專利名稱：使用TGF-β的基因治療的制作方法
使用TGF-β的基因治療本申請是2000年5月3日提交的CN 00807074. 1，題為“使用TGF-β的基因治療” 的分案申請。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的至少一種基因引入至少一種哺 乳動物結(jié)締組織中，用于哺乳動物宿主中結(jié)締組織再生的方法。本發(fā)明還涉及一種結(jié)締組 織細(xì)胞系，它攜帶一種DNA載體分子，該載體含有編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的基因。2.相關(guān)領(lǐng)域的簡述在矯形外科領(lǐng)域，變性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎是最常見的伴有軟骨損傷的疾病。幾乎 機體的每個關(guān)節(jié)，如膝、髖、肩、甚至是腕都會患。該疾病的發(fā)病機理是透明關(guān)節(jié)軟骨的變性 (Mankin等，J.Bone Joint Surg, 52A =460-466,1982) 關(guān)節(jié)的透明軟骨變形、形成原纖維， 最終凹陷。如果變性的軟骨能以某種方式再生，大多數(shù)病人將能重新享受生活，而沒有令人 虛弱的疼痛。迄今尚未報道過能再生損傷透明軟骨的方法。藥物遞送的傳統(tǒng)途徑(如口服、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥)對于將藥物攜帶到關(guān)節(jié)是 無效的。關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的半衰期通常較短。關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物的另一個缺點是需要頻繁重 復(fù)注射，以在關(guān)節(jié)腔獲得可接受的藥物水平，用于治療慢性病如關(guān)節(jié)炎。因為迄今的治療藥 物不能選擇性的靶向關(guān)節(jié)，必需使哺乳動物宿主接觸全身性高濃度的藥物，來實現(xiàn)持續(xù)的、 關(guān)節(jié)內(nèi)治療劑量。而非靶器官接觸高濃度的藥物加重了抗關(guān)節(jié)炎藥物產(chǎn)生嚴(yán)重副作用(如 哺乳動物宿主的胃腸道不適、和血液學(xué)、心血管、肝腎系統(tǒng)的變化)的傾向。在矯形外科領(lǐng)域，已考慮將一些細(xì)胞因子作為治療矯形外科疾病的候選藥物。認(rèn) 為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)是骨形成的有效刺激劑(Ozkaynak等，EMBO J，9 =2085-2093,1990 ； Sampath和 Rueger,Complication in Ortho，101-107，1994)，并已報道TGF-β 可作為骨發(fā) 生和軟骨形成的刺激劑(Joyce 等，J Cell Biology, 110 =2195-2207,1990) 0認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子- β (TGF- β )是一種多功能細(xì)胞因子(Sporn和Roberts， Nature (London)，332 =217-219,1988)，并在細(xì)胞生長、分化和胞外基質(zhì)蛋白合成中起調(diào)節(jié) 作用(Madri 等，J Cell Biology, 106 1375-1384，1988)。TGF-β 在體外抑制表皮細(xì)胞和 成骨樣細(xì)胞的生長(Chenu等，Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988)，但它在體內(nèi)刺 激軟骨內(nèi)骨化和最終形成骨(Critchlow 等，Bone，521-527，1995 ；Lind 等，A Orthop Scand 64(5) :553-556，1993 ；和 Matsumoto 等，In vivo, 8 :215_220，1994)。TGF-β 誘導(dǎo)的骨 形成是通過它對骨膜下多能細(xì)胞的刺激所介導(dǎo)的，這些細(xì)胞最終分化成軟骨細(xì)胞(Joyce 等，J Cell Biology,110 :2195-2207，1990 ；和 Miettinen 等，J Cell Biology,127-6 2021-2036，1994)。已報道了 TGF- β在矯形外科中的生物學(xué)作用(Andrew等，Calcif Tissue In. 52 74-78,1993 ；Borque 等，Int J Dev Biol,37 573-579,1993 ；Carrington 等，J Cell Biology，107 :1969-1975，1988 ;Lind 等，A Orthop Scand. 64(5) :553_556，1993 ；Matsumoto等，In vivo 8:215-220,1994)。在小鼠胚胎中，染色顯示TGF-β與衍生自間充 質(zhì)的組織(如結(jié)締組織、軟骨和骨)緊密相關(guān)。除了胚胎學(xué)的發(fā)現(xiàn)外，TGF-β還存在于骨 形成和軟骨形成部位。它還能增強家兔脛骨骨折愈合。近來，報道了 TGF-β的治療價值 (Critchlow 等，Bone，521-527，1995 ；和 Lind 等，A OrthopScand 64(5) :553_556，1993)，但 其短期作用和高成本限制了廣泛的臨床應(yīng)用。TGF-β關(guān)節(jié)內(nèi)注射用于治療關(guān)節(jié)炎不理想，因為注射的TGF-β作用持續(xù)時間短， 因為TGF在體內(nèi)降解成無活性形式。因此，需要一種長期釋放TGF-β的新方法，用于透明 軟骨再生。報道了自身移植軟骨細(xì)胞再生關(guān)節(jié)軟骨(Brittberg等，New Engl J Med 331 889-895，1994)，但該方法包括兩次廣泛切除軟組織的手術(shù)。如果關(guān)節(jié)內(nèi)注射足以治療變性 關(guān)節(jié)炎，這將對病人經(jīng)濟(jì)上和生理上有極大的好處?；蛑委熓且环N將特定蛋白轉(zhuǎn)移到特定部位的方法，它可以解決這個問題(Wolff 禾口 Lederberg，Gene Therapeutics, Jon A. Wolff 編，3—25，1994 ；禾口 Jerk，JNatl Cancer Inst,89(16) :1182_1184，1997)。美國專禾Ij 5，858，355和5，766，585公開了制造一種IRAP (白細(xì)胞介素_1受體拮 抗蛋白)基因的病毒或質(zhì)粒構(gòu)建物；用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染滑膜細(xì)胞(5，858，355)和骨髓細(xì)胞 (5，766，585)；和將轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射到家兔關(guān)節(jié)中，但未公開用屬于TGF-β超家族的基因再 生結(jié)締組織。美國專利號5，846，931和5，700, 774公開了注射含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)(屬 于TGF β “超家族”)和截短的甲狀旁腺激素相關(guān)肽的組合物，來影響軟骨組織形成的維持 并誘導(dǎo)軟骨組織。然而，未公開使用BMP基因作基因治療的方法。盡管這些現(xiàn)有技術(shù)公開的內(nèi)容，對于將編碼產(chǎn)物的至少一種基因在體外或體內(nèi)引 入哺乳動物宿主結(jié)締組織的至少一種細(xì)胞，用于治療哺乳動物宿主的方法仍然有非常現(xiàn)實 和基本的需要。另外，還需要一種方法，即采用編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員的一種基 因在哺乳動物宿主中再生結(jié)締組織。更具體說，需要一種方法，在體內(nèi)宿主結(jié)締組織細(xì)胞中 表達(dá)編碼蛋白質(zhì)TGF-β超家族的基因。發(fā)明簡述本發(fā)明滿足了本文上述需要。本發(fā)明提供了一種將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入 哺乳動物結(jié)締組織的至少一種細(xì)胞中，用于治療哺乳動物宿主的方法。該方法包括用重組 技術(shù)產(chǎn)生含有編碼該產(chǎn)物的基因的DNA載體分子，并將含有編碼該產(chǎn)物的基因的DNA載體 分子引入結(jié)締組織細(xì)胞中。該DNA載體分子可以是任何能被傳遞并在靶細(xì)胞或組織中維持 的DNA分子，從而編碼該感興趣產(chǎn)物的基因能穩(wěn)定表達(dá)。優(yōu)選用于本發(fā)明的DNA載體分子 是病毒或質(zhì)粒DNA載體分子。該方法優(yōu)選包括將編碼該產(chǎn)物的基因引入哺乳動物結(jié)締組織 的細(xì)胞，用于治療。本發(fā)明涉及一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，包括a)產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體包含編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族成 員的DNA序列，該序列與一啟動子可操縱性連接；b)用所述重組載體體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞群，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì) 胞；和
