專利名稱：一種特異性識(shí)別激活Gαo蛋白單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
G蛋白是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，G蛋白中Gd亞基的激活與否是細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)于細(xì)胞遷移和分化起著關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用。鑒于其功能，該類蛋白成為 細(xì)胞生物學(xué)和新藥發(fā)現(xiàn)即藥物篩選的一個(gè)主要研究目標(biāo)，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約有70%的藥物是通過 G蛋白途徑發(fā)揮作用的，通過對(duì)G蛋白以及相關(guān)信號(hào)通道激活的檢測是藥物篩選的主要途
徑之一。G蛋白有兩種構(gòu)象與GTP結(jié)合時(shí)的激活態(tài)和GDP結(jié)合時(shí)的鈍化態(tài)。通常情況下， 絕大多數(shù)G蛋白是與GDP結(jié)合的鈍化型。與GDP結(jié)合的G蛋白能與各種各樣的受體相互作 用，這種相互作用增加了受體與配體的結(jié)合親和力。一旦受體與配體結(jié)合，受體被激活，a 亞基就與β和Y亞基分離，同時(shí)離開受體。由于解離下來的α亞基與GDP的結(jié)合親和力 下降，GDP就能夠與游離在細(xì)胞內(nèi)的GTP發(fā)生交換，產(chǎn)生與GTP結(jié)合的激活型的G蛋白。被 激活的G蛋白就與效應(yīng)蛋白相互作用，改變了第二信使的濃度，從而發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)。如 此這般，配體與受體短短幾毫秒時(shí)間的接觸可以延長為幾十秒，乃至更長時(shí)間的反應(yīng)，使輸 入的信號(hào)可以被大大地放大。G α ο是G α家族中一種，其功能是通過激活，與效應(yīng)蛋白相互作用，抑制腺苷酸環(huán) 化酶，降低第二信使的濃度，同時(shí)還有更多的理化作用也在逐步揭示中。現(xiàn)有的所有針對(duì)Ga ο蛋白的抗體都只僅僅能監(jiān)測總的Ga ο蛋白水平，無法分辨 Ga ο蛋白的激活狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述問題而提供了一種特異性識(shí)別激活Ga ο蛋白單克隆 抗體及其制備方法，利用本發(fā)明的方法制備出的單克隆抗體可以特異性識(shí)別G α ο蛋白的 激活狀態(tài)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種特異性識(shí)別激活Ga ο蛋白單克隆抗體，是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C2010108的雜交瘤產(chǎn)生的。一種權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別激活G α ο蛋白單克隆抗體的制備方法，包括 以下步驟1)構(gòu)建表達(dá)G a O蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)G a0蛋白；2)通過GTP Y s激活G α ο蛋白；3)以此激活的G α ο蛋白作為抗原免疫可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物，完成免疫周 期；4)融合脾細(xì)胞和S/P20細(xì)胞，通過激活的抗原篩選出表達(dá)特異性識(shí)別激活G Q0蛋白單克隆抗體的融合細(xì)胞株；5)以該細(xì)胞株的細(xì)胞通過可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物生產(chǎn)，而獲得特異性識(shí)別激活 G α ο蛋白單克隆抗體。優(yōu)選地，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為小鼠、大鼠和兔子。進(jìn)一步地，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為小鼠或大鼠時(shí)，在步驟幻中以該細(xì)胞 株的細(xì)胞通過小鼠或大鼠生產(chǎn)腹水，而獲得特異性識(shí)別激活Ga ο蛋白單克隆抗體。進(jìn)一步地，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為兔子時(shí)，在步驟幻中以該細(xì)胞株的細(xì) 胞通過兔子生產(chǎn)血清，而獲得特異性識(shí)別激活G α ο蛋白單克隆抗體。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的特異性識(shí)別激活G α ο蛋白單克隆抗體，能特異性的識(shí)別激活G α ο蛋白， 對(duì)于Ga ο蛋白的激活理化變化研究可以從根本上予以揭示，對(duì)于利用Ga ο蛋白途徑進(jìn)行 細(xì)胞生物學(xué)研究和新藥篩選研發(fā)起到了關(guān)鍵的作用。
雜交瘤細(xì)胞株M10#01，于2010年10月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢大 學(xué))，保藏號(hào)為 CCTCC C2010108。


