專利名稱：乙肝治療性疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙肝治療性疫苗。
背景技術(shù)：
盡管可以接種有效的預(yù)防性HBV疫苗，全世界現(xiàn)在仍有3. 5億HBV攜帶者，僅在中國就有9300萬人慢性感染HBV，大約15-40%的感染病人可能發(fā)展為威脅生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌等，慢性HBV感染嚴(yán)重危害公眾健康?，F(xiàn)有的用于慢性乙肝患者的治療方法包括IFN-α和核苷或核苷類似物(如拉咪呋啶、阿德福韋和恩替卡韋)，治療成本高，只有部分效果，而且會引起突變增加HBV耐藥性。因此，迫切需要開發(fā)新的治療性疫苗以補(bǔ)充或替代現(xiàn)有的抗病毒治療方案。由于清除HBV病毒主要是由病毒特異性CTL 和輔助性T細(xì)胞反應(yīng)介導(dǎo)，慢性病毒感染的特征是T細(xì)胞反應(yīng)低下，所以T細(xì)胞在控制和清除病毒感染方面起著重要作用。乙肝核心抗原(HBcAg)和乙肝表面抗原(HBsAg)是HBV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。已經(jīng)有研究表明在成功清除HBV的急性感染患者中，與那些慢性感染患者體內(nèi)微弱的和單一的T細(xì)胞反應(yīng)形成對比，靶向這兩種抗原表位的多種特異性CD8+T細(xì)胞更容易被檢測到，說明HBcAg和HBsAg特異性T細(xì)胞反應(yīng)在控制HBV感染能力方面具有重要作用，而且有研究報(bào)道HBV侵染過程中，HBcAg特異性⑶8+Τ細(xì)胞與病毒控制相關(guān)。熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)具有獨(dú)特的免疫學(xué)功能，其免疫學(xué)機(jī)制包括兩方面。一是HSPs參與T細(xì)胞抗原呈遞。熱休克蛋白存在于細(xì)胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，由多個(gè)成員組成HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。熱休克蛋白作為分子伴侶在蛋白折疊與運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用，能結(jié)合細(xì)胞中5-25mer的抗原多肽，通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面 CD91分子進(jìn)入細(xì)胞并將結(jié)合的抗原表位呈遞給MHCI類和II類分子從而啟動特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)。二是HSPs有效激發(fā)天然免疫。熱休克蛋白本身是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的來源于哺乳動物細(xì)胞的天然佐劑，它可作用于APC及T細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞，促進(jìn)DC成熟，刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)。有研究表明gp96 對于APC中Toll樣受體(Toll-likerec^ptorsTLRs)發(fā)揮免疫學(xué)功能起至關(guān)重要的作用， gp96基因缺失的DC細(xì)胞中TLRs喪失引發(fā)天然免疫的功能，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗感染的能力明顯降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供乙肝治療性疫苗。本發(fā)明提供的乙肝治療疫苗，它的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原 (HBsAg)和乙肝核心蛋白(HBcAg)；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白(HBcAg)由序列表的序列3所示。所述乙肝治療疫苗的活性成分可由所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白組成。所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白的質(zhì)量配比可為1 (0.5-10) (0. 5-10)，優(yōu)選為 1 1 1。所述乙肝治療疫苗的活性成分還可由含有所述gp96蛋白的編碼基因的質(zhì)粒 pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBc、所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白組成。所述gp96蛋白的編碼基因可如序列表的序列2所示；所述乙肝表面抗原的編碼基因可如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白的編碼基因可由序列表的序列4所示。所述質(zhì)粒pcDNA-gp96可為在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列2所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)；所述質(zhì)粒pcDNA-HBs可為在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列6所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)；所述質(zhì)粒pcDNA-HBc可為在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列4所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述質(zhì)粒 pcDNA-gp96、所述質(zhì)粒pcDNA-HBs和所述質(zhì)粒pcDNA-HBc的質(zhì)量配比可為1 (0.5-10)( 0. 