c)將轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì)胞通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔中，從而 該DNA序列在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致結(jié)締組織再生。該重組載體可以是但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，載體還可以 是質(zhì)粒載體。本發(fā)明的方法包括在移植前儲藏一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì)胞。細(xì)胞可在移植前液氮 下儲藏在10% DMSO中。結(jié)締組織細(xì)胞包括但不限于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。成纖 維細(xì)胞可以是NIH 3T3細(xì)胞或人包皮成纖維細(xì)胞。結(jié)締組織包括但不限于軟骨、韌帶或腱。軟骨可以是透明軟骨。本發(fā)明的方法使用轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，包括轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)。 轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員可以是TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、 ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。優(yōu)選，TGF- β 是人或豬的 TGF- β 1、TGF- β 2 或 TGF- β 3。本發(fā)明還涉及一種透明軟骨再生的方法，包括a)產(chǎn)生一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體中包含編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子超家族 成員的DNA序列，該序列與啟動子可操縱性連接；b)用該重組載體體外轉(zhuǎn)染一群培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞，得到一群轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì) 胞；和c)通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì)胞移植到哺乳動物宿主的關(guān)節(jié)腔中，從而 該DNA序列在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致透明軟骨再生。轉(zhuǎn)染的方法可通過脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)等方 法進(jìn)行。本發(fā)明的方法包括使用優(yōu)選的質(zhì)粒ρπιΤβ 1。本發(fā)明還涉及一種結(jié)締組織細(xì)胞系，它含有一種重組病毒或質(zhì)粒載體，該載體含 有編碼轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員的DNA序列。該結(jié)締組織細(xì)胞系可包括但不限于，成纖維 細(xì)胞系、間充質(zhì)細(xì)胞系、軟骨細(xì)胞系、成骨細(xì)胞系或骨細(xì)胞系。成纖維細(xì)胞系可以是人包皮 成纖維細(xì)胞系或NIH 3Τ3細(xì)胞系。本發(fā)明的結(jié)締組織細(xì)胞系包含轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)化生長 因子超家族的成員是 TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。更優(yōu)選的，該成員是人或豬的TGF-β l、TGF-0 2或TGF-3 3。本發(fā)明的結(jié)締組織細(xì)胞系還可以含有攜帶重組載體ρπιΤβ 1的細(xì)胞。本發(fā)明的這些和其他目的將從本發(fā)明下面的描述、附圖和權(quán)利要求中獲得更全面 的了解。附圖簡述圖I-TGF- β ImRNA的表達(dá)。從NIH 3Τ3細(xì)胞或用pmT β 1 ( —種TGF- β 1表達(dá)載 體)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3細(xì)胞分離得到總RNA。這些細(xì)胞在鋅存在或不存在情況下生長。 用TGF-β IcDNA或β肌動蛋白cDNA作為對照探測總RNA (15毫克)。圖2A-2B-再生軟骨的大體觀察2A.在股骨踝上制造矩形部分軟骨缺損，用未經(jīng)TGF-β 1轉(zhuǎn)染的NIH 3Τ3細(xì)胞注射 膝關(guān)節(jié)。該缺損沒能被覆蓋。
2B.注射NIH 3T3_TGF_i3 1細(xì)胞6周后缺損被新形成的組織覆蓋。再生組織的顏 色幾乎與周圍軟骨相同。圖3A-3D-再生軟骨的顯微鏡觀察(X 200)3A和3B.用對照細(xì)胞注射4和6周后缺損部分的蘇木精-伊紅(H&E)分析。無組 織覆蓋最初的缺損區(qū)域。3C和3D.注射TGF- β 1_轉(zhuǎn)染細(xì)胞4和6周后缺損區(qū)域的蘇木精-伊紅(Η&Ε)分 析。在4周時，注射TGF-β 1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，部分缺損區(qū)域已被透明軟骨覆蓋。注射4周和 6周后，再生組織變厚，6周時其高度幾乎與正常軟骨相同。在組織學(xué)上，再生的軟骨(箭 頭)與周圍的透明軟骨相同。圖4Α-4Β-家兔關(guān)節(jié)中/TGF- β 1表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析(χ200)。棕色(Brown)免疫過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物表明在NIH 3T3TGF_i3 1細(xì)胞中有高水平 的重組TGF-β 1表達(dá)(4Β)。4Α顯示了注射對照細(xì)胞的家兔關(guān)節(jié)中的透明軟骨。圖5Α-5Β-用Η&Ε染色(A)和safranin-O染色(B)的再生組織的顯微鏡觀察 (X200)。5A.在部分損傷區(qū)域，H&E染色(黑色箭頭)顯示了再生的透明軟骨。5B.在完全的剝離軟骨的區(qū)域，再生組織(白色箭頭)是纖維狀膠原。圖6-ρπιΤβ 1的質(zhì)粒圖。圖7A-7D-注射TGF- β 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的家兔跟腱的總體形態(tài)學(xué)。7Α.注射對照細(xì)胞的腱。7Β.注射TGF-β 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腱，注射后6周。7C.7A中的腱的橫切面圖。7D.7B中的腱的橫切面圖。圖8A-8F-H&E染色家兔跟腱中的再生組織的顯微鏡觀察。