圖1為試驗(yàn)樣品的免疫印染實(shí)驗(yàn)圖譜；圖2為試驗(yàn)樣品中激活Ga ο蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利用免疫沉淀-免疫印跡結(jié)合法來證明本發(fā)明的單克隆抗體可以識(shí)別激活Ga ο 蛋白。首先需要制備試驗(yàn)樣品，樣品分為兩種，貼壁細(xì)胞樣品和懸浮細(xì)胞樣品。1.貼壁細(xì)胞樣品的制備(1)待細(xì)胞長到90%的匯合密度時(shí)，根據(jù)需要加入激活或抑制因子進(jìn)行細(xì)胞刺激。(2)吸走培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS洗滌兩次。(3)徹底吸走最后的PBS溶液，并添加預(yù)冷的IX的細(xì)胞裂解液(每100毫米的細(xì) 胞培養(yǎng)板加入0. 5毫升細(xì)胞裂解液)。(4)將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于冰上10分鐘。(5)用細(xì)胞刮片從細(xì)胞培養(yǎng)板上徹底的刮離細(xì)胞。(6)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解物到一個(gè)大小適合的管中，并放置于冰上。(7)如果發(fā)生核裂解，細(xì)胞裂解液可能會(huì)變得非常粘稠，難以用移液器吸走，這時(shí) 可以通過一個(gè)27半軌針頭吹打3次以剪切基因組DNA。(8)將細(xì)胞裂解液于4°C，12，OOOxg離心10分鐘。(9)取出上清，放置冰上，立即使用。如果不立即使用，可以快速冰凍于-70°C。2.懸浮細(xì)胞樣品的制備(1)細(xì)胞培養(yǎng)至需要密度后，根據(jù)需要加入激活或抑制因子進(jìn)行細(xì)胞刺激。(2)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過離心收集細(xì)胞。
(3)吸走培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS洗滌兩次。(4)徹底吸走最后的PBS溶液，并添加預(yù)冷的IX的細(xì)胞裂解液(每100毫米的細(xì) 胞培養(yǎng)板加入0. 5毫升細(xì)胞裂解液)。(5)用移液器反復(fù)吹打進(jìn)行細(xì)胞裂解。(6)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解物到一個(gè)大小適合的管中，并放置于冰上。(7)如果發(fā)生核裂解，細(xì)胞裂解液可能會(huì)變得非常粘稠，難以用移液器吸走。這時(shí) 可以通過一個(gè)27半軌針頭吹打4次以剪切基因組DNA。(8)將細(xì)胞裂解液于4°C，12，OOOxg離心10分鐘。(9)取出上清，放置冰上，立即使用。如果不立即使用，可以快速冰凍于-70°C。兩種試驗(yàn)樣品制備完成以后，利用免疫沉淀-免疫印跡結(jié)合法進(jìn)行試驗(yàn)，具體分 為三個(gè)部分1.激活G α ο蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(1)等分0. 5毫升的細(xì)胞裂解液(上述試驗(yàn)樣品中貼壁細(xì)胞樣品或懸浮細(xì)胞樣品 其中的一種)到微量離心管中。(2)用實(shí)驗(yàn)緩沖液調(diào)整每個(gè)樣品體積至1ml。(3)每管中加入Iul的本發(fā)明單克隆抗體。(4)通過渦旋或搖勻的方法迅速混勻proteinA/G瓊脂糖微珠。(5)快速添加20ul的懸浮微珠至每個(gè)樣品管中。(6)在4°C孵育1小時(shí)，并輕微攪拌。(7)在5000xg離心1分鐘沉淀微珠。(8)吸走并丟棄上清，確保不吸走微珠。(9)用0. 5ml實(shí)驗(yàn)緩沖液洗滌微珠3次，每次都通過離心去除上清。(10)在最后一次洗滌后，離心后，小心的吸走全部上清。(11)加入20ul樣品緩沖液(SDS-PAGE)到20ul微珠中。(12)將樣品煮5分鐘。(13)在 5，OOOx g 離心 10 秒。2. SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜(1)將離心后的20ul上清全部點(diǎn)入8%的聚丙烯酰胺膠中，最好同時(shí)點(diǎn)一個(gè)預(yù)染 的蛋白質(zhì)Marker (用于檢測轉(zhuǎn)膜是否成功)。(2)按照廠家說明書進(jìn)行SDS-PAGE。(3)按照廠家的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)從凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜或者硝酸纖維 素膜上。3.免疫印跡進(jìn)行檢測(以下所有步驟均在室溫下進(jìn)行)(1)繼電泳之后，將PVDF膜浸沒于100%的甲醇中15秒，然后讓其于室溫干燥5 分鐘。(注意，如果使用的是硝酸纖維素膜，這一步可以跳過。)(2)采用含5%脫脂奶粉或者3% BSA的TBST于室溫下封閉膜1小時(shí)，并輕輕攪 拌。然后將膜于任意一個(gè)抗Ga ο蛋白的單抗或者多抗進(jìn)行孵育室溫1-2小時(shí)或者4°C過 夜，并伴有輕輕攪拌，抗體的配制仍然采用含5%脫脂奶粉或者3% BSA的TBST。(3)用TBST洗膜3次，每次5分鐘。