5-10) (0. 5-5) (0. 5-5) (0.5-5)；所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述質(zhì)粒pcDNA-gp96、所述質(zhì)粒pcDNA-HBs和所述質(zhì)粒pcDNA-HBc的質(zhì)量配比優(yōu)選為 1 1 1 1 1 1 或 1 1 1 2 2 2。本發(fā)明還保護(hù)一種乙肝治療疫苗，它的活性成分由含有g(shù)p96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白組成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。本發(fā)明還保護(hù)一種乙肝治療疫苗，其特征在于它的活性成分由含有所述gp96蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBs、 含有所述乙肝核心蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBc、含有g(shù)p96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白組成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。所述含有g(shù)p96蛋白的提取物可為將離體動物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細(xì)胞的勻漿液依次進(jìn)行ConA-S^harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的； 所述離體動物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞H印G2或黑色素瘤細(xì)胞B16 ；所述ConA-S印harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0. 25ml/min ； (2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為 0. 5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM; (3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0. 25ml/min,收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為 200mM pH7. 5的PBS中加α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min ； (b)用5ml NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ； (c)用IOml NaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ； (d)用3ml NaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min，得到的洗脫液即為含有g(shù)p96蛋白的提取物。本發(fā)明提供的乙肝治療疫苗可以有效抑制HBV復(fù)制，清除感染肝臟的病毒，對于乙肝防治具有重大價(jià)值。


圖1為HBsAg、HBcAg和gp96表達(dá)產(chǎn)物的鑒定。圖2為HBcAg溶液的SDS-PAGE和western鑒定結(jié)果。圖3為rgp96蛋白的鑒定圖譜；1 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 步驟(二)的發(fā)酵液；3 親和層析后的洗脫液；4 離子交換層析后的洗脫液；5 :rgp96蛋白的western blot。圖4gp96提取物的鑒定圖譜。圖5為人胎盤組織制備的gp96提取物的SDS-PAGE和western鑒定結(jié)果。圖6為各種gp96提取物和重組gp96的SDS-PAGE電泳圖。圖7為通過流式細(xì)胞儀鑒定gp96可以激活特異性CTL反應(yīng)的結(jié)果。圖8為通過ELISP0T鑒定gp96可以激活T細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)果。圖9為免疫后小鼠特異性T細(xì)胞的ELISP0T檢測和T細(xì)胞增殖能力測定結(jié)果。圖10為免疫后小鼠血清HBsAg抗體水平檢測結(jié)果。圖11為治療性疫苗誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性T細(xì)胞和抗體檢測結(jié)果。圖12為rgp96蛋白下調(diào)HBV小鼠Treg水平。圖13為HBV小鼠實(shí)驗(yàn)血清S抗原、HBV DNA及ALT和鼠肝臟HBc免疫組化檢測結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。抗CD4的抗體購自BioLegend，產(chǎn)品目錄號100407?？笴D8的抗體購自BioLegend， 產(chǎn)品目錄號100705。抗CD25的抗體購自BioLegend，產(chǎn)品編號101906?？笷oxP3的抗體購自eBioscience，產(chǎn)品目錄號77-5775 ；HRP標(biāo)記的IgG抗體、HRP標(biāo)記的IgGl抗體、HRP 標(biāo)記的IgG2a抗體均購自SER0TEC公司，產(chǎn)品號分別為STARl 17P，STAR132P，STAR133P ；TMB 顯色液購自江蘇碧云天公司，產(chǎn)品號P0209 ；抗HBcAg抗體購自santa cruz，產(chǎn)品目錄號為 sc-52407 ；抗HBsAg抗體購自santa cruz，產(chǎn)品目錄號為sc_57761。