8Α、8Β和8C顯示了注射對照細(xì)胞6周的腱。8Α.放大50倍。8Β.放大200倍。 8C.放大600倍。8D、8E和8F顯示了注射TGF-β 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后6周的腱。8D.放大50倍。8Ε.放大 200倍。8F.放大600倍。注射入該腱的TGF-βΙ轉(zhuǎn)染細(xì)胞看來比內(nèi)源性腱細(xì)胞更圓。通 過作用的自分泌和旁分泌模式產(chǎn)生纖維狀膠原，腱增大。注射TGF-β 1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后腱增大。圖9Α-9Β-對用Η&Ε染色(A)和用TGF- β 1抗體免疫組織化學(xué)染色(B)的家兔跟 腱中的再生組織的顯微鏡觀察。棕色免疫過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物表明，在NIH3T3-TGF-i3 1細(xì) 胞中高水平的重組TGF-β 1表達(dá)。發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語“病人”指動物王國的成員，包括但不限于人類。本文所用的術(shù)語“哺乳動物宿主”包括動物王國的成員，包括但不限于人類。本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織”是連接或支持其他組織或器官的組織，包括但不限于 哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、腱、骨和滑膜。本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織細(xì)胞”或“結(jié)締組織的細(xì)胞”包括在結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)的 細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(chondrocyte)、和骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞)，它們像脂
6肪細(xì)胞(adipocyte)和平滑肌細(xì)胞一樣分泌膠原性胞外基質(zhì)。優(yōu)選的結(jié)締組織細(xì)胞是成纖 維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。更優(yōu)選的結(jié)締組織細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。結(jié)締組織細(xì)胞還包括 間充質(zhì)細(xì)胞，它們也稱為未成熟成纖維細(xì)胞。應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明可采用結(jié)締組織細(xì)胞的混合 培養(yǎng)物和單種類型細(xì)胞來實施。本文所用的術(shù)語“結(jié)締組織細(xì)胞系”包括起源于共同親本細(xì)胞的多種結(jié)締組織細(xì) 胞。本文所用的術(shù)語“透明軟骨”指覆蓋關(guān)節(jié)表面的結(jié)締組織。僅作為舉例，透明軟骨 包括但不限于關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。具體的，已知透明軟骨是自我更新的，對變化起反應(yīng)的，并使運動減少摩擦而穩(wěn) 定。發(fā)現(xiàn)甚至在同一關(guān)節(jié)內(nèi)或關(guān)節(jié)之間厚度、細(xì)胞密度、基質(zhì)組成和機械性質(zhì)都不同，但保 持著相同的總體結(jié)構(gòu)和功能。透明軟骨的某些功能包括對壓縮驚人的剛性、彈性，和突出的 分散重量負(fù)荷的能力、最大程度減小軟骨下骨的高峰應(yīng)力的能力，以及強大的耐久性。總體從組織學(xué)上說，透明軟骨看起來是能抵抗變形的一種光滑堅固表面。軟骨的 胞外基質(zhì)含有軟骨細(xì)胞，但缺少血管、淋巴管和神經(jīng)。維持軟骨細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互作用 的精巧而高度有序的結(jié)構(gòu)起到了維持透明軟骨結(jié)構(gòu)和功能的作用，同時保持著低水平的代 謝活動。0' Driscoll, J. Bone Joint Surg.，80A :1795_1812，1998 詳細(xì)描述了透明軟骨的 結(jié)構(gòu)和功能，在此引入以供參考。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)超家族”包含了一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的 蛋白質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中影響各式各樣的分化過程。該家族包括MUllerian抑制物質(zhì) (MIS)，它是正常雄性發(fā)育必需的(Behringer等，Nature，345 :167，1990)，果蠅十五褶 (DPP)基因產(chǎn)物，它是背腹軸線形成和器官芽形態(tài)發(fā)生所必需的(Padgett等，Nature，325 81-84，1987)，非洲爪蟾Vg-I基因產(chǎn)物，它位于卵子的植物極(Weeks等，Cell，51 =861-867, 1987)，肌動蛋白(Mason 等，Biochem, Biophys. Res. Commun.，135 :957_964，1986)，它能 誘導(dǎo)非洲爪蟾胚胎的中胚層和前結(jié)構(gòu)的形成(Thomsen等，Cell,63 :485，1990)，和骨形 態(tài)發(fā)生蛋白(BMP’ s，如BMP-2、3、4、5、6和7，成骨素，0P-1)，它能誘導(dǎo)軟骨和骨從頭形成 (Sampath等，J. Biol. Chem.，265 13198，1990)。TGF-β基因產(chǎn)物可影響各種分化過程，包 括脂肪形成、肌生成、軟骨生成、血細(xì)胞生成和表皮細(xì)胞分化(對于綜述，見Massague，Cell 49 :437，1987)，在此引入以供參考。最初合成了作為大前體蛋白質(zhì)的TGF-β家族蛋白質(zhì)，然后經(jīng)過在離C-端約110 =140個氨基酸的一簇堿性殘基處進(jìn)行蛋白水解切割。這些蛋白質(zhì)的C-端區(qū)域都是結(jié)構(gòu)相 關(guān)的，不同家族成員可根據(jù)其同源性程度分成不同亞組。雖然具體亞組內(nèi)的同源性范圍氨 基酸序列相同性在70% -90%之間，但亞組之間的同源性明顯低得多，通常僅20% -50%。 在各種情況下，活性種類看來是C-末端片段二硫鍵連接的二聚體。對于該家族大多數(shù) 已研究過的成員，發(fā)現(xiàn)同二聚體具有生物活性，但對于其他家族成員，如抑制素(Ung等， Nature，321 :779，1986)和 TGF-β (Cheifetz 等，Cell，48 :409，1987)，也已檢測到異二聚 體，這些異二聚體似乎與各個同二聚體具有不同的生物學(xué)性質(zhì)。TGF- β 基因超家族的成員包括 TGF- β 3、TGF- β 2、TGF- β 4 ( )、TGF- β 1、 TGF- β 5 (非洲爪蟾)、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、果蠅 DPP、BMP-5、BMP-6、Vgrl、0P-l/BMP_7、果蠅 60A、 GDF-I、非洲爪蟾Vgf、抑制素-β Α、抑制素-β B、抑制素-α和MIS。在Massague, Ann. Rev.Biochem. 67 :753_791，1988中描述了這些基因，在此引入以供參考。優(yōu)選TGF-β超家族的成員是TGF-β。更優(yōu)選的成員是TGF-β 1、TGF-β 2、 TGF- β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6或ΒΜΡ-7。甚至更優(yōu)選的成員是人或豬的 TGF-β。更優(yōu)選的成員是人或豬TGF-i3 1、TGF-i3 2或TGF-i3 3。最優(yōu)選的成員是人或豬 TGF- β 1 ο本文所用的術(shù)語“可選擇標(biāo)記”包括細(xì)胞表達(dá)的基因產(chǎn)物，該細(xì)胞能穩(wěn)定維持引入 的DNA，該DNA導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)改變的表型如形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)化或酶活性。