的污染廣泛存在于糧食作物的籽粒或飼料中。研究表明，伏馬菌素能夠引起多種動(dòng)物疾病，如馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫等。在大鼠、兔和羔羊等許多動(dòng)物的急性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，伏馬菌素具有肝毒性和腎毒性。伏馬菌素的分子結(jié)構(gòu)類似于動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)鞘氨醇 (sphingosine, So)和二氫神經(jīng)鞘氨醇(sphinganine，Sa)等神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)，可通過抑制神經(jīng)鞘脂類的生物合成，導(dǎo)致動(dòng)物組織、血、尿中二氫神經(jīng)鞘氨醇/神經(jīng)鞘氨醇(Sa/So)比值升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞生長和分化，具有明顯的細(xì)胞毒性。伏馬菌素還具有生殖毒性、胚胎毒性、免疫毒性和大鼠致癌性。因而伏馬菌素的研究得到國際社會(huì)的廣泛關(guān)注， 成為繼黃曲霉毒素(Aflatoxin)之后新的研究熱點(diǎn)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Bl還可能是人類食管癌高發(fā)的誘因，在我國和南非部分食管癌高發(fā)地區(qū)玉米的FBl含量都高于低發(fā)區(qū)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency ofResearch Cancer, IARC)將伏馬菌素 Bl 列為 2B 類， 即可疑人類致癌物。另外，伏馬菌素不能在動(dòng)物體內(nèi)分解成無毒的物質(zhì)，能夠通過雞蛋、牛奶和動(dòng)物組織等食物在人體內(nèi)積累。因此，糧食和飼料作物中污染的伏馬菌素嚴(yán)重威脅著食品安全及人畜健康，美國、歐盟等許多國家已經(jīng)制定了伏馬菌素在食品和飼料及其制品中的限量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于FBl對(duì)食品安全的危害性，測(cè)定和調(diào)查其在玉米等糧食及其制品中的含量， 并對(duì)FBl污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估，規(guī)定食品和飼料中的限量標(biāo)準(zhǔn)，以保障人類的健康顯得尤為重要。目前，伏馬菌素的檢測(cè)分析方法包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MQ、液-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MQ和毛細(xì)管電泳法等，這些方法雖具較高的靈敏度和特異性，但需繁雜的提純凈化步驟和較貴重的儀器設(shè)備，不易推廣使用。而應(yīng)用ELISA等免疫學(xué)檢測(cè)方法，則具備簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，因而受到各國學(xué)者的重視。目前，國外報(bào)道的用于伏馬菌素免疫檢測(cè)的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和單鏈抗體，而國內(nèi)報(bào)道的都是通過雜交瘤融合細(xì)胞篩選得到的單克隆抗體。多克隆和單克隆抗體的制備都需要涉及動(dòng)物，而且多克隆抗體的特異性較差，單克隆抗體篩選需要專門的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，細(xì)胞保存需要專門的超低溫保存設(shè)備，生產(chǎn)過程耗時(shí)費(fèi)力，成本高。國外報(bào)道的有兩篇關(guān)于抗伏馬菌素單鏈抗體的制備的文獻(xiàn)，^iou等(1996)分別通過噬菌體展示篩選免疫抗體基因文庫和雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化獲得單鏈抗體(Zhou, H. R. ；Pestka, J. J. ；Hart, L. P. Molecular cloning andexpression of recombinant phage antibody against fumonisin Bi.J.Food Prot.1996,59, 1208-1212.)，但其免疫小鼠和篩選抗體所用抗原為偶聯(lián)的FBl-BSA和FB1-0A，與本發(fā)明所用抗原不相同，抗體篩選方法和過程差別較大，且文章中說明得到的單鏈抗體親和力較低，需要進(jìn)一步改善其親和力后才能夠用于伏馬菌素檢測(cè)；Lauer等Q005)通過噬菌體展示篩選抗體基因文庫得到抗FBl的單鏈抗體可用于伏馬菌素檢測(cè)(Lauer，B. ；Ottleben, I. ；Jacobsen, H, J. ；Reinard, T. Production of a single-chain variable fragment antibodyagainst fumonisin Bi. J. Agric. Food Chem. 2005，53，899—904.)，但其抗體基因來源為人工合成的抗體基因文庫，完全不同于本發(fā)明構(gòu)建的免疫抗體基因文庫。更重要的是，這兩篇國外報(bào)道的文獻(xiàn)雖獲得了抗伏馬菌素的單鏈抗體，但并未公布其核苷酸或氨基酸序列，而且國內(nèi)市場(chǎng)上也未有相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)品出售。因此，本發(fā)明通過構(gòu)建免疫抗體基因文庫，利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選獲得抗伏馬菌素單鏈抗體，可為檢測(cè)和調(diào)查糧食作物及其制品中伏馬菌素的污染情況提供可靠有效的檢測(cè)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在的缺陷和不足，利用噬菌體抗體庫技術(shù)獲得一種抗伏馬菌素單鏈抗體，用于鐮刀菌菌株本身產(chǎn)生的毒素以及糧食、飼料或食品中伏馬菌素污染的免疫檢測(cè)，為保障食品安全提供可靠有效的檢測(cè)手段。