人肝癌細(xì)胞H印G2購自 ATCC，產(chǎn)品號 HB-8065。熱休克蛋白(gp96蛋白)的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼序列如序列表的序列2所示。乙肝核心抗原Ofepatitis B Core Antigen，HBcAg)，其氨基酸序列如序列表的序列3所示，編碼基因如序列表的序列4所示。乙肝表面抗原OfepatitisB Surface Antigen, HBsAg)，其氨基酸序列如序列表的序列5所示，編碼基因如序列表的序列6所示。實(shí)施例1、HBsAg基因、HBcAg基因和gp96基因的表達(dá)能力驗(yàn)證一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建制備序列表的序列2所示的DNA，插入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3. 1 (購自Invitrogen公司，產(chǎn)品編號V790-20)的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒 pcDNA-gp96。制備序列表的序列2所示的DNA，插入pEGFP_Nl的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-gp96。制備序列表的序列4所示的DNA，插入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3. 1的EcoR I和 Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pcDNA-HBcAg(pcDNA-HBc)。制備序列表的序列6所示的DNA，插入哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3. 1的EcoR I和 Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pcDNA-HBsAg(pcDNA-HBs)。二、基因的表達(dá)能力檢測將重組質(zhì)粒pcDNA-gp96轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；將pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，作為陰性對照；將293T細(xì)胞作為空白對照；48小時(shí)后western檢測蛋白水平。結(jié)果見圖1A。重組質(zhì)粒 pcDNA-gp96轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熱休克蛋白gp96的含量遠(yuǎn)高于空白對照和陰性對照。將重組質(zhì)粒pEGFP-Nl-gp96轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞，24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察EGFP 熒光水平，見圖lC，pEGFP-Nl-gp96表達(dá)60-70%。將pEGFP-Nl轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞，24小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光水平，見圖IB，pEGFP-Nl表達(dá)70-80%。將重組質(zhì)粒pcDNA-HBcAg轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；將pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，作為陰性對照；將293T細(xì)胞作為空白對照；48小時(shí)后通過ELISA檢測HBcAg，見圖1E。將重組質(zhì)粒pcDNA-HBsAg轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；將pcDNA3. 1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，作為陰性對照；將293T細(xì)胞作為空白對照；48小時(shí)后通過ELISA檢測HBsAg，見圖1D。 實(shí)施例2、HBcAg的制備1、制備序列4所示的DNA，插入原核表達(dá)載體pGEX (購自GE公司，產(chǎn)品號 28-9546-48，載體上帶有GST標(biāo)簽)的BamHl和Xhol酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒 pGEX-HBcAg。2、將重組質(zhì)粒pGEX-HBcAg導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α (購自天根生化科技公司，產(chǎn)品號 CB101-03)，得到重組菌。3、將重組菌接種于LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD 0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 5mM, 37°C