分離表達(dá)某轉(zhuǎn)染基因的 細(xì)胞可通過將第二種編碼可選擇標(biāo)記的基因引入同一細(xì)胞來實現(xiàn)，例如引入具有能賦予對 抗生素或其他藥物抗性的酶活性的標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于胸腺嘧啶激酶、 二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，它賦予對氨基糖苷抗生素(如卡那霉素、新霉素和 遺傳霉素)的抗性、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、CAD(—種蛋白 質(zhì)，具有尿嘧啶從頭生物合成的前三種酶活性-氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基甲 酰酶和二氫乳清酸酶(dihydroorotase))、腺嘌呤脫氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等， MolecularCloning, 16章，1989)，在此引入以供參考。本文所用的術(shù)語“啟動子”可以是能控制真核生物中轉(zhuǎn)錄的有活性的任何DNA序 列。啟動子可以在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中具有活性。優(yōu)選啟動子在哺乳動物細(xì)胞中具有活 性。啟動子可以是組成型表達(dá)或可誘導(dǎo)的。優(yōu)選的啟動子是可誘導(dǎo)的。優(yōu)選的啟動于是可 被外源刺激誘導(dǎo)的。更優(yōu)選的啟動子是被激素或金屬誘導(dǎo)的。最優(yōu)選的啟動子是金屬硫蛋 白基因啟動子。類似的，可以將也能控制轉(zhuǎn)錄的“增強子元件”插入該DNA載體構(gòu)建物中， 用于本發(fā)明的構(gòu)建物來增強感興趣基因的表達(dá)。本文所用的術(shù)語“DC-chol”意味著一種含有陽離子膽固醇衍生物的陽離子脂質(zhì) 體?！癉C-chol”分子包括叔氨基，中等長度的空間臂(兩個原子)和氨基甲?；宇^鍵(Gao 等，Biochem. Biophys. Res, Commun.，179 :280_285，1991)。本文所用的術(shù)語“SF-chol”定義為一類陽離子脂質(zhì)體。本文所用的與脂質(zhì)體相關(guān)的術(shù)語“生物學(xué)活性”指在靶細(xì)胞中引入功能性DNA和 /或蛋白質(zhì)的能力。本文所用的與核酸、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或其衍生物有關(guān)的術(shù)語“生物學(xué)活性”指 核酸或氨基酸序列模仿野生型的核酸或蛋白質(zhì)引起的已知生物學(xué)功能的能力。本文所用的術(shù)語“維持”當(dāng)和脂質(zhì)體傳遞一起使用時，指引入的DNA保持在細(xì)胞內(nèi) 的能力。當(dāng)用于其他情況時，它指靶向DNA保持在靶細(xì)胞或組織中，從而賦予治療效果的能 力。本發(fā)明公開了在體外和體內(nèi)將感興趣的DNA序列傳遞到哺乳動物宿主的結(jié)締組 織細(xì)胞的技術(shù)?；铙w外技術(shù)涉及培養(yǎng)靶結(jié)締組織細(xì)胞，在體外將DNA序列、DNA載體或其他 感興趣的傳遞載體轉(zhuǎn)染入結(jié)締組織細(xì)胞，然后將修飾的結(jié)締組織細(xì)胞移植到該哺乳動物宿 主的靶關(guān)節(jié)中，從而影響該感興趣基因產(chǎn)物的體內(nèi)表達(dá)。作為體外成纖維細(xì)胞操縱的另選方法，將編碼感興趣的產(chǎn)物的基因引入脂質(zhì)體， 直接注射到關(guān)節(jié)區(qū)域，其中脂質(zhì)體與結(jié)締組織細(xì)胞融合，導(dǎo)致體內(nèi)基因表達(dá)屬于TGF-β超 家族的基因產(chǎn)物。作為體外結(jié)締組織細(xì)胞操縱的另選方法，將編碼感興趣產(chǎn)物的基因作為裸露DNA引入關(guān)節(jié)區(qū)域。裸露DNA進(jìn)入結(jié)締組織細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)基因表達(dá)屬于TGF-β超家族的基因產(chǎn)物。本說明書公開的一種治療結(jié)締組織疾病的活體外方法包括首先產(chǎn)生一種重組病 毒或質(zhì)粒載體，它含有編碼蛋白質(zhì)或其生物活性片段的DNA序列。然后用該重組載體感染 或轉(zhuǎn)染一群體外培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞，得到一群含有該載體的結(jié)締組織細(xì)胞。然后將這些 結(jié)締組織細(xì)胞移植在哺乳動物宿主的靶關(guān)節(jié)腔中，影響該蛋白或蛋白片段在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的隨 后表達(dá)。該感興趣的DNA序列的表達(dá)對于減輕與結(jié)締組織疾病相關(guān)的有害關(guān)節(jié)病理變化是 有用的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，治療人類患者的細(xì)胞的優(yōu)選來源是病人自己的結(jié)締 組織細(xì)胞，如自身的成纖維細(xì)胞。更具體的，作為基因，本方法包括使用一種能編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員， 或其生物活性衍生物或其片段，和一可選擇標(biāo)記或其生物活性衍生物或片段的基因。作為基因，本發(fā)明的另一個實施例包括使用能編碼至少一個轉(zhuǎn)化生長因子β超 家族的成員，或其生物活性衍生物或片段的基因，和作為DNA質(zhì)粒載體，使用本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的、能在靶細(xì)胞或組織內(nèi)，不論使用什么傳遞方法，都能在傳遞后穩(wěn)定維持的任 何DNA質(zhì)粒載體。一種方法是直接傳遞DNA載體分子到靶細(xì)胞或組織，不論它是病毒或質(zhì)粒DNA載 體分子。作為基因，該方法還包括使用能編碼轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員或生物活性衍生 物或其片段的基因。本發(fā)明的另一個實施例提供了一種方法，將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入至少一 種結(jié)締組織細(xì)胞，用于治療哺乳動物宿主。本發(fā)明方法包括使用非病毒物質(zhì)，將編碼該產(chǎn) 物的基因引入結(jié)締組織細(xì)胞。更具體的，該方法包括脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電穿孔或 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)，以及作為基因，包括使用能編碼轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員或生物活性衍 生物或其片段，和一可選擇標(biāo)記或生物活性衍生物或其片段的基因。本發(fā)明的另一個實施例提供了另一種方法，來將至少一個編碼產(chǎn)物的基因引入至 少一種結(jié)締組織細(xì)胞，用于治療哺乳動物宿主。該另一種方法包括使用能利用病毒將DNA 載體分子傳遞給靶細(xì)胞或組織的生物學(xué)方法。優(yōu)選的，該病毒是一種擬病毒，其基因組已經(jīng) 改變，使該擬病毒僅能傳遞并在靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持，但沒有在靶細(xì)胞或組織中復(fù)制的能力。 用重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操縱改變的病毒基因組，使病毒基因組起到DNA載體分子的作用，它 含有要在靶細(xì)胞或組織中表達(dá)的感興趣的異源基因。