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的直接從偶聯(lián)的抗原FBl-KLH免疫的小鼠脾臟細(xì)胞出發(fā)，利用分子克隆方法和技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因文庫，再通過噬菌體展示技術(shù)篩選、表達(dá)ELISA 鑒定及序列測(cè)定，最后獲得一個(gè)高親和力的抗伏馬菌素單鏈抗體及其編碼基因，申請(qǐng)人將其命名為FB-Mu 1H3，該單鏈抗體基因可在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體由819個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體由272個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體主要由抗體重鏈可變區(qū)Vh、抗體輕鏈可變區(qū)\和連接肽組成，抗體重鏈可變區(qū)Vh和抗體輕鏈可變區(qū)\通過連接肽(Gly4 Ser)3連接共同完成伏馬菌素的識(shí)別和結(jié)合。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的重鏈可變區(qū)Vh由363個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3所示。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的重鏈可變區(qū)Vh由121個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 4所示。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的抗體輕鏈可變區(qū)\由327個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5所示。
本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的抗體輕鏈可變區(qū)\由109個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 6所示。本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體在大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)純化后可直接應(yīng)用于伏馬菌素的檢測(cè)，所述的應(yīng)用包括在檢測(cè)田間作物、飼料、糧食或食品伏馬菌素污染中的應(yīng)用，也可以作為在制備ELISA檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的有益效果之一是利用噬菌體抗體庫技術(shù)，構(gòu)建了抗伏馬菌素單鏈抗體基因文庫，通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得一個(gè)高親和力的抗伏馬菌素單鏈抗體及其編碼基因。2、本發(fā)明的有益效果之二是提供的單鏈抗體可用于在糧食作物的籽粒、飼料或食品中的因潛在的伏馬菌素污染的生物材料或產(chǎn)品的快速檢測(cè)。本發(fā)明所提供的抗伏馬菌素單鏈抗體通過重組大腸桿菌表達(dá)純化后可直接用于伏馬菌素的檢測(cè)。3、本發(fā)明的有益效果之三是提供的單鏈抗體生產(chǎn)成本低。目前國內(nèi)的報(bào)道主要集中于單克隆抗體的制備，但這需要使用動(dòng)物和專門的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，細(xì)胞保存需要專門的超低溫保存設(shè)備，生產(chǎn)過程費(fèi)用昂貴、耗時(shí)耗力。而本發(fā)明所提供的抗伏馬菌素單鏈抗體可在重組大腸桿菌中進(jìn)行大量可溶性表達(dá)，不需要貴重的儀器和繁鎖的操作，成本低，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。4、本發(fā)明的有益效果之四是提供的單鏈抗體基因易于通過基因工程操作，如堿基突變等改變基因特性，提高單鏈抗體的穩(wěn)定性或親和力。


SEQ ID NO 1是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的核苷酸序列，序列全長為819bp。SEQ ID NO :2是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體的氨基酸序列，由272個(gè)氨基酸組成。SEQ ID NO 3是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體重鏈可變區(qū)Vh的核苷酸序列，序列全長為36;3bp。SEQ ID NO :4是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體重鏈可變區(qū)Vh的氨基酸序列，由121 個(gè)氨基酸組成。SEQ ID NO 5是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體輕鏈可變區(qū)\的核苷酸序列，序列全長為327bp。SEQ ID NO :6是本發(fā)明的抗伏馬菌素單鏈抗體輕鏈可變區(qū)\的氨基酸序列，由109 個(gè)氨基酸組成。圖1 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 是本發(fā)明Vh和\片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Vhi =IgGl型重鏈可變區(qū)片段；VH2 :IgG2a/2b型重鏈可變區(qū)片段；V κ 鏈(輕鏈)可變區(qū)片段；V λ :λ鏈(輕鏈)可變區(qū)片段；CK:水對(duì)照。圖3 是本發(fā)明scFv片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；scFv 單鏈抗體片段。圖4 是本發(fā)明載體pHENHi結(jié)構(gòu)圖。