繼續(xù)培養(yǎng)4h。4、收集菌體在冰浴條件下超聲破碎(200W，破碎4s停6s，99次3個(gè)循環(huán))，4°C下 12000轉(zhuǎn)/min離心20min。收集上清。5、將上清4°C進(jìn)行親和層析，載體為Glutathione-S印harose 4B (購自GE公司， 產(chǎn)品編號17-5132-01)，采用還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(lOmmol/L reducedglutathione, 50mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)洗脫，收集洗脫液。6、將洗脫液用超濾濃縮法更換成酶切緩沖體系(50mmol/L Tris-HCl, pH8. O ； 150mmol/L NaCl ； lmmol/L DTT ； lmmol/L EDTA, ρΗ 8· 0)，加入過量 PreScission Protease 酶(PSP蛋白；購自GE公司，產(chǎn)品編號27-0843-01)，4°C酶切16h。7、將酶切后的酶切體系用超濾濃縮法更換成PBS緩沖液，然后進(jìn)行親和層析，載體為Glutathione-S印harose 4B，采用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，GST和PSP結(jié)合到層析柱上， 收集洗脫液，即為HBcAg蛋白(溶液)。將HBcAg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和western鑒定。western鑒定所用的一抗為抗HBcAg抗體(購自santa cruz，產(chǎn)品目錄號為sc-52407)。步驟5的洗脫液的SDS-PAGE電泳圖見圖2的泳道2，HBcAg溶液的SDS-PAGE電泳圖見圖2的泳道3，western鑒定圖見圖2的泳道4。8、利用TritonX-114萃取法去除內(nèi)毒素取HBcAg蛋白加入Triton X-114 (Triton X-114的體積百分含量為1 % )，4°C混勻30min，置于37°C水浴中l(wèi)Omin，4°C 20000g離心lOmin，取上清(含有HBcAg蛋白)；重復(fù)上述步驟兩次，得到去除內(nèi)毒素的HBcAg(內(nèi)毒素去除率達(dá)到99% )，將其用于實(shí)施例6和 7的免疫。采用鱟試劑法檢測去除內(nèi)毒素的HBcAg中的內(nèi)毒素含量(唐寶璋燕奎華黃禮云莊林游晶陳紅英.慢性乙型肝炎患者血清內(nèi)毒素、IL-4、IL-18水平的變化.世界華人消化雜志，2003，11 (12) =2041-2.) ο內(nèi)毒素濃度低于10EU/mg。實(shí)施例3、重組gp96蛋白(rgp96)的制備一、重組質(zhì)粒 pHFMDZ-RlL2GAmy_gp96 的構(gòu)建1、提取人肝癌細(xì)胞H印G2的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。上游引物5，-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3，；下游引物5，-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3，。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pHFMDZ-RIA (購自Invitrogen公司， 產(chǎn)品號V20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl_gp96。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl_gp96的骨架載體為pHFMDZ-RIA，在EcoRI和 XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了 gp96蛋白的編碼序列)。6、在重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl-gp96的BglII酶切位點(diǎn)插入LEU2片段(序列表的序列 3所示的DNA)，BamHI酶切位點(diǎn)插入α -淀粉酶報(bào)告系統(tǒng)(序列表的序列4所示的DNA)，得到重組質(zhì)粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96。二、rgp96蛋白的表達(dá)1、采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購自ATCC，產(chǎn)品號MYA-335)細(xì)胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mL SD液體培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號 GMS12117. 7)，37°C培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到IOOmL SYN6培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司， 產(chǎn)品號GMS12116. 1)，30°C培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2L SYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)；使用氨水控制pH維持在5. 5 ；每4h檢測1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0. 5%左右，同時(shí)控制溶氧在20%以上；根據(jù)菌體的生成情況檢測菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/L的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開始誘導(dǎo)重組rgp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0. 5-0. 8%左右)，誘導(dǎo)開始72小時(shí)后停止發(fā)酵。三、rgp96蛋白的分離純化將步驟(二)的發(fā)酵液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(DYNO-MILL model KDL)中，按照廠家提供的操作手冊使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞；破碎后的細(xì)胞12000轉(zhuǎn)/min離心20min，收集上清液；上清液用0. 