本發(fā)明的優(yōu)選例是一種將TGF-β傳遞給靶關(guān)節(jié)腔的方法，該方法通過將TGF-β 基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和本說明書中公開的活體外技術(shù)傳遞給哺乳動物宿主的結(jié)締組織。 換言之，將編碼功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的感興趣的DNA序列亞克隆入所選的逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體中，然后使重組的病毒載體長到足夠的滴度，用于體外感染培養(yǎng)的結(jié)締組織細(xì)胞， 并優(yōu)選通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射將轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)締組織細(xì)胞移植到感興趣的關(guān)節(jié)中，優(yōu)選自身移植的細(xì) 胞。本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法涉及將TGF-β超家族基因通過使用腺病毒載體、腺相 關(guān)病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體直接體內(nèi)傳遞給哺乳動物結(jié)締組織。換言之， 將感興趣的編碼功能性TGF-β蛋白質(zhì)或蛋白片段的DNA序列亞克隆入各病毒載體。然后使含TGF-β的病毒載體生長到足夠的滴度，優(yōu)選通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射直接進(jìn)入關(guān)節(jié)腔。直接在關(guān)節(jié)內(nèi)注射含有感興趣基因的DNA分子導(dǎo)致受者結(jié)締組織細(xì)胞轉(zhuǎn)染，從而 繞過了回收、體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、選擇和移植含該DNA載體的成纖維細(xì)胞，以促進(jìn)感興趣的異 源基因穩(wěn)定表達(dá)的要求。將DNA分子遞呈給靶關(guān)節(jié)結(jié)締組織的方法包括但不限于將DNA分子包裹在陽離 子脂質(zhì)體中，將感興趣的DNA序列亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒載體，或?qū)NA分子本身直接 注射入關(guān)節(jié)。不論DNA分子遞呈給膝關(guān)節(jié)的形式，DNA分子優(yōu)選以DNA載體分子(重組病 毒DNA載體分子或重組DNA質(zhì)粒載體分子)的形式遞呈。將在真核細(xì)胞中有活性的啟動子 片段插入到異源基因編碼區(qū)的直接上游，來確保感興趣的異源基因的表達(dá)。本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員可利用載體構(gòu)建的已知方法和技術(shù)來確保在DNA分子進(jìn)入結(jié)締組織后的合適的表 達(dá)水平。在優(yōu)選例中，將從膝關(guān)節(jié)回收的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)，然后用作基因治療的傳 遞系統(tǒng)。顯然申請人不限于使用已公開的特定結(jié)締組織?？赡苁褂闷渌M織來源，用于體 外培養(yǎng)技術(shù)。使用本發(fā)明基因的方法可用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防或治療。應(yīng)明白申請人不限于僅 治療膝關(guān)節(jié)的預(yù)防和治療用途?？赡芾帽景l(fā)明預(yù)防性或治療性治療任何易感關(guān)節(jié)中的關(guān) 節(jié)炎。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了以治療有效量胃腸外給藥的一種化合物，它 含有編碼TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。本發(fā)明的另一個實施例提供了胃腸外施給病人預(yù)防有效量的化合物，它含有編碼 TGF-超家族蛋白的基因和合適的藥物載體。本發(fā)明的另一個實施例包括本文前述的方法，包括體外將基因引入細(xì)胞。該方法 還包括然后將感染的細(xì)胞移植入哺乳動物宿主。該方法包括在有效轉(zhuǎn)染結(jié)締組織細(xì)胞后， 但在將感染細(xì)胞移植入哺乳動物宿主前，儲藏轉(zhuǎn)染的結(jié)締組織細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理 解感染的結(jié)締組織細(xì)胞可在液氮下凍存于10% DMSO中。本方法包括使用基本上能防止高 度易感關(guān)節(jié)炎的哺乳動物宿主中發(fā)生關(guān)節(jié)炎的方法。本發(fā)明的另一個實施例包括一種方法，將至少一種編碼產(chǎn)物的基因引入哺乳動物 宿主的至少一種結(jié)締組織細(xì)胞中，用于治療如前所述哺乳動物宿主，包括通過將含有編碼 該產(chǎn)物基因的病毒載體直接引入哺乳動物宿主，實現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞的感染。優(yōu)選該方法包括通 過關(guān)節(jié)內(nèi)注射實現(xiàn)直接引入哺乳動物宿主。該方法包括使用基本上能防止在高度易感關(guān)節(jié) 炎的哺乳動物宿主發(fā)生關(guān)節(jié)炎的方法。該方法還包括將該方法用于治療患關(guān)節(jié)炎的哺乳動 物宿主。另外該方法還包括如本文前述的使用該方法修復(fù)和再生結(jié)締組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，使用脂質(zhì)體的病毒載體不限于如逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的細(xì)胞 分裂的限制，來實現(xiàn)結(jié)締組織細(xì)胞的感染和整合。作為基因，使用如本文前述的非病毒物質(zhì) 的方法，包括使用編碼屬于TGF-β超家族成員的基因和可選擇標(biāo)記基因(如抗生素抗性基 因)。本發(fā)明的另一個實施例是將編碼TGF-β超家族的成員的DNA序列通過本說明書 公開的任一方法傳遞給哺乳動物宿主的結(jié)締組織，從而實現(xiàn)膠原的體內(nèi)表達(dá)，使結(jié)締組織 (如軟骨)再生。在作為例子公開的，而不是對本發(fā)明限制的具體方法中，將含有TGF-β編碼序列
10的DNA質(zhì)粒載體連接到金屬硫蛋白啟動子的下游。結(jié)締組織是治療上難于靶向的器官。本領(lǐng)域已知的靜脈內(nèi)和口腔途徑的藥物傳遞 很難到達(dá)這些結(jié)締組織，并有使哺乳動物宿主全身性接觸治療藥物的缺點。更具體的說，已 知在關(guān)節(jié)內(nèi)注射蛋白質(zhì)能直接到達(dá)關(guān)節(jié)。然而，以包裹蛋白質(zhì)形式注射的藥物大部分在關(guān) 節(jié)內(nèi)半衰期短。本發(fā)明通過將編碼可用于治療哺乳動物宿主的蛋白質(zhì)的基因引入哺乳動物 宿主的結(jié)締組織解決了這些問題。更具體說，本發(fā)明提供了一種方法，將編碼具有抗-關(guān)節(jié) 炎性質(zhì)的蛋白質(zhì)的哺乳動物宿主基因引入結(jié)締組織。在本發(fā)明中，應(yīng)用基因治療解決了與TGF-β給藥相關(guān)的作用持續(xù)時間短和成本 高的問題。轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在組織培養(yǎng)物中存活6周以上而沒有形態(tài)變化。為了確定作用的耐 久性和持續(xù)時間，將細(xì)胞注射到家兔跟腱中。如果對于體內(nèi)細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)充足，該細(xì)胞可存 活足夠長的時間，并產(chǎn)生TGF-β，來刺激周圍的細(xì)胞。該細(xì)胞在腱內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)兩種環(huán)境中都 具有功能。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的濃度是局部作用的重要因素。在先前的實驗(Joyce等，見上，1990) 中，TGF-β的劑量確定了形成的組織類型。