專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人凝血酶原復(fù)合物的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人凝血酶原復(fù)合物的制備工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人凝血酶原復(fù)合物含有維生素K依賴(lài)其在肝臟合成的四種凝血因子II、νπ、 χ、 X。維生素K缺乏和嚴(yán)重肝臟疾患均可造成這四個(gè)因子的缺乏。而上述任何一個(gè)因子的缺 乏都可導(dǎo)致凝血障礙。輸注人凝血酶原復(fù)合物能提高血液中凝血因子II、νπ、ιχ、X的濃度。 因此，主要用于治療先天性和獲得性凝血因子II、νπ、ιχ、X缺乏癥。標(biāo)準(zhǔn)的制法為；取健康 獻(xiàn)血員的新鮮分離液體血漿、冰凍血漿，用直接凝膠吸附法或低溫乙醇和聚乙二醇法自血 漿中分離蛋白并用國(guó)家認(rèn)可的方法提純。經(jīng)滅活病毒后配制成規(guī)定濃度的溶液，加適量穩(wěn) 定劑，除菌濾過(guò)，無(wú)菌灌裝，及時(shí)冷凍干燥制成?，F(xiàn)有技術(shù)中如公開(kāi)號(hào)CN 1475569Α，發(fā)明名 稱(chēng)《凍干人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法》，它包括有以下工序以F I I I沉淀為原料經(jīng)溶 解一低溫離心分離、過(guò)濾一凝膠吸附一洗滌、洗脫凝膠一超濾濃縮一S / D滅活病毒一二 次凝膠吸附一洗滌和洗脫凝膠一超濾透析一微孔膜除菌過(guò)濾分裝一冷凍干燥，將凍干人凝 血酶原復(fù)合物置于9 8 — 1 O O °C的沸水浴中進(jìn)行干熱滅活3 O分鐘。該凍干人凝血酶原 復(fù)合物具有I X因子含量大于2 O 1 O / m 1，I X因子比活性大于O . 6 1 O / a g蛋 白的歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)及病毒滅活更徹底，使用更安全的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采取凝膠直接從血漿吸附人凝血酶原復(fù)合物，在提取整 個(gè)過(guò)程只采用凝膠層析技術(shù)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，減少了各種因素對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的污染， 同時(shí)產(chǎn)品的得率提高，經(jīng)過(guò)二次病毒滅活顯著提高了臨床用藥的安全性的人凝血酶原復(fù)合 物的制備工藝。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，其制備工藝如下
(1)、吸附
將符合藥典要求的去除冷沉淀的血漿升溫至8-10°C，按該血漿量的0. 8-1. 5%加入用 平衡液預(yù)平衡的A-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘以上，收集凝膠，上清液并入血漿罐中；
(2)、洗滌
用每次不少于步驟(1)得的凝膠量的1倍體積的洗滌液洗滌該凝膠2-3次，每次攪拌 均勻后放干，收集洗滌液并入血漿罐中；
(3)、洗脫
用每次不少于步驟(2)得的洗滌后的凝膠量的1倍體積的洗脫液洗脫該凝膠3次，每 次攪拌10分鐘放干，收集洗脫后的蛋白洗脫液于干凈的容器中；用0. 45-1.0濾芯的澄清濾 器過(guò)濾收集的過(guò)濾后的蛋白過(guò)濾液；
(4)、超濾
進(jìn)行3次以上超濾透析，每次用與步驟(3)得的蛋白過(guò)濾液等體積透析液進(jìn)行超濾透析，濃縮收集濃縮液，使透析出液電導(dǎo)值低于15ms，效價(jià)在20-50IU/ml，稱(chēng)重濃縮液量，PH 在 6. 5-7. 5 ；
(5)、用S/D法病毒滅活
按步驟(4)的濃縮液總量的10%加入11%S/D溶液攪拌均勻，得蛋白混合液，把蛋白混 合液轉(zhuǎn)移至滅活罐；攪拌升溫至24-26°C連續(xù)保溫6小時(shí)，每半小時(shí)記錄蛋白混合液溫度一 次；
(6)、再吸附純化
①凝膠柱及A-50凝膠處理使用0.5mol/LNa0H涂抹凝膠柱，A-50凝膠使用0. 5mol/ LNaOH浸泡2小時(shí);
②超濾機(jī)用注射用水沖洗至中性；
③吸附將S/D滅活后的蛋白混合液，攪拌，按血漿量的1.0-1. 5%加入用平衡液預(yù)平衡 好的A-50凝膠，吸附45分鐘以上，收集凝膠，流出液棄；
④洗滌用每次不少于步驟③得的凝膠量的1倍體積的S/D洗滌液洗滌該凝膠10次， 每次攪拌均勻后放干，洗滌流出液棄；
⑤洗脫用每次不少于步驟④得的洗滌后的凝膠量的1倍體積的洗脫液洗脫該凝膠3 次，每次攪拌20分鐘放干，收集洗脫后的蛋白洗脫液于干凈的容器中；
⑥用0.45-1. 0濾芯的澄清濾器過(guò)濾步驟⑤得的的蛋白洗脫液，收集的過(guò)濾后的蛋白 過(guò)濾液；