圖5 是本發(fā)明檢測(cè)抗體基因文庫陽性克隆率提取的質(zhì)粒DNA凝膠電泳圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 20 20個(gè)單克隆菌編號(hào)。圖6 是本發(fā)明檢測(cè)抗體基因文庫陽性克隆率PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 20 20個(gè)單克隆菌編號(hào)；PK 陽性對(duì)照；NK 陰性對(duì)照。圖7 是本發(fā)明檢測(cè)抗體基因文庫多樣性BstN I限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 20 20個(gè)單克隆菌編號(hào)；PK 陽性對(duì)照；NK 陰性對(duì)照。圖8 是本發(fā)明純化的FB-Mu 1H3單鏈抗體SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖。圖中M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 3 緩沖液B1、B2和B3洗脫液(雜蛋白)；泳道4 6:緩沖液Cl、C2和C3洗脫液(目的蛋白)。圖9 是本發(fā)明純化的FB-Mu 1H3單鏈抗體Western blot分析圖。圖中M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)泳道1 2 純化的FB-Mu 1H3單鏈抗體。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗原制備采用戊二醛一步偶聯(lián)法(Azcona-01 ivera，J. I. ；Abouzied, Μ. Μ. ；Plattner, R. D. ；Norred,ff. P. ；Pestka,J. J. Generation of antibodies reactive with fumonisins B1, B2, and B3 by using cholera toxin as the carrier-adjuvant. Appl. Environ. Microbiol. 1992，58,169-173.)將伏馬菌素FBI (購自Sigma公司)與鑰孔嘁藍(lán)蛋白(KLH， 購自 Sigma 公司)偶聯(lián)(KLH-NH2+0HC-(CH2)3-CH0+FBI-NH2 — KLH-N = HC-(CH2)3-CH = N-FB1)后作為免疫抗原(FBl-KLH)，將伏馬菌素FBl與小牛血清白蛋白(BSA，購自Sigma公司)偶聯(lián)(BSA-NH2+0HC-(CH2)3-CH0+FBI-NH2 — BSA-N = HC-(CH2)3-CH = N-FB1)后作為篩選抗原(FBl-BSA)。實(shí)施例2 動(dòng)物免疫用制備的抗原FBl-KLH免疫兩只BALB/c小鼠(中國科學(xué)院武漢病毒研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)4次，每次間隔10天。第一次取250 μ 1免疫抗原與等體積弗氏完全佐劑混合后免疫，后三次取250μ 1免疫抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合后免疫。第三次免疫后第5 天取血清從1 IO3倍比稀釋至1 U8X103，參照林巧愛、董海艷主編，《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，浙江大學(xué)出版社，2006年出版介紹的間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗體的水平。檢測(cè)結(jié)果顯示被免疫后的小鼠血清中都產(chǎn)生了較高的抗體滴度(稀釋度> 1 IO5)。實(shí)施例3 免疫小鼠脾臟RNA提取、mRNA純化及cDNA第一鏈合成1)對(duì)產(chǎn)生了較高抗體滴度的免疫小鼠再加強(qiáng)免疫一次，7天后取免疫小鼠的脾臟。2)利用TRNzol-A+總RNA提取試劑(購自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品， 按照該試劑的說明書操作)提取脾臟總RNA。3)用mRNA純化試劑盒(購自QIAGEN公司，按該試劑盒的說明書操作)對(duì)步驟2)提取的總RNA進(jìn)行純化。4)用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(購自hvitrogen公司，按照該酶的說明書操作)反轉(zhuǎn)錄步驟3)得到的純化mRNA，分別合成抗體重鏈(IgGjn IgG2a/2b)和輕鏈(κ鏈和 λ鏈)的可變區(qū)cDNA第一鏈。其中用表1所述的引物1反轉(zhuǎn)錄合成IgG1的可變區(qū) cDNA第一鏈，用表1所述的引物I^rimer 2反轉(zhuǎn)錄合成IgGw2b的可變區(qū)cDNA第一鏈，用表 1所述的引物I^rimer 3反轉(zhuǎn)錄合成κ鏈的可變區(qū)cDNA第一鏈，用表1所述的引物I^rimer 4反轉(zhuǎn)錄合成λ鏈的可變區(qū)cDNA第一鏈。實(shí)施例4 :PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(Vh)、輕鏈可變區(qū)(Vl)及單鏈抗體(scFv)基因1)PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)基因以實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄合成的IgG1或IgG2a/a的可變區(qū)cDNA為模板，利用表1所述的正向混合引物I^r imer5 14和反向混合引物I^r imer 15 18分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得I gGi 和IgG2^b的重鏈可變區(qū)片段(Vh)；以實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄合成的κ鏈可變區(qū)cDNA為模板，用表 1所述的正向混合引物I^rimer 19 23和反向混合引物I^rimer 25 27進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得κ鏈可變區(qū)片段(Vk)；以實(shí)施例3反轉(zhuǎn)錄合成的λ鏈可變區(qū)cDNA為模板，用表1所述的正向引物I^rimer M和反向引物I^rimer觀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得λ鏈可變區(qū)片段(Va)。 