特別是，軟骨形成與膜內(nèi)骨形成的比例隨著劑 量的降低而下降。TGF-β在刺激原代成骨細(xì)胞和MC3T3細(xì)胞中還有二相性(Centrella等， Endicrinology, 119 =2306-2312,1986) 0即，根據(jù)濃度，它可以是刺激性的也可以是抑制性 的(Chenu 等，Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988)。在本文提供的實施例中，NIH 3T3-TGF-i3 1細(xì)胞以IO4UO5和IO6細(xì)胞/毫升的不同濃度刺激膠原合成。腱在IO6細(xì)胞/ 毫升的濃度下增大最多。在實施例中，用0. 3毫升IO6細(xì)胞/毫升濃度注射關(guān)節(jié)。收集注射后2-6周的標(biāo) 本。關(guān)節(jié)的環(huán)境與跟腱的不同。細(xì)胞可在關(guān)節(jié)內(nèi)自由移動。它們可移動到對該細(xì)胞具有特 定親和力的區(qū)域。滑膜、半月板和軟骨缺損區(qū)域是細(xì)胞粘著的可能部位。注射6周后，在部 分或完全損傷的軟骨缺損區(qū)域觀察到再生組織，但在滑膜和半月板處未觀察到。對于損傷 區(qū)域的特異親和力是臨床應(yīng)用的另一個優(yōu)點。如果變性關(guān)節(jié)炎可僅用關(guān)節(jié)內(nèi)注射細(xì)胞而可 治愈，那么可方便的治療病人，不用大手術(shù)。注射細(xì)胞分泌的TGF-β可能以兩種方式刺激透明軟骨再生。一種是留在受傷區(qū) 域的軟骨細(xì)胞在其細(xì)胞表面產(chǎn)生TGF-β受體(Brand等，J Biol Chem, 270 =8274-8284, 1995 ；Cheifetz 等，Cell,48 :409_415，1987 ；Dumont 等，M CellEndo, 111 57~66,1995 ； Lopez-Casillas 等，Cell, 67 :785_795，1991 ；Miettinen 等，J Cell Biology,127 :6， 2021-2036，1994 ；和 Wrana 等，Nature，370 :341_347，1994)。這些受體可能受到粘著在損傷 區(qū)域的注射細(xì)胞分泌的TGF-β刺激。因為TGF-β在體內(nèi)以潛在形式分泌(Wakwfield等， J Biol Chem，263，7646-7654，1988)，潛在的TGF-β需要激活過程。另一種方式是潛在的 TGF-β或轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的TGF-β可能與TGF-β結(jié)合蛋白(LTBT)在部分損傷的軟骨層的 胞外基質(zhì)上結(jié)合(Dallas 等，J Cell Biol, 131 :539_549，1995)。不論作用機制如何，透明軟骨合成的發(fā)現(xiàn)表明長時期的高TGF-β能刺激透明軟 骨再生。局部高濃度的該載體可能不是局部刺激的關(guān)鍵因素，但是理論上軟骨細(xì)胞可能 是最合適的將TGF-β傳遞給軟骨受損區(qū)域的載體(Brittberg等，New Engl JMed 331 889-895,1994)。膠原雙層基質(zhì)是局部分布轉(zhuǎn)染細(xì)胞的另一種可能的載體(Frenkel等，J Bone J Surg(Br)79-B :831-836，1997)。
用組織學(xué)方法確定了新形成的組織性質(zhì)。在H&E染色中，新形成的組織與周圍的 透明軟骨相同(圖4)。為了評估新形成組織的性質(zhì)，用Safranin-O染色組織(Rosenburg， J Bone Joint Surg，53A :69_82，1971)。與白色的纖維狀膠原相反，新形成的組織染成紅 色，提示它是透明軟骨(圖5)。完全損傷區(qū)域中的細(xì)胞產(chǎn)生了纖維狀膠原。由于存在對TGF-β刺激的骨樣基質(zhì) 屏障，周圍成骨細(xì)胞可能未被刺激。NIH 3T3-TGF-i3 1細(xì)胞不刺激周圍細(xì)胞，而是通過自分 泌刺激產(chǎn)生纖維狀膠原。自分泌和旁分泌激活刺激細(xì)胞的事實增加了用TGF-β 1表達(dá)構(gòu)建 物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞治療變性關(guān)節(jié)炎的可能性。用TGF-β 1表達(dá)構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能在腱和膝關(guān)節(jié)內(nèi)存活。該細(xì)胞系在腱 和完全損傷軟骨區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生纖維狀膠原。然而，該細(xì)胞系在部分損傷的關(guān)節(jié)軟骨中產(chǎn)生透 明軟骨。該作用的自分泌和旁分泌模式的刺激機制表明，用TGF-β超家族基因的成員進(jìn)行 基因治療是一種新的治療透明軟骨損傷的方法。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)染TGF-β 1表達(dá)構(gòu)建物制備了穩(wěn)定的成纖維細(xì)胞 (NIH3T3-TGF-0 1，和人包皮成纖維細(xì)胞TGF-β 1)細(xì)胞系。這些產(chǎn)生TGF-β的細(xì)胞在體內(nèi) 長時間的維持了高濃度的活性TGF-β。要回答的關(guān)于基因治療，特別是細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療的可能性的第一個問題是細(xì) 胞在體內(nèi)的存活率。盡管TGF-β在體外能抑制免疫細(xì)胞，但細(xì)胞在具有高效免疫監(jiān)視系統(tǒng) 的其他物種組織中可能不能存活。第二，應(yīng)評估基因在體內(nèi)表達(dá)的最佳濃度。我們將細(xì)胞 以三種不同濃度注射到家兔的跟腱中，來回答這個問題。從腱內(nèi)注射的最佳濃度確定了要 用的關(guān)節(jié)內(nèi)注射的濃度。第三個問題是細(xì)胞如何在關(guān)節(jié)內(nèi)刺激軟骨再生。注射的細(xì)胞有兩種作用模式。一種是通過分泌TGF-β激活周圍細(xì)胞(旁分泌激 活)(Snyder，Sci Am，253 (4) :132_140，1985)，另一種是自身激活(自分泌激活)。細(xì)胞濃 度可影響這些途徑，但周圍環(huán)境可能是決定作用模式的最重要因素。關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)液和韌帶 內(nèi)部是兩種不同的環(huán)境，它們的血液供應(yīng)、營養(yǎng)供應(yīng)和圍繞的細(xì)胞都不同。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注 射到兩種不同環(huán)境中，以尋找出細(xì)胞的作用模式。該研究的整個目的是評估對矯形外科疾 病的TGF- β _介導(dǎo)的基因治療，并明確體內(nèi)作用的模式。提供下列實施例說明本發(fā)明，而不是限制。
實施例實施例I-材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建為了產(chǎn)生金屬硫蛋白表達(dá)構(gòu)建物(ρΜ)，用基因組DNA通過聚合酶鏈?zhǔn)綌U增在 用于擴增的寡核苷酸中構(gòu)建了 XbaI和Bam HI限制性位點，產(chǎn)生了金屬硫蛋白I啟動子 (-660/+63)。將擴增片段亞克隆入 pBluescript(Stratagene，La Jolla, CA)的 Xba I-Bam HI位點。通過將含有TGF-β 1編碼序列和3’末端含生長激素聚腺苷酸化位點的1. 2kb Bgl II片段亞克隆入ρΜ的Bam HI-Sal I位點，產(chǎn)生了質(zhì)粒pmT β 1。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染-將TGF- β cDNA轉(zhuǎn)染入成纖維細(xì)胞(NIH 3T3-TGF- β 1)或人包 皮成纖維細(xì)胞/TGF-β 1，在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(GIBC0-BRL， Rockville,MD)中培養(yǎng)。將TGF-β IcDNA序列加入具有金屬硫蛋白基因啟動子的pmT β 1載