45 μ m濾膜進(jìn)行過濾，得到濾液，將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下采用英俊公司(Invitrogen Corporation) 的Ni-NTA Purification System進(jìn)行親和層析，主要步驟為先用PBS平衡柱子2h ；然后用 PBS (含20mM咪唑)平衡柱子2h ；將濃縮液用PBS (含20mM咪唑)稀釋后上樣；用PBS (含 20mM咪唑)沖洗柱子至OD值< 0. 01 ；用PBS (含200mM咪唑)洗脫1. 5h，收集洗脫液(即為rgp96蛋白)；所有操作在4°C下進(jìn)行，流速為0. 5mL/min。每升步驟(二)的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90%以上的rgp96蛋白。 如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液進(jìn)行離子交換層析(Q柱)，主要步驟200mM NaCl的PBS液平衡；上樣；300mM NaCl的PBS液洗雜質(zhì)；800mM NaCl的PBS 液洗目的蛋白。將步驟(二)的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液(rgp96蛋白)和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10% SDS-PAGE，然后進(jìn)行考染，見圖3。rgp96蛋白的純度達(dá)90%以上。將rgp96 蛋白進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santa cruz，產(chǎn)品號sc-56399)，見圖3。實(shí)施例4、gp96提取物的制備用小鼠肝臟制備gp96提取物，方法如下1、組織勻漿勻漿緩沖液配方在pH7. 0的碳酸氫鈉緩沖液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式為 C7H7FO2S)至終濃度ImM(置于冰上的燒杯中配置；PMSF在水溶液中數(shù)小時(shí)內(nèi)分解，該溶液不可過夜)。取燒杯置于冰上，將BALB/c小鼠肝組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1_2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液；將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上；勻漿液倒入離心管，50，OOOg離心60min，取上清加入 1/10 體積的 10XPBS(pH7. 5，200mM NaCl)，用于步驟 2 的 ConA-S印harose 層析。2、ConA-S印harose 層析載體為ConA-S印harose (購自GE公司，產(chǎn)品號17-0440-01)，按“ Iml載體/4g組織”計(jì)算使用量。層析柱的內(nèi)徑和柱長是1. 6X2. 5cm。將上清用蠕動泵上樣，0. 25ml/min。在PBS (ρΗ7· 5，200mM NaCl)中加PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液甲；用蠕動泵將10倍柱體積的洗脫液甲過層析柱(0. 5ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。在PBS (pH7. 5，200mM NaCl)中加α-D-卩比喃葡萄糖至終濃度10% (10g/mL)，加 PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液乙；用蠕動泵將3倍柱體積的洗脫液乙過層析柱(0. 25ml/ min)，收集洗脫液。3^HiTrap-Q S印harose 離子交換層析載體為HiTrap-Q Sepharose (層析柱為HiTrap Q HP ；購自GE公司，產(chǎn)品號 17-1153-01)。層析柱的內(nèi)徑和柱長是0. 7X2. 5cm。將載體裝柱后，先用5ml PBS (pH7. 5，200mM NaCl)清洗(lml/min)。將步驟2的洗脫液上樣(lml/min)；然后將5ml PBS (pH7. 5, 200mM NaCl)過層析柱(lml/min)，以去除未結(jié)合蛋白；然后將IOml PBS(pH7. 5, 300mM NaCl)過層析柱(lml/min)，以去除未結(jié)合蛋白；然后將3ml PBS (pH7. 5，600mM NaCl)過層析柱(lml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物(mgp96)。將gp96提取物進(jìn)行10% SDS-PAGE,然后考染，見圖4的泳道1。將gp96提取物進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santa cruz，產(chǎn)品號sc-56399)，見圖4 的泳道2。除了小鼠肝臟，也可用如下組織中制備gp96提取物小鼠黑色素瘤(B16)、豬肝臟、人肝癌細(xì)胞系HepG2培養(yǎng)細(xì)胞、臨床手術(shù)切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、 腸癌、肝癌、胃癌)和人胎盤；提取方法參照小鼠肝臟的提取。圖5為用人胎盤組織制備的 gp96提取物的SDS-PAGE電泳圖(泳道2)和western鑒定圖(泳道3)。用多種哺乳動物組織制備的gp96提取物、用各種腫瘤組織制備的gp96提取物和用釀酒酵母或畢氏酵母表達(dá)的重組gp96蛋白的SDS-PAGE電泳圖見圖6。實(shí)施例5、rgp96蛋白和gp96提取物對特異性T細(xì)胞反應(yīng)的激活HBcAg87-95 是乙肝核心蛋白表位87_95，序列為SYVNTNMGL，由上海吉爾生化公司合成。rgp96為實(shí)施例3制備的rgp96蛋白。mgp96為實(shí)施例4制備的gp96提取物。6-8周齡的雌性BALB/c(H-2d)小鼠分成四組，每組6_8只，分別進(jìn)行免疫(每次各組的免疫體積相同)第一組(rgp96)每只小鼠每次免疫50 μ g HBcAg87_95 和 20 μ g rgp96 ；第二組(mgp96)每只小鼠每次免疫50 μ g HBcAg87_95 和 20 μ g mgp96 ；第三組(FA/IFA ；陽性對照)每只小鼠每次免疫50 μ g HBcAg87_95和弗氏佐劑；第四組(PBS ；陰性對照)每只小鼠每次免疫PBS。