在 50 μ 1 PCR 反應(yīng)液中，含有 4 μ 1 cDNA, 5 μ 1 PCR 緩沖液(含 Mg2+)，8 μ 1 1. 25mM dNTPs, 2μ 1正向(混合)引物(10μΜ)，2μ 1反向(混合)引物(10 μ Μ)，2. 5U Taq聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C lmin, 55°C lmin, 72°C 80sec, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖2所示，Vh(Vhi和VH2)和八(Vk和Va)片段大小與預(yù)期相一致。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)分別純化步驟1)擴(kuò)增得到的Vh和\片段。3) SOE-PCR擴(kuò)增單鏈抗體(scFv)基因加入近等摩爾的VHdgG1和IgGw2b按摩爾比50 50混合)和VJVk和Va按摩爾比95 5混合)片段作為模板，用表1所述的正向混合引物I^rimer 5 14和反向混合引物I^rimer 25 28進(jìn)行SOE-PCR擴(kuò)增，獲得scFv基因。SOE-PCR分兩步反應(yīng)完成，第一步反應(yīng)在50 μ 1 PCR反應(yīng)液中，含有Vh和Vl片段各400ng，5 μ 1 PCR緩沖液(含Mg2+)，8 μ 1
1.25mM dNTPs, 2. 5U Taq聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min，55°C 2min，72°C 15min，7 個(gè)循環(huán)；第二步反應(yīng)在50 μ 1 PCR反應(yīng)液中，含有10 μ 1第一步反應(yīng)PCR產(chǎn)物，4 μ 1 PCR緩沖液 (含 Mg2+)，8y 1 1. 25mM dNTPs,2y 1 正向混合引物(10 μ Μ)，2 μ 1 反向混合引物(10 μ Μ),
2.5U Taq 聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C lmin, 55°C 80sec, 72°C 2min, 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，scFv片段大小與預(yù)期相一致。4)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)純化回收步驟3)獲得的scFv片段。實(shí)施例5 載體pHENHi及scFv片段酶切、連接1)分別用Sfi I和Not I限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作) 雙酶切載體PHENHi (德國弗朗霍夫分子生物與應(yīng)用生態(tài)學(xué)研究所贈(zèng)送)和實(shí)施例4得到的 scFv片段。
2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)純化步驟1)酶切后的PHENHi載體和scFv片段。3)用T4DNA連接酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)連接步驟2)回收的 pHENHi載體和scFv片段，得到酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv。4)參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法對(duì)步驟3)得到的酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv進(jìn)行乙醇沉淀除鹽。實(shí)施例6 單鏈抗體基因文庫構(gòu)建1)大腸桿菌XLl-Blue MRF，感受態(tài)細(xì)胞制備用無菌牙簽蘸取_80°C冰箱保存的大腸桿菌XLl-Blue MRF’株，在LB固體培養(yǎng)基 (成分(W/ν)胰蛋自胨，0. 5% (W/V)酵母提取物，(ff/V)NaCl,l. 5% (W/V)瓊脂，pH 7. 0)平板上劃線，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 后，挑取一單克隆菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基 (成分(W/ν)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母提取物，(W/V)NaCl, pH 7.0)中，37°C， 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。取1. 6ml菌液加入到160ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，230r/ min振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到0. 45左右時(shí)，取出培養(yǎng)菌的三角瓶置于冰上冷卻30min后，將菌液分裝于50ml離心管中，40C，4000r/min離心15min，棄上清，然后用30ml預(yù)冷的10% (WV) 甘油洗滌菌體沉淀兩次G°C，4000r/min離心15min后棄上清)。最后每個(gè)離心管中加入 100 μ 1預(yù)冷的GYT培養(yǎng)基(成分0. 25% (W/V)胰蛋白胨，0. 125% (W/V)酵母提取物，10% (V/V)甘油)懸浮菌體，分裝成10(^1/管，立即保存于-801冰箱。2)電轉(zhuǎn)化酶切連接產(chǎn)物將_80°C保存的大腸桿菌XLl-Blue MRF’感受態(tài)細(xì)胞取出，置冰上溶化后，每管感受態(tài)細(xì)胞(100 μ 1)中加入5 μ 1酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv，小心輕微地混勻后放冰上靜置 3min，然后將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯(0. 2mm)(購自BIO-RAD公司)中，用 BIO-RAD公司的MicroPulser 電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(設(shè)置BacteriaEd程序)。