12體中。還將新霉素抗性基因序列插入該載體。用磷酸鈣沉淀法將該載體插入所用的細(xì)胞。為了選擇具有轉(zhuǎn)染的基因序列的細(xì) 胞，將新霉素(300微克/毫升)加到培養(yǎng)基中。然后，選擇存活的菌落并通過Northern分 析和TGF-β 1 ELISA (R&D系統(tǒng))試驗確認(rèn)TGF-β 1 mRNA的表達(dá)。將具有TGF-β 1表達(dá)的 細(xì)胞儲藏在液氮中，注射前進(jìn)行培養(yǎng)。Northern印跡分析-用異硫氰酸胍/苯酚/氯仿從細(xì)胞中分離出總RNA。在含 有0. 66M甲醛的1. 0 %瓊脂糖凝膠上電泳10微克RNA，轉(zhuǎn)移到DURAL0N-UV膜上，并與UV STRATALINKER(STRATAGENE)交聯(lián)。預(yù)雜交印跡，并在牛血清清蛋白、7% (w/v) SDS,0. 5M 磷酸鈉和ImM EDTA的溶液中65V雜交。用0. SDS、IXSSC 50°C洗滌雜交印跡20分鐘， 然后曝光底片。使RNA印跡與用于人TGF- β 1的32P-標(biāo)記的cDNA探針雜交。用β -肌動 蛋白探針作樣品負(fù)荷的對照。將細(xì)胞注射入家兔-選擇重2. 0-2. 5公斤的新西蘭白兔作為動物模型。用開他敏 和roumpon麻醉后，用消毒巾覆蓋白兔。暴露跟腱，將0. 2-0. 3毫升濃度為IO4UO5和IO6細(xì) 胞/毫升的細(xì)胞注射到腱的正中部位。將硫酸鋅加到家兔飲用水中，用于表達(dá)轉(zhuǎn)染的DNA。 用跟腱實驗確定最佳濃度后，進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。暴露膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀制造部分和完全軟骨 缺損。在透明軟骨層上制造部分缺損，注意不暴露軟骨下骨。除去所有透明軟骨后暴露軟 骨下骨制造完全缺損?？p合手術(shù)傷口后，關(guān)節(jié)內(nèi)注射IO6細(xì)胞/毫升濃度的細(xì)胞，在飲用水 中加入硫酸鋅。組織學(xué)檢測_收集跟腱和膝關(guān)節(jié)后，用福爾馬林固定標(biāo)本，用硝酸脫鈣。將它們包 埋在石蠟塊中，切成0. 8微米厚的切片。用蘇木精_伊紅和Safranin-O染色顯微鏡觀察再 生的組織。實施例II-結(jié)果穩(wěn)定的細(xì)胞系_用磷酸鈣共沉淀法(

圖1)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。大約80%存活的細(xì)胞集 落表達(dá)轉(zhuǎn)基因mRNA。將這些選出的產(chǎn)生TGF-β 1的細(xì)胞在硫酸鋅溶液中培育。當(dāng)細(xì)胞在 100 μ M硫酸鋅溶液中培育時，它們產(chǎn)生mRNA。TGF-β分泌率是約32納克/IO6細(xì)胞/24小 時。家兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生-觀察了家兔跟腱以核查NIH 3T3-TGF_i3 1細(xì)胞的存活 率。在IO6細(xì)胞/毫升濃度，跟腱比其他IO4和IO5兩種濃度都要厚。造成部分和完全軟骨 缺損后，將0.3毫升IO6細(xì)胞/毫升的NIH 3T3-TGF-i3 1細(xì)胞注射到膝關(guān)節(jié)中。注射后2_6 周檢查關(guān)節(jié)。在部分損傷的軟骨中，我們發(fā)現(xiàn)新形成的透明軟骨；注射后兩周，透明軟骨出 現(xiàn)，注射后6周，軟骨缺損被透明軟骨覆蓋(圖2)。再生軟骨的厚度隨著時間過去而增厚 (圖3)。注射細(xì)胞分泌的TGF-β 1，可通過用TGF-β 1抗體免疫組織化學(xué)染色觀察到(圖 3)。用未經(jīng)TGF-β 1轉(zhuǎn)染的正常成纖維細(xì)胞注射的對側(cè)關(guān)節(jié)未觀察到透明軟骨覆蓋。在部 分損傷的區(qū)域，在Safrain-O染色中再生透明軟骨呈紅色(圖4)。(新形成的軟骨深度幾 乎與缺損的深度相同)。該發(fā)現(xiàn)提示注射的細(xì)胞通過旁分泌作用模式激活周圍正常軟骨細(xì) 胞。完全損傷的軟骨中再生組織不是透明軟骨而是纖維狀膠原。它們的顏色在 Safrain-O染色中呈白色，而不是透明軟骨獲得的紅色(圖5)。軟骨被纖維狀組織覆蓋，意 味著僅通過自分泌模式激活這些細(xì)胞?？杀籘GF-β激活的周圍骨細(xì)胞看來由于存在厚的鈣化骨基質(zhì)而阻擋了 TGF-β對其的刺激。注射的細(xì)胞可能由于該屏障不能刺激骨細(xì)胞。將TGF-β 1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注射到家兔跟腱中。這樣操作的腱顯示比對照腱總體更厚 的形態(tài)學(xué)(圖7)。對該跟腱的切片作Η&Ε染色，在顯微鏡下檢查，注入的NIH3T3-TGF-i3 1 細(xì)胞存活并在家兔的跟腱中產(chǎn)生纖維狀膠原(圖8)。顯微鏡檢查用TGF-β 1抗體作免疫組 織化學(xué)染色的再生的腱組織，顯示TGF-β 1在腱中的表達(dá)(圖9)。為了說明雖然已描述了本發(fā)明的具體實施例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說本發(fā)明的 細(xì)節(jié)顯然可作許多變化，然而這些變化不違背本發(fā)明權(quán)利要求所確定的范圍。本文引用的所有參考文獻(xiàn)在此弓I入以供參考。參考文獻(xiàn)Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, Freemont AJ 禾口 Marsh D 在正常骨折愈合中 通過原位雜交顯示 TGF-β 1 mRNAo Calcif Tissue Int，52 :74_78，1993。Bourque WT,Gross M和Hall BK 在骨折修復(fù)過程中四種生長因子的表達(dá)。Int J Dev Biol,37 :573_579，1993。Brand T和Schneider MD 無活性II型和I型受體TGF-β是TGF-β依賴轉(zhuǎn)錄 的優(yōu)勢抑制劑。J Biol Chem，270 :8274-8284，1995。Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O 禾口 PetersonL 用自 身軟骨細(xì)胞移植治療膝關(guān)節(jié)中的深度軟骨缺損。New Engl J Med 331 :889_895，1994。Carringtong JL, Roberts AB, Flankers KC, Roche NS 禾口 Reddi AH:在軟骨內(nèi)骨 發(fā)育中 TGF-β 的積聚、定位和區(qū)室化 J Cell Biology，107 :1969-1975，1988。Centrella Μ, Massague J和Canalis E 人血小板衍生的轉(zhuǎn)化生長因子-β刺激 胎鼠顱骨中的骨生長。Endocrinology, 119 :2306_2312，1986。Cheifetz S, Weatherbee JA, Tsang MLS, Anderson JK, Lucas R, MassagueJ 轉(zhuǎn)化 生長因子β系統(tǒng)，交叉反應(yīng)配體和受體的復(fù)雜模式。Cell，48 :409-415，1987。Chenu C, Pfeilschifter J, Mundy GR 禾口 Roodman GD =TGF-β 抑制長期人骨髓培 養(yǎng)物中的成骨樣細(xì)胞形成。Proc. Natl. Acad. Sci，85 :5683_5687，1988。Critchlow MA, Bland YS和Ashhurst DE 外源轉(zhuǎn)化生長因子- β 2對家兔骨折愈 合上的效果。Bone，521-527，1995。Dallas SL, Miyazono K, Skerry TM, Mundy GR 和 Bonewald LF 潛在的轉(zhuǎn)化生長 因子β結(jié)合蛋白(LTBP)在潛在的TGF-β儲藏于胞外基質(zhì)中和作為結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白質(zhì)的雙 重作用。J Cell Biol, 131 :539_549，1995。Dumont N，O’ Connor M和Philip A 人子宮內(nèi)膜細(xì)胞上的轉(zhuǎn)化生長因子受體I 型和II型受體以及糖基化-磷酯酰肌醇錨定的TGF-β結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定。M CellEndo, 111 -.57-66,1995。