⑦超濾進(jìn)行3次以上超濾透析，每次用與步驟⑥得的蛋白過(guò)濾液等體積透析液進(jìn)行 超濾透析，使透析出液電導(dǎo)值低于10 ms，開(kāi)始進(jìn)行濃縮，濃縮液效價(jià)在30IU/ml以上，濃縮 后把濃縮液轉(zhuǎn)入配制罐，稱(chēng)重濃縮液量，調(diào)整PH為6. 5-7. 5，攪拌均勻后取20ml，3瓶樣品 做原液檢定；根據(jù)檢定結(jié)果配液，以總效價(jià)的0. 2倍加入肝素鈉，最終按制品重量加入甘氨 酸，使甘氨酸含量為2%;
(7)、分裝；
根據(jù)稀配液效價(jià)，確定分裝量，用0. 2濾芯(PVDF)除菌分裝；
(8)、凍干；
①制品常溫進(jìn)柜，
②隔板10分鐘從常溫降至0°C，保持30分鐘；
③隔板30分鐘從0°C降到_40°C，在_40°C保持1.5小時(shí)；
④開(kāi)真空泵到真空達(dá)到0.3mbar穩(wěn)定；
⑤1小時(shí)隔板升溫到_33°C，保持1小時(shí)；
⑥5小時(shí)隔板升溫到0°C，保持30小時(shí)；
⑦2小時(shí)隔板升溫到10°C，保持6小時(shí)；
⑧2小時(shí)隔板升溫到35°C，保持6小時(shí)；
⑨1小時(shí)使真空到0.05mbar，保持1小時(shí)；
(9)、干熱滅活；
用99. 5 士 0. 5 °C水浴干熱滅活30分鐘；
其中
平衡液含0. 08mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ；洗滌液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； S/D洗滌液含0. 05 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； 洗脫液含2mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水； 透析液含0. 01mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； 11%S/D溶液按IlOml吐溫-80和33ml TNBP加水至IL的方法制備； 以上百分比除特別說(shuō)明，其余均為重量百分比。本發(fā)明使用先進(jìn)的層析技術(shù)，采取凝膠直接從血漿吸附人凝血酶原復(fù)合物，在提 取整個(gè)過(guò)程只是采用先進(jìn)的凝膠層析技術(shù)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，減少了各種因素對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn) 過(guò)程中的污染，同時(shí)產(chǎn)品的得率提高25-30%。此外生產(chǎn)過(guò)程中采用S/D法去除脂包膜病毒 及99. 5士0. 5°C干熱法去除非脂包膜病毒，經(jīng)過(guò)這2次病毒滅活步驟顯著提高了臨床用藥 的安全性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
一、基本要求
1、原料血漿的采集和質(zhì)量應(yīng)符合血液制品生產(chǎn)用人血漿的規(guī)定；
2、血漿應(yīng)無(wú)凝塊，無(wú)纖維蛋白析出，無(wú)溶血等；
3、血漿去除冷沉淀，凝血因子八等；
4、生產(chǎn)設(shè)備管線(xiàn)器具應(yīng)清潔消毒等。二、主要試劑配制
配制平衡液含0. 08mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； 配制洗滌液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； 配制S/D洗滌液含0.05 mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在 6. 8-7. 2 ；
配制洗脫液含2mol/L NaCl和0. 02mol/L檸檬酸三納，余量為水； 配制透析液含0. 01mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6. 8-7. 2 ； 11%S/D 配方=IlOml 吐溫-80+TNBP33ml 加水至 IL ； 2mol/L冰乙酸配比1200ml冰乙酸至10000ml注射用水； 0. 5mol/LNaOH 配比200gNa0H 至 10000ml 注射用水； 0. Imol/LNaOH 配比40gNa0H 至 10000ml 注射用水；
三、本發(fā)明具體實(shí)施方式
在發(fā)明內(nèi)容中得以體現(xiàn)，發(fā)明內(nèi)容可以直接用于實(shí)施例。制備工藝如發(fā)明內(nèi)容中所述的對(duì)血漿進(jìn)行吸附、洗滌、洗脫及澄清過(guò)濾；病毒滅活 (S/D法)；再吸附純化；分裝；凍干；干熱滅活。在配液中加入肝素鈉，按效價(jià)的0. 2加肝素鈉的量的計(jì)算方法為
加入肝素鈉的量=蛋白濃縮液總量_(L) X效價(jià)_IU/mlX0. 2X1000= _IU
權(quán)利要求