轉(zhuǎn)化后立即加入Iml SOC培養(yǎng)基(成分2% (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母提取物，0.05% (W/ V) NaCl，20mM葡萄糖，pH 7. 0)到電轉(zhuǎn)化杯中，并將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)Ih使細(xì)菌復(fù)蘇。3)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂布平板培養(yǎng)取出復(fù)蘇后的感受態(tài)細(xì)胞，取100 μ 1涂布于LB固體培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml氨芐青霉素(Amp))平板用于計(jì)算單克隆菌落數(shù)。其余的菌液通過6000r/min 離心Imin后吸取部分上清丟棄，每管保留約100 150 μ 1上清重懸菌體，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，lOOyg/mlAmp)平板。培養(yǎng)基平板放置于37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)12 1 至單克隆菌落長出。4)抗體基因文庫收集保存計(jì)算電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂布平板培養(yǎng)后長出的單克隆菌落數(shù)量，估算抗體基因文庫容量。收集LB固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，加入等體積50% (V/V)甘油保存于_80°C 冰箱。通過以上步驟操作，最后構(gòu)建的抗伏馬菌素單鏈抗體基因文庫容量約為 2X106cfu。實(shí)施例7 單鏈抗體基因文庫鑒定
1)從實(shí)施例6平板上長出的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑取20個(gè)單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基(含(W/ν)葡萄糖，lOOyg/ml Amp)中，37°C，220r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。2)參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的煮沸裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過0.8% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抗體基因文庫的陽性率。3)以步驟2)得到的質(zhì)粒DNA為模板，用表1所述的正向引物I^rimer四和反向引物I^rimer 30進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在25 μ 1 PCR反應(yīng)液中，含有50ng質(zhì)粒DNA，2. 5 μ 1 PCR緩沖液(含Mg2+)，2y 1 1. 25mM dNIPs，1 μ 1 正向引物(10 μ Μ)，1 μ 1 反向引物(10 μ Μ)，1. 25U Taq 聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5min ；94°C 50sec,48°C 90sec,72°C 90sec，;35 個(gè)循環(huán)； 最后72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物通過(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抗體基因文庫的陽性率。4)用BstN I限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司，按照該酶的說明書操作)酶切步驟 3)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物通過1.5% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抗體基因文庫的多樣性。鑒定結(jié)果如圖5 7所示，構(gòu)建的抗體基因文庫陽性率100%，多樣性高于85%。實(shí)施例8 噬菌體展示篩選單鏈抗體基因文庫1)取實(shí)施例6收集保存的菌液(抗體基因文庫)800 μ 1加入到50ml 2TY培養(yǎng)基 (成分1.6% (W/V)胰蛋白胨，(W/V)酵母提取物，0.5% (W/V)NaCl, pH 7.0)(含 (W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)中，37°C，230r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600 達(dá)到 0. 5。2)取5ml菌液于50ml離心管中，加入0. 5μ 1 Ml 3Κ07輔助噬菌體(購自Amersham Biosciences公司，參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，2003 年，第三版介紹的方法制備保存，其中噬菌體的量為大腸桿菌的20倍)，混勻后于37°C水浴靜置30min。3) 4000r/min離心lOmin，去上清，然后重懸于140ml 2TY培養(yǎng)基中(含100 μ g/ml Amp, 25 μ g/ml卡那霉素(Kan))，30°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)至少15h。4)將過夜培養(yǎng)的菌液分裝于50ml離心管中，4°C，4000r/min離心30min。5)取上清，加入 1/5 體積的 PEG/NaCl 溶液 QO% (W/V)聚乙二醇(PEG) 6000, 2. 5M NaCl)，充分混勻后置冰上沉淀lh。6)4°C,8000r/min離心30min，去上清，將沉淀重懸于40ml滅菌水中，并立即加入 1/5體積的PEG/NaCl溶液，充分混勻后4°C放置20min。7)4°C,4000r/min 離心 30min，去上清。8)輕微離心，去除殘留的PEG/NaCl溶液。9)加入1. 6ml滅菌水重懸沉淀，并4°C，4000r/min離心lOmin，取上清于4°C保存 (取10 μ 1采用10_2 10—11梯度稀釋來測(cè)定滴度)。10)用抗原 FBl-BSA (20ng/ μ 1)包被 ELISA 板(共 20 孔，每孔 100 μ 1)，37°C水浴 2h。11)用磷酸鹽緩沖液(PBS) (137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 7. 2 7. 4)洗滌3次。12)每孔加入150 μ 1封閉液(含3% (W/V)BSA的PBS溶液)，37°C水浴封閉2h (用封閉液封閉一空白孔作為陰性對(duì)照)。