Frenkel SR, Toolan B, Menche D, Pitman MI 禾口 Pachence JM 用于軟骨修復(fù)的膠 原雙層基質(zhì)軟骨細(xì)胞移植。J Bone J Surg[Br]79-B :831-836，1997。Heine UI, Munoz EF, Flanders KC, Ellingsworth LR, Peter Lam H-Y, Thomp sonNL, Roberts AB和Sporn MB:轉(zhuǎn)化生長因子-β在小鼠胚胎發(fā)育中的作用J CellBiology,105 :2861_2876，1987。Jenks S 基因治療掌握基礎(chǔ)，限定細(xì)節(jié)[新聞]J Natl Cancer Inst, 89 (16)1182-1184，1997。Joyce Me, Roberts AB, Sporn MB 和 Bolander ME 轉(zhuǎn)化生長因子- β 和大鼠股骨 中軟骨生成和骨生成的引發(fā)。J Cell Biology, 110 :2195-2207，1990。Lind Μ, Schumacker B, Soballe K, Keller J, Melsen F 和 Bunger 轉(zhuǎn)化生長因子 β 增強家兔脛骨的骨折愈合。A Orthop Scand,64(5) :553_556，1993。Lopez-Casillas F,Chifetz S,Doody J,Andres JL,Lane WS MAssague J =TGF-β 受體系統(tǒng)膜蛋白多糖成分的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。Cell，67 :785-795，1991。Madri JA，Pratt BM和Tucker AM 轉(zhuǎn)化生長因子β對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的表型調(diào)節(jié) 依賴于胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)。J Cell Biology，106 :1375-1384，1988。Mankin HJ 關(guān)節(jié)軟骨對機械損傷的反應(yīng)。J Bone Joint Surg，52A :460_466， 1982。Massague, Ann. Rev. Biochem. 67 :753_791，1998。Matsumoto K, Matsunaga S, Imamura Τ, Ishidou Y, Yosida H Sakou T 骨折愈合 過程中轉(zhuǎn)化生長因子β的表達(dá)和分布，In vivo,8 =215-220,19940Miettinen PJ, Ebner R, Lopez AR 禾口 Derynck R TGF-β 誘導(dǎo)哺乳動物表皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)分化成間充質(zhì)細(xì)胞涉及I型受體。J Cell Biology，127-6 :2021-2036，1994。O，Driscoll, J.Bone Joint Surg.，80A :1795_1812，1998。OzkaynakΕ, Rueger DC, Drier EA, Corbett C禾口 Ridge RJ :OP-IcDNA編碼 TGF-β 家族的成骨蛋白。EMBO J,9 =2085-2093,1990oRosenburg L 關(guān)節(jié)軟骨研究中Safranin-O組織學(xué)用途的化學(xué)基礎(chǔ)。J BoneJoint Surg,53A :69-82，1971。Sampath TK, Rueger DC 骨生成蛋白-I (0P-1)的結(jié)構(gòu)、功能和矯形手術(shù)應(yīng)用。 Complications in Ortho,101—107,1994。Snyder SH 細(xì)胞之間通訊的分子基礎(chǔ)。Sci Am, 253 (4) 132-140，1985。Sporn MB 和 Roberts AB 肽生長因子是多功能的。Nature (London)，332 217-219. 1988。Wakefield LM, Smith DM, Flanders KC 和 Sporn MB 來自人血小板的潛在轉(zhuǎn)化生 長因子-β。J Biol chem，263，7646-7654，1988。Wolff JA 和 Lederberg J 基因轉(zhuǎn)移和治療的歷史。John A. Wolff 編。 GeneTherapeutics,3-25—1994. Birkhauser, Boston。Wrana JL, Attisano L, Wieser R, Ventura F 禾口 Massague J TGF-β 受體激活的 機制。Nature，370 :341-347，1994。
權(quán)利要求
一種軟骨細(xì)胞系的用途，所述細(xì)胞系在體外被與啟動子可操縱性連接的，編碼轉(zhuǎn)化生長因子β1的DNA序列轉(zhuǎn)染，其特征在于，所述細(xì)胞系用于制備治療關(guān)節(jié)炎或再生透明軟骨的藥物，所述細(xì)胞通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射實現(xiàn)直接引入哺乳動物宿主。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述DNA序列在病毒載體中。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
4.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是腺關(guān)聯(lián)病毒載體。
5.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是腺病毒載體。
6.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述病毒載體是單純皰疹病毒載體。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述重組載體是質(zhì)粒載體。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，在移植前先儲藏所述軟骨細(xì)胞系。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述軟骨細(xì)胞系在液氮下儲藏在10%DMSO中。
10.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染是通過脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉 淀、電穿孔和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)完成的。
11.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述啟動子是金屬硫蛋白I啟動子。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員的細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療，治療矯形外科疾病。證實了TGF-β基因治療可作為變性關(guān)節(jié)炎的新療法。在將TGF-βcDNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入成纖維細(xì)胞(NIH 3T3-TGF-β1)后，將該細(xì)胞注射入家兔跟腱和具有人為造成的軟骨缺損的膝關(guān)節(jié)中。進(jìn)行腱內(nèi)注射來確定其體內(nèi)表達(dá)的最佳濃度。制造了部分缺損軟骨模型來模仿膝關(guān)節(jié)的變性關(guān)節(jié)炎。新形成的透明軟骨覆蓋了用細(xì)胞-介導(dǎo)的基因治療方法治療的部分軟骨缺損，表明細(xì)胞存活并在該區(qū)域內(nèi)刺激基質(zhì)形成。完全除去軟骨的區(qū)域被纖維狀膠原覆蓋。
文檔編號C07K14/495GK101972275SQ20101052807
公開日2011年2月16日 申請日期2000年5月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月3日
發(fā)明者盧文鐘, 康庚愛, 李寬熙 申請人:組織基因股份有限公司