(4)將膜與2抗進(jìn)行孵育(如果2使用的是鼠單抗，2抗可以是羊抗鼠的HRP標(biāo)記 抗體，如果使用的是兔多抗，2抗可以是羊抗兔的HRP標(biāo)記抗體)，室溫1小時(shí)并伴有輕輕攪 拌。2抗的配制仍然采用含5%脫脂奶粉或者3% BSA的TBST。(5)用TBST洗膜3次，每次5分鐘。通過以上步驟，可以獲得以下結(jié)果，參照?qǐng)D1。從圖1中可以看出，第1泳道為Ga ο 蛋白，通過LPA處理(3泳道)和沒有處理O泳道)的MEF細(xì)胞。細(xì)胞裂解液與激活Ga ο 構(gòu)型特異性單抗進(jìn)行孵育，通過proteinA/G沉淀下來的活性6(10蛋白經(jīng)過303^^^^，轉(zhuǎn)膜 后，再用另外一個(gè)抗Ga ο的單抗或者多抗進(jìn)行檢測。從而得出的結(jié)論是本發(fā)明單克隆抗體 可以識(shí)別激活Ga ο蛋白。實(shí)施例2采用ELISA方法定量檢測出試驗(yàn)樣品中激活G α ο蛋白的含量。(1)以0. IM NaC03 PH9. 6包被液稀釋激活本發(fā)明單克隆抗體，以每孔200ng包被 ELISA板，放置室溫2小時(shí)或4度過夜。(2)倒出孔內(nèi)溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗滌，3次，每次5分鐘。(3)用稀釋液將激活600蛋白 500叫/1111 5 倍比稀釋 500、100、20、4、0. 8、0. 16ng/ ml作為標(biāo)準(zhǔn)。(4)同時(shí)準(zhǔn)備試驗(yàn)樣品，細(xì)胞或組織處理液上清。(5)每孔加入以上處理的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品50ul及兔抗G α ο蛋白抗體，放置室溫2小 時(shí)。(6)倒出孔內(nèi)溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗滌，3次，每次5分鐘。(7)用稀釋液將酶標(biāo)二抗稀釋成1 50000，IOOul/孔，放置室溫1小時(shí)。(8)倒出孔內(nèi)溶液，拍干，每孔加入200ulPBST洗滌，3次，每次5分鐘。(9)顯色，并讀取數(shù)據(jù)，其具體數(shù)值見表1。(10)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取試驗(yàn)樣品中激活Ga ο的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參 照?qǐng)D2。表1試驗(yàn)樣品的激活G α ο數(shù)值
權(quán)利要求
1.一種特異性識(shí)別激活Gd ο蛋白單克隆抗體，其特征在于，是由中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC C2010108的雜交瘤產(chǎn)生的。
2.—種權(quán)利要求1所述的特異性識(shí)別激活Ga ο蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟1)構(gòu)建表達(dá)Gaο蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)Ga ο蛋白；2)通過GTPγ s激活Ga ο蛋白；3)以此激活的Gao蛋白作為抗原免疫可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物，完成免疫周期；4)融合脾細(xì)胞和S/P20細(xì)胞，通過激活的抗原篩選出表達(dá)特異性識(shí)別激活Gaο蛋白 單克隆抗體的融合細(xì)胞株；5)以該細(xì)胞株的細(xì)胞通過可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物生產(chǎn)，而獲得特異性識(shí)別激活Gα ο 蛋白單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性識(shí)別激活Gaο蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在 于，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為小鼠、大鼠和兔子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3任意一項(xiàng)所述的特異性識(shí)別激活Gα ο蛋白單克隆抗體的制備 方法，其特征在于，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為小鼠或大鼠時(shí)，在步驟5)中以該細(xì)胞株 的細(xì)胞通過小鼠或大鼠生產(chǎn)腹水，而獲得特異性識(shí)別激活Ga ο蛋白單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3任意一項(xiàng)所述的特異性識(shí)別激活Gα ο蛋白單克隆抗體的制備 方法，其特征在于，所述可產(chǎn)生單克隆抗體的動(dòng)物為兔子時(shí)，在步驟5)中以該細(xì)胞株的細(xì)胞 通過兔子生產(chǎn)血清，而獲得特異性識(shí)別激活G α ο蛋白單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性識(shí)別激活Gαo蛋白單克隆抗體及其制備方法，屬于生物科學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域。該特異性識(shí)別激活Gαo蛋白單克隆抗體是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號(hào)為CCTCC NO:C2010108的雜交瘤產(chǎn)生的。利用本發(fā)明的方法制備出的單克隆抗體可以特異性識(shí)別Gαo蛋白的激活狀態(tài)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102060926SQ20101055974
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司