10)用200 μ 1 PBS分別洗滌3次，每次3min。11)每孔中加入100 μ 1取步驟9)保存的上清(噬菌體)，37°C水浴濁。12)用 200 μ 1 PBST (含 0. 1 % (V/V) Tween 20 的 PBS)和 PBS 分別洗滌 5 次，每次 3min (第二輪和第三輪淘選時(shí)增加洗滌次數(shù)至10次和15次)。13)每孔加入100 μ 1三乙胺溶液(IOOmM)，室溫放置lOmin。14)立即加入50 μ 1 Tris-HCl溶液(ΙΜ,ρΗ 7. 4)中和，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。15)取6ml在37°C，230r/min振蕩培養(yǎng)條件下生長到OD6tltl為0. 5 0. 9的大腸桿菌XLl-Blue MRF，加入到50ml離心管中，37°C水浴侵染30min。16)4000r/min 離心 lOmin，去上清。17)加入800 μ 1 LB培養(yǎng)基重懸菌體后涂布于TYE固體培養(yǎng)基(成分1 % (W/V) 胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母提取物，0.8% (W/V)NaCl,1.5% (W/V)瓊脂，pH 7.0)平板上 (涂板時(shí)采用10_2 10_6梯度稀釋來測(cè)定滴度)，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)12 1 至菌落長
出ο18)收集TYE固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，進(jìn)行下一輪淘選或加入等體積50% (V/V)甘油保存于-80°c冰箱。實(shí)施例9 小量表達(dá)ELISA鑒定淘選抗體庫1)實(shí)施例8完成三輪淘選后，用滅菌牙簽從TYE固體培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取48個(gè)單克隆菌接種到裝有180 μ 1 2ΤΥ培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)的96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板于37°C，150r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。2)從每孔中取20 μ 1菌液加入到新的裝有180 μ 1 2ΤΥ培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，ΙΟΟμ g/ml Amp)的96孔培養(yǎng)板中，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng)6h。3)4°C，1800r/min 離心 lOmin，棄上清。4)加入180 μ 1新的2ΤΥ培養(yǎng)基(含100 μ g/ml Amp和ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG))至培養(yǎng)板中，25°C，150r/min振蕩過夜誘導(dǎo)表達(dá)12 16h。5)4°C，1800r/min離心lOmin，每孔中取100 μ 1上清用于伏馬菌素ELISA鑒定。6)在 ELISA 板孔中加入 100 μ 1 FB1-BSA (lng/μ 1)，37°C水浴包被 2h。7)用 200 μ 1 PBS 洗滌 3 次。8)用FBl-BSA包被的孔及其對(duì)照孔中分別加入150 μ 1封閉液(含3% (ff/V)BSA 的PBS溶液)，于37 °C水浴封閉池。9)用200 μ 1 PBS分別洗滌3次，每次3min。10)用FBl-BSA包被的孔及對(duì)照孔中分別加入50 μ 1步驟5)收集的上清，并加入 50 μ 1封閉液，37°C反應(yīng)濁。11)用 200μ1 PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次!3min。12)每孔加入ΙΟΟμ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反應(yīng)1.證。13)用 200 μ 1 PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 3min。14)每孔加入ΙΟΟμ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，37°C反應(yīng)1.證。15)用 200 μ 1 PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 3min。
16)每孔加入100 μ 1顯色液(0. 1 % (W/V)對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液)，黑暗條件下反應(yīng)15 30min。17)每孔加入50 μ 1 NaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD4tl5讀值。小量表達(dá)ELISA鑒定結(jié)果顯示，48個(gè)單克隆樣品中有45個(gè)顯色，樣品OD4tl5值與陰性對(duì)照OD4tl5值之比Ρ/Ν值最高達(dá)到35. 4，說明篩選得到了對(duì)伏馬菌素親和力高的單鏈抗體。選取其中16個(gè)OD4tl5讀值較高的單克隆培養(yǎng)菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示16個(gè)單克隆菌中所含的單鏈抗體基因完全相同，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，并將該單鏈抗體命名為 FB-Mu 1Η3。