gp96 (rgp96或mgp96)與HBcAg87_95免疫前50°C孵育10分鐘，然后室溫放置30 分鐘以形成蛋白多肽復(fù)合物。分別于第1、2、4周各進(jìn)行一次皮下免疫，最后一次免疫1周后處死小鼠分離脾細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(采用FITC標(biāo)記的抗CD8的抗體和PE標(biāo)記的Pentamer)和ELISP0T檢測，考察小鼠脾細(xì)胞中⑶8+T細(xì)胞數(shù)量和肽特異性CTL。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖7。用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖7A，CD8+T細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例見圖7C，HBcAg87-95特異性⑶8+T細(xì)胞占⑶8+T細(xì)胞的比例見圖7B。第一組和第二組的HBcAg87-95特異性CTL明顯高于第三組和第四組，第一組和第二組之間沒有顯著差異。 第一組、第二組和第三組⑶8+T細(xì)胞明顯高于第四組。即用mgp96(或rgp96)作為佐劑與 HBcAg87-95聯(lián)合免疫，可以使CD8+T細(xì)胞和HBcAg87_95特異性CTL明顯增加(P < 0. 01)， mgp96和rgp96引發(fā)的CLT沒有明顯區(qū)別(P > 0. 01)。ELISP0T分析結(jié)果見圖8。與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致。說明mgp96和rgp96均具有很強(qiáng)的免疫佐劑功能，二者均能激活特異性T細(xì)胞反應(yīng)。采用同樣的方法檢測從各個(gè)組織(小鼠肝臟、豬肝臟、人胎盤、黑色素瘤、乳腺癌、 腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌、胃癌)中制備的gp96提取物的免疫活性，ELISP0T驗(yàn)證各個(gè) gp96提取物均能刺激產(chǎn)生抗原肽特異性CTL (所有P < 0. 01)。實(shí)施例6、免疫方法的比較實(shí)施例中用于蛋白免疫的HBcAg是實(shí)施例2中制備得到的去除內(nèi)毒素的HBcAg。實(shí)施例中用于蛋白免疫的HBsAg購自北京天壇生物制品股份有限公司，批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字S10980007。實(shí)施例中用于蛋白免疫的rgp96是實(shí)施例3中制備得到的rgp96。實(shí)施例中用作 DNA免疫的為實(shí)施例1中制備的重組質(zhì)粒pcDNA-gp96、重組質(zhì)粒pcDNA-HBcAg (pcDNA-HBc) 和重組質(zhì)粒pcDNA-HBsAg(pcDNA-HBs)。gp96佐劑指的是重組質(zhì)粒pcDNA_gp96或rgp96。進(jìn)行蛋白免疫前，將用于免疫的蛋白在組裝體系中進(jìn)行組裝。組裝體系的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下20mM HEPES (pH7. 2), 20mM NaCl,2mM MgCl2, IOOmM KCl, ImM PMSF ； 組裝條件:45°C 10分鐘(也可采用450C 10-30分鐘，或4°C 30-120分鐘)。rgp96與HBcAg、 HBsAg的添加比例為1 (0.5-10) (0.5-10)。gp96的蛋白用量為10-200微克/次，DNA 載體用量為20-500微克/次。HBcAg和HBsAg用量為5-2000微克/次，DNA載體用量為 5-2000微克/次。使用方式為皮下注射、皮內(nèi)注射或肌肉注射等。設(shè)計(jì)3種免疫方案DNA免疫，蛋白免疫和DNA初免-蛋白加強(qiáng)免疫方案。首先測定哪種方法能最大程度誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，6-8周齡的雌性BALB/c小鼠用HBs和HBc DNA,或者 HBs和HBc蛋白，或者DNA初免-蛋白加強(qiáng)方法免疫3次，添加或不加gp96作為佐劑，具體實(shí)驗(yàn)分組如表1所示。表1各組BALB/c小鼠的免疫情況
權(quán)利要求
1.一種乙肝治療疫苗，它的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白； 所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
2.如權(quán)利要求1所述的乙肝治療疫苗，其特征在于所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白的質(zhì)量配比為1 (0.5-10) (0.5-10)，優(yōu)選為1 1 1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的乙肝治療疫苗，其特征在于它的活性成分由所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的乙肝治療疫苗，其特征在于它的活性成分由含有所述gp96蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的編碼基因的質(zhì)粒 pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBc、所述gp96蛋白、所述乙肝表面抗原和所述乙肝核心蛋白組成。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述gp96蛋白的編碼基因如序列表的序列 2所示；所述乙肝表面抗原的編碼基因如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白的編碼基因由序列表的序列4所示。