一種人凝血酶原復(fù)合物的制備工藝，其特征是制備工藝如下(1)、吸附將符合藥典要求的去除冷沉淀的血漿升溫至8 10℃，按該血漿量的0.8 1.5%加入用平衡液預(yù)平衡的A 50凝膠，攪拌吸附45 60分鐘以上，收集凝膠，上清液并入血漿罐中；(2)、洗滌用每次不少于步驟(1)得的凝膠量的1倍體積的洗滌液洗滌該凝膠2 3次，每次攪拌均勻后放干，收集洗滌液并入血漿罐中；(3)、洗脫用每次不少于步驟(2)得的洗滌后的凝膠量的1倍體積的洗脫液洗脫該凝膠3次，每次攪拌10分鐘放干，收集洗脫后的蛋白洗脫液于干凈的容器中；用0.45 1.0濾芯的澄清濾器過(guò)濾收集的過(guò)濾后的蛋白過(guò)濾液；(4)、超濾進(jìn)行3次以上超濾透析，每次用與步驟(3)得的蛋白過(guò)濾液等體積透析液進(jìn)行超濾透析，濃縮收集濃縮液，使透析出液電導(dǎo)值低于15ms，效價(jià)在20 50IU/ml，稱(chēng)重濃縮液量，PH在6.5 7.5；(5)、用S/D法病毒滅活按步驟(4)的濃縮液總量的10%加入11%S/D溶液攪拌均勻，得蛋白混合液，把蛋白混合液轉(zhuǎn)移至滅活罐；攪拌升溫至24 26℃連續(xù)保溫6小時(shí)，每半小時(shí)記錄蛋白混合液溫度一次；(6)、再吸附純化①凝膠柱及A 50凝膠處理使用0.5mol/LNaOH涂抹凝膠柱，A 50凝膠使用0.5mol/LNaOH浸泡2小時(shí)；②超濾機(jī)用注射用水沖洗至中性；③吸附將S/D滅活后的蛋白混合液，攪拌，按血漿量的1.0 1.5%加入用平衡液預(yù)平衡好的A 50凝膠，吸附45分鐘以上，收集凝膠，流出液棄； ④洗滌用每次不少于步驟③得的凝膠量的1倍體積的S/D洗滌液洗滌該凝膠10次，每次攪拌均勻后放干，洗滌流出液棄；⑤洗脫用每次不少于步驟④得的洗滌后的凝膠量的1倍體積的洗脫液洗脫該凝膠3次，每次攪拌20分鐘放干，收集洗脫后的蛋白洗脫液于干凈的容器中；⑥用0.45 1.0濾芯的澄清濾器過(guò)濾步驟⑤得的的蛋白洗脫液，收集的過(guò)濾后的蛋白過(guò)濾液；⑦超濾進(jìn)行3次以上超濾透析，每次用與步驟⑥得的蛋白過(guò)濾液等體積透析液進(jìn)行超濾透析，使透析出液電導(dǎo)值低于10 ms，開(kāi)始進(jìn)行濃縮，濃縮液效價(jià)在30IU/ml以上，濃縮后把濃縮液轉(zhuǎn)入配制罐，稱(chēng)重濃縮液量，調(diào)整PH 為6.5 7.5，攪拌均勻后取20ml，3瓶樣品做原液檢定；根據(jù)檢定結(jié)果配液，以總效價(jià)的0.2倍加入肝素鈉，最終按制品重量加入甘氨酸，使甘氨酸含量為2%；(7)、分裝；(8)、凍干；①制品常溫進(jìn)柜，②隔板10分鐘從常溫降至0℃，保持30分鐘；③隔板30分鐘從0℃降到 40℃，在 40℃保持1.5小時(shí)；④開(kāi)真空泵到真空達(dá)到0.3mbar穩(wěn)定；⑤1小時(shí)隔板升溫到 33℃，保持1小時(shí)；⑥5小時(shí)隔板升溫到0℃，保持30小時(shí)；⑦2小時(shí)隔板升溫到10℃，保持6小時(shí)；⑧2小時(shí)隔板升溫到35℃，保持6小時(shí)；⑨1小時(shí)使真空到0.05mbar，保持1小時(shí)；(9)、干熱滅活；其中平衡液含 0.08mol/L NaCl和0.02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6.8 7.2；洗滌液含0.14 mol/L NaCl和0.02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6.8 7.2；S/D洗滌液含0.05 mol/L NaCl和0.02mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6.8 7.2；洗脫液含2mol/L NaCl和0.02mol/L檸檬酸三納，余量為水；透析液含0.01mol/L檸檬酸三納，余量為水，PH在6.8 7.2；11%S/D溶液按110ml吐溫 80和33ml TNBP加水至1L的方法制備；以上百分比除特別說(shuō)明，其余均為重量百分比。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人凝血酶原復(fù)合物的制備工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域，制備工藝包括對(duì)血漿進(jìn)行吸附、洗滌、洗脫及澄清過(guò)濾；病毒滅活(S/D法)；再吸附純化；分裝；凍干；干熱滅活；本發(fā)明采取凝膠直接從血漿吸附人凝血酶原復(fù)合物，在提取整個(gè)過(guò)程只用凝膠層析技術(shù)，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，減少了各種因素對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的污染，同時(shí)產(chǎn)品的得率提高25-30%。此外生產(chǎn)過(guò)程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99.5±0.5℃干熱法去除非脂包膜病毒，經(jīng)過(guò)這2次病毒滅活步驟顯著提高了臨床用藥的安全性。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101974070SQ20101053482
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者何淑琴, 廖昕晰, 徐建新, 梁小明, 鄧志華 申請(qǐng)人:江西博雅生物制藥股份有限公司