含有該基因的大腸桿菌命名為重組大腸桿菌XLl-BlueMRF，/pHENHi-lH3，單克隆培養(yǎng)菌液加等體積50% (V/V)甘油保存于_80°C冰箱。實(shí)施例10 重組大腸桿菌大量表達(dá)單鏈抗體FB-Mu 1H3及抗體回收1)取5μ 1甘油保存的重組大腸桿菌XLl-Blue MRF，/pHENHi-lH3接種于20ml 2TY 培養(yǎng)基(含(W/ν)葡萄糖，lOOyg/ml Amp)中，37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)12h。2)取8ml過夜培養(yǎng)菌液加入160ml 2TY培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0. 5左右。3)加入終濃度為ImM的IPTG，置于30°C，200r/min誘導(dǎo)表達(dá)8h。4)取培養(yǎng)菌液分裝到50ml離心管中，4°C，3000g離心lOmin。5)每管中加入 500 μ 1 PPB 溶液(30mM Tris-HCl,20% (W/V)蔗糖，pH 8. 0)重懸菌體，再加入ι μ 1乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(終濃度ImM)，冰上放置15min，棄上清。6)4°C，3000g離心15min，上清裝入另一離心管中。7)每管中加入1ml MgCl2溶液(終濃度5mM)，再加入2 μ 1 EDTA溶液(終濃度 ImM)，冰上放置15min。8)4°C，3000g離心15min，上清與步驟6)上清合并。9)取收集步驟6)和8)上清的離心管于4°C，12000r/min離心15min。10)取上清用PBS透析。 實(shí)施例11 用Ni-NAT柱純化大量表達(dá)的單鏈抗體FB-Mu 1H31)安裝純化柱(購自BIO-RAD公司)，加入400 μ 1充分混勻的基質(zhì)(購自QIAGEN 公司)，使其固定池以上。2)剪去下端封口，使液體流下，用5ml PBS進(jìn)行平衡。3)加入實(shí)施例2回收的單鏈抗體樣品過柱，收集保存過柱后的樣品流出液。4)加Iml緩沖液B (50mMNa2 HPO4, 20mM咪唑)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為B1、B2、B3(雜蛋白)。5)加400 μ 1緩沖液C(50mM Na2HPO4, 250mM咪唑)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為C1、C2、C3(目的蛋白)。6)加5ml PBS平衡純化柱，加入Iml 30% (V/V)酒精4°C保存純化柱。7)目的蛋白(單鏈抗體)通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)后用PBS透析。實(shí)施例12 =SDS-PAGE電泳檢測(cè)和^festern blot分析表達(dá)純化的單鏈抗體FB-Mu 1H3DSDS-PAGE電泳檢測(cè)取IOyL實(shí)施例11純化的單鏈抗體FB-Mu 1H3，加入2. 5μ L 5Χ 十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液(250mM Tris-HCl (pH 6. 8),10% (ff/V) SDS (電泳級(jí))，0. 5% (W/V)溴酚藍(lán)，50% (V/V)甘油，5% (W/V) β -巰基乙醇)，充分混勻， 水浴煮沸5min，然后置于冰上備用。參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》， 科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法制備分離膠和濃縮膠，加入IXTris-甘氨酸電泳緩沖液05mM Tris，250mM甘氨酸，0. 1% (W/V) SDQ，取放置在冰上的樣品上樣，先用80伏電壓電泳20min，再用120伏電壓電泳80 120min至溴酚藍(lán)跑至分離膠外。取下凝膠，去掉濃縮膠后用染色液(0. 1% (W/V)考馬斯亮藍(lán)R-250，25% (V/V)異丙醇，10% (V/V)冰醋酸)染色30min，然后用脫色液(5% (V/V)甲醇，7.5% (V/V)冰醋酸)脫色3 5次，即可觀察照相，結(jié)果如圖8所示，可見約^kD和30kD大小的兩條目的蛋白，出現(xiàn)兩條大小不同的目的蛋白條帶可能是表達(dá)抗體的不同構(gòu)象造成的。2) Western blot分析按SDS-PAGE檢測(cè)所述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳后的凝膠不經(jīng)染色液染色，直接用BIO-RAD公司Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell半干轉(zhuǎn)印裝置將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，于200mA恒定電流轉(zhuǎn)膜25min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將尼龍膜轉(zhuǎn)移到含有封閉液(5% (W/V)脫脂奶粉，20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl)的雜交盒中，室溫平緩搖動(dòng)15 20min后放置37°C 2h或4°C過夜。然后倒掉封閉液，加入IOml TBST (20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl，0· 1% (V/V) Tween20)洗滌 3 次，每次 5min。再加入IOml經(jīng)TBST稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技 (北京)有限公司)，室溫平緩搖動(dòng)池后倒掉，用IOml TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。 再加入IOml經(jīng)TBST緩沖液稀釋(體積比為1 5000)的AP標(biāo)記羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，室溫平緩搖動(dòng)2h后倒掉，用IOml TBST和TBS (20mM Tris-HCl (pH 8. 0)， 150mM NaCl)分別洗滌5次，每次5min。