6.如權(quán)利要求4或5所述的乙肝治療疫苗，其特征在于所述質(zhì)粒pcDNA-gp96是在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列2所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)；所述質(zhì)粒pcDNA-HBs是在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列6所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)；所述質(zhì)粒pcDNA-HBc是在載體pcDNA3. 1的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列4所示的DNA得到的重組質(zhì)粒，所述多克隆位點(diǎn)優(yōu)選為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的乙肝治療疫苗，其特征在于所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述質(zhì)粒pcDNA-gp96、所述質(zhì)粒pcDNA-HBs和所述質(zhì)粒 pcDNA-HBc 的質(zhì)量配比為 1 (0. 5-10) (0. 5-10) (0.5-5) (0.5-5) (0.5-5); 所述gp96蛋白、所述乙肝核心蛋白、所述乙肝表面抗原、所述質(zhì)粒pcDNA-gp96、所述質(zhì)粒pcDNA-HBs和所述質(zhì)粒pcDNA-HBc的質(zhì)量配比優(yōu)選為1 1 1 1 1 1或 1:1:1:2:2:2。
8.—種乙肝治療疫苗，它的活性成分由含有g(shù)p96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白組成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列 5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
9.一種乙肝治療疫苗，其特征在于它的活性成分由含有所述gp96蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBs、含有所述乙肝核心蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBc、含有g(shù)p96蛋白的提取物、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白組成；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。
10.如權(quán)利要求8或9所述的疫苗，其特征在于所述含有g(shù)p96蛋白的提取物是將離體動物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細(xì)胞的勻漿液依次進(jìn)行ConA-Sepharose層析和 HiTrap-Q S印harose離子交換層析得到的；所述離體動物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞IfepG2或黑色素瘤細(xì)胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0.25ml/min ；(2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0.5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；(3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0.25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7.5的PBS中力口 α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min；(b)用5mlNaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ；(c)用IOmlNaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ；(d)用3mlNaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min， 得到的洗脫液即為含有g(shù)p96蛋白的提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙肝治療性疫苗。本發(fā)明提供的疫苗的活性成分包括gp96蛋白、乙肝表面抗原和乙肝核心蛋白；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述乙肝表面抗原由序列表的序列5所示；所述乙肝核心蛋白由序列表的序列3所示。所述活性成分還可包括含有所述gp96蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-gp96、含有所述乙肝表面抗原的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HB和含有所述乙肝核心蛋白的編碼基因的質(zhì)粒pcDNA-HBc。本發(fā)明提供的乙肝治療疫苗可以有效抑制HBV復(fù)制，清除感染肝臟的病毒，對于乙肝防治具有重大價(jià)值。
文檔編號C07K1/18GK102462840SQ20101053993
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉振, 孟頌東, 李揚(yáng), 李星輝, 王賽鋒, 胡坤, 邱立鵬, 閆曉麗, 陳立釗 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所