最后用BCIP/NBT顯色試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司，按照試劑盒說明書操作)顯色10 20min后，用蒸餾水終止反應(yīng)，即可觀察并照相。結(jié)果如圖9所示，在約33kD和36kD大小處出現(xiàn)特異性條帶，表明表達(dá)的抗體完整性較好，能夠在重組大腸桿菌中正常表達(dá)。特異條帶大小與SDS-PAGE電泳條帶大小不一致，可能是由于預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)因與染料共價(jià)偶聯(lián)而在SDS-PAGE電泳時(shí)的遷移特性發(fā)生某些改變的緣故而造成的。實(shí)施例13 純化的單鏈抗體FB-Mu 1H3用于伏馬菌素檢測(cè)1)在 ELISA 板孔中加入 100 μ 1 FB1-BSA (2. 5ng/μ 1)，37°C水浴包被 2h。2)用 200 μ 1 PBS 洗滌 3 次。3)用FBl-BSA包被的孔及其對(duì)照孔中分別加入150 μ 1封閉液(3% (ff/V)BSA溶液)，37°C水浴封閉濁。4)用 200 μ 1 PBS 洗滌 3 次，每次 3min。5)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋的實(shí)施例11純化的單鏈抗體FB-Mu 1Η3 (200 500nM)，37°C 反應(yīng) 2h。6)用200 μ 1 PBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。7)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反應(yīng)1.證。8)用200 μ 1 PBST和PBS分別洗滌3次，每次3min。9)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的AP標(biāo)記的羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，37°C反應(yīng)1.釙。10)用 200 μ 1 PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 3min。11)每孔加入100 μ 1顯色液(0. 1 % (W/V)對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液)，黑暗條件下反應(yīng)15 30min。12)每孔加入50 μ 1 NaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)OD4tl5讀值。加入顯色液顯色30min后，樣品OD4tl5值與陰性對(duì)照OD4tl5值之比P/N = 24. 5，說明重組大腸桿菌大量表達(dá)純化的單鏈抗體FB-Mu 1H3對(duì)伏馬菌素仍有很高的親和力。表IcDNA第一鏈合成及PCR擴(kuò)增所用引物序列表
權(quán)利要求
1.一種抗伏馬菌素單鏈抗體，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.一種抗伏馬菌素單鏈抗體，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗伏馬菌素單鏈抗體，其特征在于，所述的抗伏馬菌素單鏈抗體主要由抗體重鏈可變區(qū)Vh，抗體輕鏈可變區(qū)\和連接肽組成，所述的抗體重鏈可變 EVh和抗體輕鏈可變區(qū)\通過連接肽(Gly4 Ser)3連接共同完成伏馬菌素的識(shí)別和結(jié)合，其中所述的抗體重鏈可變區(qū)Vh由363個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3 所示；所述的抗體重鏈可變區(qū)Vh由121個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 4 所示；所述的抗體輕鏈可變區(qū)&由327個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5 所示；所述的抗體輕鏈可變區(qū)\由109個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 6 所示。
4.權(quán)利要求1所述的抗伏馬菌素單鏈抗體在制備伏馬菌素檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中包括ELISA試劑盒。
6.權(quán)利要求1所述的抗伏馬菌素單鏈抗體在檢測(cè)田間作物、飼料、糧食或食品伏馬菌素中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的抗伏馬菌素單鏈抗體在制備伏馬菌素檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中包括ELISA試劑盒。
9.權(quán)利要求2所述的抗伏馬菌素單鏈抗體在檢測(cè)田間作物、飼料、糧食或食品伏馬菌素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗伏馬菌素單鏈抗體的篩選及其在伏馬菌素免疫學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用。直接從偶聯(lián)的抗原FB1-KLH免疫的小鼠脾臟細(xì)胞出發(fā)，利用分子克隆方法和技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因文庫，再通過噬菌體展示技術(shù)篩選、表達(dá)ELISA鑒定及序列測(cè)定，最后獲得一個(gè)高親和力的抗伏馬菌素單鏈抗體及其編碼基因，命名為FB-Mu 1H3。該單鏈抗體在大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)純化后可直接應(yīng)用于伏馬菌素的檢測(cè)，包括在檢測(cè)田間作物、飼料、糧食或食品伏馬菌素污染中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/14GK102453093SQ20101052711
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者廖玉才, 張靜柏, 李和平, 胡祖權(quán) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)